ISOLASI BAHAN ALAM LAUT

Organisme laut memberikan sejumlah senyawa kimia beragam yang telah evolusioner
Terpilih untuk memodulasi jalur biokimia. Banyak kelompok-kelompok industri dan akademis
mengakses sumber ini menggunakan platform teknologi canggih. Tujuan dari bab ini adalah
untuk memberikan beberapa petunjuk praktis dalam proses ekstraksi dan isolasi bahan alam
laut. Perhatian khusus diberikan kepada prosedur isolasi yang disesuaikan dengan karakteristik
fisika dan kimia dari senyawa-senyawa yang terisolasi. Kemajuan terbaru dalam teknologi
isolasi, termasuk otomatisasi dan integrasi langsung menjelaskan pemikiran yang tinggi tentang
sistem skrining.
Kata kunci : Produk alami laut; Koleksi invertebrata laut; ekstraksi; fraksinasi;
pemurnian; isolasi; Kromatografi; fraksinasi otomatis; HPLC-SPE coupling.
I.

Pendahuluan
Organisme laut telah berevolusi mendiami suatu daerah baru berbagai relung
ekologi. Untuk mengatasi berbagai habitat, mereka telah mengembangkan beragam jalur
metabolit

sekunder

yang

menghasilkan

sejumlah

besar

gugus

kimia

untuk

mengakomodasi gaya hidup mereka. Senyawa ini mencakup berbagai macam kelas
kimia, termasuk terpen, shikimat, polyketida, asetoginins, peptida, alkaloid, dan banyak
struktur tidak teridentifikasi dan tidak terkarakterisasi. Dalam sepuluh tahun terakhir
saja, lebih dari 5000 struktur produk alami laut telah diterbitkan . Banyak dari senyawa
ini telah membuktikan potensi mereka dalam beberapa bidang, terutama sebagai agen
terapeutik yang potensial untuk berbagai penyakit. Sepuluh tahun yang lalu, hampir
semua pemurnian produk alami merupakan suatu usaha yang sangat besar. Sebagai akibat
dari kemajuan teknologi, proses ini telah hampir menjadi rutin. Selain itu, kecenderungan
pemisahan yang lebih cepat dan otomatis telah menghasilkan minat secara meluas,
terutama dalam bidang industri farmasi.
Beberapa ulasan (11 14) telah membahas teknik-teknik yang terlibat dalam
isolasi bahan alam laut. Bab ini disusun untuk menyoroti tantangan yang ditemui dalam
proses isolasi, dan teknologi yang paling terbaru serta strategi yang diaplikasikan baik
pada timbangan laboratorium dan industrial. Namun, rincian lebih lanjut tentang teori

dasar kromatografi dan aplikasi yang dapat ditemukan di Bab 4-9. Bagian terakhir dalam
bab ini ditujukan untuk mendiskusikan mengenai fraksinasi otomatis dan integrasi
langsung ke dalam sistem penyaringan (HTS) tinggi-throughput. Catatan dengan
informasi yang lebih spesifik tentang topik-topik tertentu disediakan untuk bantuan lebih
lanjut apabila pembaca tertarik.
I.1. Tantangan dalam isolasi produk alami laut
Beberapa faktor yang dapat menyulitkan isolasi bahan alam laut telah
didiskusikan secara rinci dalam review isolasi bahan alam laut oleh Amy Wright
(14). Kami menekankan kembali beberapa faktor selain orang lain yang mungkin
menambah tantangan tambahan untuk proses pemisahan.
I.1.1. Ketidakpastian taksonomi informasi dapat memfasilitasi pencarian Literature
Dilaporkan hasil oleh spesies di bawah penyelidikan dan tentu saja metode
pemurnian senyawa. Hal ini memiliki beberapa dampak pada pemilihan skema
pemurnian terbaik bagi metabolit baru. Identifikasi taksonomi kelautan organisme
menantang, dan tugas-tugas taksonomi yang benar atau tidak lengkap dapat
menyebabkan kesulitan jika asumsi yang dibuat hampir mungkin mengandung
suatu organisme kimia. Penggunaan kemotaksonomi untuk memprediksi jenis
senyawa pada organisme mungkin tidak selalu sukses.
I.1.2. Kuantitas kecil Metabolit
Kehadiran metabolit dapat mempersulit proses ekstraksi dan isolasi.
Menurut Houssen dan Jaspars, sebagian besar dari 354 organisme diperlukan
untuk isolasi metabolit aktif pada tingkat yang dapat memudahkan penjelasan
struktur berikutnya (lihat Bab. 17).
Salah satu contoh adalah hanya 10,7 mg isolasi macrolide spongistatin 4
sangat ampuh sebagai antitumor (Gbr. 1) dari sekitar 2,5 ton spons laut
Spirastrella spinispirulifera dari Afrika Selatan. Uji untuk mengurangi biomassa
spons. Satu titik dalam usaha ini, perlu digunakan kolom kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC) yang panjangnya hampir 3 m dan berdiameter 15 cm. Contoh lain

adalah isolasi 1 mg peptida dolastatin 10 sangat penting sebagai antitumor (Gbr.

2). Hampir 2 ton kelinci laut Dolabella auricularia dikumpulkan dari Pulau
Mauritius di Samudra Hindia. Langkah koleksi yang diperlukan lebih dari 10
tahun. Cara termudah untuk isolasi terlibat sekitar 20.000 pecahan dan 23 terpisah
langkah kromatografi menggunakan berbagai teknik. Selanjutnya, itu menjadi
jelas bahwa peptida dolastatin 10 mungkin diproduksi oleh cyanobacterium yang
tumbuh di Dolabella auricularia.
I.1.3. Ketidakstabilan metabolit
Ekstrak laut mungkin mengandung senyawa yang sangat labil.
Dekomposisi dari senyawa ini dapat terjadi pada setiap langkah selama proses
pemurnian. Panas, cahaya, udara, dan pH adalah faktor-faktor lain yang dapat
menyebabkan degradasi senyawa. Bahan yang digunakan untuk pemisahan juga
dapat mengaktifkan beberapa reaksi. Alumina dapat mengkatalisasi kondensasi
aldol, penataan ulang, reaksi hidrasi dan dehidrasi, sementara silika dapat
meningkatkan oksidasi, penataan ulang N dan O demethylation. Beberapa lainnya
seperti aseton, metanol (MeOH), etilena glikol, dan dimethylformamide (DMF)
dapat menimbulkan hasil adisi. Sifat asam beberapa pelarut NMR (misalnya,
CDCl3) dapat menyebabkan degradasi yang sangat sensitif terhadap pH senyawa.
I.1.4. Pemurnian senyawa yang larut air : pengaruh air tinggi dan kandungan garam
Ada banyak kesulitan yang terkait dengan isolasi dan pemurnian senyawasenyawa yang larut dalam air . Karena senyawa target sangat polar, media air atau
pelarut sangat polar seperti MeOH harus digunakan untuk ekstraksi. Dalam kasus
larutan, masalah yang pasti terjadi adalah pertumbuhan bakteri dan jamur, yang
sering mendegradasi komponen aktif atau memberikan hasil palsu dalam uji
hayati karena endotoksin yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Konsentrasi
larutan ekstrak juga merupakan masalah karena suhu tinggi pada saat penguapan
air. Selain itu, ekstrak cair sering mengandung agen surface-active. Surfaktan ini
dapat menyebabkan berbusa dan membentur selama proses konsentrasi.
Kelimpahan garam yang dibawa dari air laut ke ekstrak cair membuat proses

isolasi lebih sulit. Dalam kebanyakan kasus, ekstraksi dan fraksinasi senyawasenyawa yang larut dalam air memerlukan penggunaan penyangga. Struktur
dolastatin 10, menurut Houssen dan Jaspars. Namun, pemisahan penyangga
garam dari senyawa bukanlah tugas yang mudah.
I.1.5. Senyawa yang kekurangan gugus kromofor
Deteksi Ultraviolet (UV) adalah teknik deteksi untuk analisis HPLC
produk alami karena kemudahan penggunaan dan sensitivitasnya yang tinggi.
Namun, satu kekurangan detektor UV adalah ketidakmampuan untuk mendeteksi
senyawa yang kurang gugus kromofor. Selain itu, beberapa pelarut yang
digunakan dalam kromatografi fase normal itu sendiri kuat dari cahaya UV, yang
berarti bahwa pengaturan panjang gelombang detektor tidak mungkin rendah
(Lihat tabel 5 untuk nilai-nilai cutoff UV pelarut yang berbeda).
Detektor indeks bias (RI), sampai saat ini, hanya tersedia alternatif untuk
deteksi UV. Namun, detektor RI jauh lebih sensitif dan terbatas elusi isokratik.
Elusi gradient

melibatkan

pencampuran pelarut RI yang berbeda, sehingga

menimbulkan garis besar yang melintas. Kelemahan ini membuat deteksi sangat
sulit pada konsentrasi rendah dari metabolit non kromofor.
I.1.6. Biaya dan waktu efektifitas
Sampai saat ini, pemurnian produk alami laut memakan waktu, dan biaya
yang mahal. Perkembangan terakhir di HTS telah menciptakan hambatan baru
untuk penemuan obat dari alam. Sebuah asupan dengan sejumlah besar struktural
menarik sampel dengan konsentrasi cukup adalah suatu keharusan untuk
mengoperasikan sistem HTS secara optimal. Integrasi pustaka produk alami laut
ke sistem HTS tidak begitu lama dan sama sekali tidak layak.
II.

Kromatografi
Bagian ini memberikan gambaran singkat mengenai teknik kromatografi berbeda
yang umumnya diterapkan dalam isolasi bahan alam laut. Gambaran singkat tentang

sifat-sifat pelarut yang paling umum digunakan dan fase stationer juga disertakan.
Pemisahan tergantung pada afinitas komponen terhadap fase diam dan fase gerak.
Menurut sifat fase gerak, kromatografi dapat diklasifikasikan menjadi
kromatografi gas (GC), kromatografi cair (LC) dan cairan kromatografi superkritis
(SFC). GC dan SFC adalah teknik analisis yang digunakan secara luas tetapi tidak dapat
digunakan untuk persediaan isolasi bahan alam, dan tidak dibahas dalam bab ini. Namun
LC, secara luas digunakan dan terdiri dalam berbagai bentuk.
a. Klasifikasi LC
LC dapat diklasifikasikan dalam beberapa cara (21):
1. Klasifikasi menurut modus operasi.
Kromatografi dapat dilakukan dalam empat bentuk utama: countercurrent
kromatografi (CCC), kromatografi lapis tipis (TLC), ekstraksi fase solid (SPE)
dan Kromatografi kolom (Lihat 2.3 subpos., untuk rincian).
2. Berdasarkan metode pemisahan (Gbr. 3) ada lima mekanisme pemisahan yang
dapat terjadi dan mungkin lebih dari satu bertanggung jawab selama pemisahan
tertentu. Mode pemisahan ini yang akan dibahas.
II.1.1. Adsorpsi
Kromatografi adsorpsi berdasarkan kemampuan molekul zat terlarut
secara fisik berinteraksi dengan fase diam (lihat juga Bab. 5). Suatu sifat interaksi
dapatdilihat dari ikatan hidrogen, van der Waals, atau dipol-dipol. Semakin kuat
interaksi, semakin lama zat terlarut akan dipertahankan pada fase diam.

Pilihan fase diam yang tidak tepat dapat menyebabkan adsorpsi ireversibel
zat terlarut ke kemasan material, atau setidaknya pemulihan yang sangat buruk.
Selain itu, molekul fase gerak bersaing dengan molekul zat terlarut untuk situs
adsorpsi. Semakin fase gerak berinteraksi dengan adsorben, semakin cepat zat
terlarut akan dielusi. Karena zat terlarut harus berinteraksi dengan fase stasioner
yang akan terserap, semakin besar luas permukaan yang ditawarkan oleh fase
stasioner, semakin besar jumlah kemungkinan terjadinya interaksi. Dengan
demikian, adsorben yang menawarkan rasio tinggi luas permukaan untuk kemasan
Volume menimbulkan pemisahan yang lebih baik. Luas permukaan adalah fungsi
dari ukuran partikel, ukuran pori, dan tingkat porositas. Semakin kecil ukuran
partikel adsorben, semakin tinggi luas permukaan yang akan tersedia. Partikel
yang ukurannya sangat kecil umumnya hanya disediakan untuk HPLC, karena
mereka menimbulkan substansial tekanan balik ketika dilewatkan melalui fase
gerak.

Porositas partikel mencerminkan rasio volume pori-pori permukaan untuk

total volume partikel. Senyawa lebih besar dari ukuran pori tidak akan mengikat
efisien karena mereka tidak akan dapat menembus pori-pori. Untungnya, ukuran
pori dapat sangat bervariasi dari kira-kira 50nm untuk ukuran makroskopis.
Tabel 1 berisi informasi terperinci mengenai absorben yang paling umum
digunakan.
II.1.2. Partisi
Kromatografi partisi didasarkan pada kemampuan zat terlarut untuk
mendistribusikan antara dua fase cair. Paling umum, fase diam yang cair secara
kimia terikat pada pendukung inert, misalnya, gel silika berpori untuk
memberikan fase berikat. Hal ini melibatkan pembentukan obligasi hidrolitikal
yang stabil, antara kelompok silanol permukaan dukungan silika dan chlorosilane.
Silan biasanya membawa sebuah gugus fungsional organik dan ini berada di
Akibatnya, fase diam cair (21).
Besar ligan organo-silan tidak bisa bereaksi dengan semua kelompok
silanol yang tersedia karena halangan sterik. Kelompok silanol yang tidak
bereaksi dapat mengganggu proses pemisahan dan menghasilkan efek yang tidak
diinginkan seperti reaksi, adsorpsi, tailling, dan sebagainya. Untuk meminimalkan
interaksi sekunder, fase terikat biasanya mengalami reaksi endcapping dimana
sisa silanols yang termetilasi, biasanya dengan kelompok trimetilsilil (TMS). Oleh
karena itu, ukuran pori dari gel silika dan jumlah fasa cair atau kelompok
fungsional terikat pada silika dan tingkat endcapping antar faktor yang harus
dipertimbangkan dalam pemilihan tahap berikatan yang tepat. Beberapa dari sifatsifat umum digunakan fase terikat dirangkum dalam

Tabel 1
Fase stasioner yang umumnya digunakan di Kromatografi Adsorpsi

Adsorban
Silica

Catatan
Fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak).
Senyawa polar dipertahankan sementara yang
nonpolar tidak.
Pelarut polar memiliki kekuatan elusi yang
lebih baik.
Tidak bisa digunakan dengan pelarut air
dengan air menonaktifkan permukaan.
Larut pada nilai pH lebih tinggi dari 7,0.
Beberapa reaktif terhadap produk alami yang
tidak stabil di atasnya.

Alumina

Fase normal.
Bentuk asam, basa, dan netral yang tersedia
digunakan dalam pemisahan asam, basa, dan
senyawa yang relatif nonpolar, masing-masing.
Cukup reaktif.

Styrenedivinyl
benzene polymer

Fase terbalik (fase diam kurang polar

dibandingkan fase gerak).
Stabil pada pH rendah dan tinggi.
Kurang reaktif (masalah karena terkena silanol
kelompok dihindari).
Memiliki kapasitas yang lebih tinggi untuk
senyawa polar daripada C18 karena persentase
karbon yang lebih tinggi.
Memberikan resolusi lebih rendah dari C18
karena ukuran manik yang lebih besar.

Idealnya digunakan untuk desalting dan

adsorpsi-elusi produk alami dari ekstrak air.
Lebih ekonomis daripada C18.
Brominasi membuat polimer lebih kuat.
Fase stasioner Umumnya Digunakan di
Adsorpsi Kromatografi
Fase Berikat Umum Digunakan di Isolasi
Bahan Alam Laut
Fase terbalik (pelarut umum adalah air, MeOH,
asetonitril, dan THF).
Yang paling kuat untuk senyawa nonpolar
(hidrofobik).
Senyawa yang dielusi dalam rangka
peningkatan hidrofobik (air adalah eluen
terlemah).
Beberapa produsen menawarkan ODS yang
dapat mentolerir up untuk pH 10.0

Namun, cairan juga dapat bertindak sebagai fase diam bahkan ketika itu tidak
terikat dukungan, seperti dalam kasus CCC (lihat Bab. 7).

II.1.2.1. REAGENTS ION-PAIRING DAN PENGARUH PH

Senyawa ion yang sangat mudah larut dalam air juga dapat dipisahkan
dengan menggunakan fasa diam yang nonpolar, misalnya, oktadesil silika. Hal ini
dapat dicapai dengan mengubah pH fase gerak untuk menekan ionisasi senyawa
sehingga mereka dapat dipertahankan sebagai spesies netral pada permukaan

hidrofobik dari fase diam. Cara alternatif adalah dengan menambahkan reagen
pasangan-ion sesuai dengan fase gerak. Reagen pasangan-ion adalah senyawa
biasanya ionik yang mengandung rantai hidrokarbon hidrofobik. Mereka dapat
bertindak baik dengan berinteraksi dengan sampel, membentuk sepasang ion
netral reversibel yang dapat dipertahankan pada fase stasioner, atau berinteraksi
dengan fase diam melalui bagian hidrofobik, membentuk fase diam dengan
kelompok-kelompok yang dibebankan pada senyawa ion yang dapat mengikat
secara reversibel (21). Asam trifluoroasetat (TFA), pentafluoropropionic acid
(PFPA), dan asam Heptafluorobutyric (HBA) adalah contoh dari reagen anion
pasangan-ion sementara trietilamina (TEA) adalah salah satu contoh dari kationik.
Keuntungan tambahan dari TFA dan TEA termasuk volatilitas tinggi
(memungkinkan untuk penghapusan cepat) dan kompatibilitas dengan analisis
spektrometri massa (22) (lihat Catatan 2).
Tabel 2
Fase Berikat Umum Digunakan di Isolasi Bahan Alam Laut
Fase stasioner
C18 (Octadecyl)a

Catatan
Fase terbalik (pelarut umum adalah air,
MeOH, asetonitril, dan THF).
Yang paling kuat untuk senyawa nonpolar
(hidrofobik).
Senyawa yang dielusi dalam rangka
peningkatan hidrofobik (air adalah eluen
terlemah).
Beberapa produsen menawarkan ODS yang
dapat mentolerir up untuk pH 10.0

C8 (Octyl)a

Fase terbalik.
Selektivitas Mirip dengan C18 tapi kurang
kuat.

Ph (Phenyl-hexyl)

Fase terbalik.

Senyawa aromatik dipertahankan lagi.

CN Cyanopropyl

Bisa digunakan dalam mode normal dan

fase terbalik.
Sedikit polar.
Selektivitas yang unik untuk polar
senyawa.

II.1.3. Pertukaran ion

Kromatografi penukar ion (IEC) berlaku untuk pemisahan spesies atau
komponen ion yang terionisasi pada pH tertentu (lihat Bab. 6). Hal ini umumnya
digunakan dalam pemurnian peptida karena hampir semua makromolekul
membawa muatan permukaan yang memungkinkan untuk adsorpsi mereka ke
dukungan yang solid. Keuntungan dari teknik ini adalah kenyataan biologi
Kegiatan hampir selalu dipertahankan karena komposisi fase gerak biasanya
berair (22). Di sisi lain, penggunaan teknik ini sering memperkenalkan sejumlah
besar garam penyangga anorganik dan dengan demikian memerlukan langkah
desalting berikutnya. Fase diam terdiri dari partikel tidak larut dalam air bantalan
kovalen terikat muatan positif atau negatif kelompok fungsional. ion lawan bebas
dari muatan yang berlawanan terkait dengan kelompok-kelompok fungsional ini.
Spesies ion dalam sampel dapat bertukar dengan ion lawan ini dan mengikat ke
fase stasioner. Pemisahan dicapai karena perbedaan dalam afinitas komponen
ionik terhadap fase diam. untuk lebih rinci tentang mekanisme proses pertukaran
ion, pembaca harus berkonsultasi dengan ulasan yang sangat otoritatif yang ditulis
oleh Claude Dufresne.
II.1.3.1. Dukungan matriks
Dukungan matriks yang membentuk partikel fase stasioner resin
polystyrene, polimer karbohidrat, atau gel silika. Sifat dukungan matriks memiliki

dampak pada karakteristik aliran kolom ini, porositas dari stasioner fase partikel,
dan ketahanan terhadap tekanan mekanik. Namun, batas pengecualian (ukuran
pori) yang diberikan oleh produsen perlu dicatat, karena molekul lebih besar dari
batas-batas ini akan tidak mengikat efisien untuk fase diam karena pori mereka
yang terbatas aksesibilitas. Tabel 3 meringkas sifat fisikokimia dari yang paling
umum matriks dukungan IEC.
II.1.3.2. Kelompok fungsional
Kelompok fungsional yang melekat pada dukungan matriks bisa positif
atau bermuatan negatif untuk memberikan anion- atau kation-tukar kromatografi,
masing-masing. Jumlah kelompok fungsional ini persatuan volume dari matriks
menentukan kapasitas kolom. PKa nilai fungsional kelompok menentukan
kekuatan exchanger. Dalam kromatografi pertukaran anion, ionisasi penuh terjadi
pada nilai pH 2,0 unit di bawah pKa sementara netralisasi penuh terjadi pada nilai
pH 2,0 unit di atas pKa.

Tabel 3
Matriks dukungan di IEC
Matriks
Styrene-divinil benzena polimer

Catatan
Permukaan hidrofobik.
Kaku, menawarkan kekuatan mekanik yang
sangat baik.
Dapat mentolerir kisaran pH 1,0-14,0.
Dapat berinteraksi dengan (teradsorpsi) zat
terlarut yang mengarah ke
pemulihan yang buruk. Ini disebut
'' Interaksi backbone ''.

polimer karbohidrat

Contohnya adalah silang dekstran dan

agarosa silang.

Membengkak mudah dalam air

menghasilkan gel yang
memiliki sifat aliran yang sangat baik.
Tidak menunjukkan interaksi backbone.
Hidrofilik, tidak menyebabkan denaturasi
protein.
silika gel

Tidak membengkak dalam air.

Menawarkan ukuran-cocok partikel yang
sangat kecil untuk HPLC.
Tidak stabil pada pH di atas 7,5.

Sebaliknya adalah benar untuk kromatografi kation-tukar. Nilai pKa untuk

berbagai kelompok fungsional digunakan dalam IEC ditunjukkan pada Tabel 4.
Hal ini dapat terlihat bahwa penukar kuat dibebankan selama rentang pH penuh,
sementara penukar yang lemah hanya dikenakan biaya pada rentang pH yang
terbatas. Nilai PKaanalit harus dipertimbangkan juga. Asam organik yang negatif
dibebankan pada saat pH larutan berada di atas asam ini pKa, dan amina
bermuatan positif pada pH di bawah nilai dasar pKa ini. Namun, pH fase gerak
harus memfasilitasi ionisasi kedua sorben kelompok fungsional dan analit. Perlu
dicatat bahwa penukar ion lemah harus digunakan untuk menangkap spesies ion
yang kuat (misalnya, asam sulfonat dan amina kuaterner).
Tabel 4
Kelompok Fungsional dalam IEC
Kelompok fungsi

Catatan

Asam sulfonat (-SO3H)

Kuat kationik-pKa <1

Asam karboksilat (-CO2H)

Amina Kuarter (-NR3)

Lemah kationik-pKa FFI 4-5

Kuat anionik-pKa> 13

Lemah anionik-pKa FFI 8

Amina tersier (-NR2)

Hal ini karena pemulihan analit tersebut sering rendah pada ion kuat
exchanger karena ketidakmampuan untuk menetralkan amina kuaterner atau
gugus asam sulfonat baik pada sorben atau analit. Di sisi lain tangan, analit yang
mengandung amina lemah atau gugus asam karboksilat dapat diekstraksi dengan
baik penukar ion lemah atau kuat, seperti pengaturan pH dapat digunakan untuk
menetralkan muatan pada analit untuk membawa elusi (24). Namun, penukar ion
lemah umumnya lebih disukai di alam kerja produk, elusi dapat dicapai melalui
ringan, tak rusak kondisi.
II.1.3.3.Ion lawan dan kekuatan ion
Ion lawan dalam matriks dan fase gerak menyaingi sampel ion untuk situs
mengikat dikenakan di permukaan sorben. Oleh karena itu, kehadiran ion lawan
yang memiliki afinitas yang lebih besar untuk sorben dari analit atau adanya
konsentrasi tinggi (kekuatan ionik) dari hampir ion lawan pun bisa menghalangi
pengikatan analit ke fase stasioner (24). Anion dapat peringkat menurut afinitas
mereka untuk pertukaran anion matriks sebagai berikut :
hidroksida <fluoride <asetat <bikarbonat; format <klorida <Fosfat; garam sitrat
Dengan cara yang sama, kation dapat peringkat dalam hal afinitas mereka
untuk penukar kation sebagai berikut :
lithium <hidrogen <natrium <amonium <kalium <magnesium <kalsium
Sebagai aturan umum, retensi analit difasilitasi oleh sampel yang terdapat
dalam buffer kekuatan ion rendah yang terdiri dari afinitas rendah atau ion lawan
displacer lemah pada pH yang tepat. Elusi dipromosikan oleh garam kekuatan ion
tinggi dan buffer yang mengandung ion lawan displacer kuat dan / atau dengan

mengubah pH untuk sepenuhnya menetralisir kelompok dibebankan di kedua

sorben atau analit.
II.1.3.4. Pertukaran ion
Dalam kebanyakan penukar ion, kelompok fungsional tetap langsung pada
permukaan matriks. Hanya sejumlah kelompok ionik dapat melekat karena
permukaan dari bagian matriks terbatas. Dengan tentakel 364 Houssen dan
Jaspars ion exchanger, namun, kelompok penukar kovalen berlabuh ke matriks
melalui rantai polimer linier. Oleh karena itu, kapasitas tukar dapat meningkat
secara signifikan. Keuntungan lain adalah bahwa penukar ion tentakel tidak
menunjukkan interaksi backbone sebagai matriks stasioner tahap tersembunyi.
Oleh karena itu, penukar ion tentakel jauh lebih cocok untuk pemisahan molekul
protein besar dimana risiko denaturasi dan hilangnya aktivitas biologis yang
signifikan.
II.1.4. Ukuran Pengecualian
Kromatografi ukuran eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai filtrasi gel atau
gel permeasi kromatografi, memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukuran
molekul mereka (lihat Bab. 5). Fase diam terdiri dari partikel berpori dimana
ukuran pori secara ketat dikontrol. Fase gerak mengalir di atas dan melalui
partikel-partikel ini, ia membawa bersama dengan zat terlarutnya, tergantung pada
ukuran dan bentuk mereka, dapat mengalir ke dalam dan keluar dari pori-pori.
Molekul lebih besar dari ukuran pori tidak bisa masuk ke pori-pori dan elusi
bersama-sama sebagai puncak pertama dalam kromatogram, fenomena yang
disebut Pengecualian total. Molekul yang lebih kecil yang bisa masuk ke poripori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel yang tergantung pada
ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda, karena itu, memiliki jumlah
angkutan yang berbeda kali melalui kolom. Bagian dari kromatogram disebut
wilayah permeasi selektif. Molekul-molekul terkecil dapat menembus pori-pori
terkecil sehingga memiliki waktu tinggal terpanjang pada kolom dan mengelusi
bersama sebagai puncak terakhir dalam kromatogram. Puncak terakhir ini

menentukan batas permeasi keseluruhan. SEC adalah teknik yang banyak

digunakan untuk pemisahan peptida dan protein karena kondisi elusi keras tidak
diperlukan. Selain itu dapat digunakan dengan sukses untuk desalting. Yang
paling umum digunakan sorbents ukuran-pengecualian adalah gel polydextran,
mis, Sephadex diproduksi oleh Pharmacia. Gel ini tersedia secara komersial
dalam bentuk manik-manik, yang harus tenggelam dalam fase gerak untuk
beberapa jam sebelum digunakan untuk memungkinkan pengembangan
berlangsung. Sephadex diproduksi oleh ikatan silang dari dekstran dengan
epiklorohidrin dan tersedia dalam berbagai kelas dengan ukuran pori yang
berbeda (lihat Bab. 5). Sephadex G gel hidrofilik dan penggunaannya terbatas
pada solusi berair. Dengan demikian, mereka ideal untuk fraksionasi campuran
yang larut dalam air. Meskipun modus utama mereka pemisahan adalah filtrasi
gel, adsorpsi tambahan mekanisme mungkin ada, sehingga menimbulkan resolusi
yang baik. Sephadex LH-20 adalah hydroxypropylated G-25. Pengenalan
kelompok hidroksipropil tidak mengubah

jumlah gugus hidroksil tapi

meningkatkan rasio karbon untuk hidroksil. Resultan gel yang dimiliki, oleh
karena itu, baik hidrofilik dan lipofilik properti. Lipofilisitas tambahannya
memungkinkan gel ini untuk digunakan dengan pelarut berair. Sephadex LH-20
umumnya digunakan untuk fraksinasi produk alami organik larut. Ketika pelarut
tunggal digunakan, pemisahan terutama terjadi dengan filtrasi gel modus. Ketika
campuran pelarut yang digunakan, gel akan mengambil sebagian besar komponen
polar dari campuran pelarut. Hal ini menghasilkan dua sistem fase yaitu fase diam
dan gerak dengan komposisi yang berbeda. Pemisahan kemudian terjadi
berdasarkan partisi dan ukuran eksklusi. Fraksinasi terbaik biasanya diperoleh
ketika campuran pelarut polar dan nonpolar yang digunakan. Selain itu, harus
dipertimbangkan bahwa fenolik, heteroatomic, dan siklik Senyawa istimewa gel
Sephadex tertahan terutama ketika alkohol rendah digunakan sebagai pelarut
elusi. Senyawa ini biasanya tinggal lagi pada gel dari yang diharapkan
berdasarkan ukuran mereka. Sephadex gel cukup inert, sehingga pemulihan
sampel biasanya sangat baik. Mereka stabil di semua pelarut, yang tidak asam
kuat (misalnya, di bawah pH 2.0), dan tidak mengandung zat pengoksidasi kuat.

Di sisi lain, gel ini rentan terhadap serangan jamur dan bakteri. kelemahan lainnya
termasuk waktu elusi yang lama dan resolusi relatif rendah. Operasional itu
diperpanjang terutama karena kebutuhan untuk panjang kolom sempit dan laju
aliran lambat untuk efek resolusi yang memadai. Sorbents lain untuk eksklusi
ukuran telah dikembangkan menggunakan jenis matriks yang berbeda, misalnya,
stirena-divinil benzena polimer dan gel silika. Kedua matriks menawarkan
kekuatan mekanik yang baik dan dapat digunakan dalam HPLC modus. Silica gel
yang digunakan di SEC benar-benar endcapped untuk meminimalkan interaksi
spesifik. Hal ini stabil pada pH berkisar 2,0-7,5. Bagaimanapun Styrene-divinil
benzena polimer, menawarkan rentang pH yang lebih luas yang stabil tetapi
menunjukkan efisiensi yang lebih rendah daripada silika. SEC memiliki kapasitas
muat yang rendah dalam hal massa sampel dan volume sampel. Sampel harus
terkonsentrasi tetapi tidak melampaui titik curah hujan untuk kinerja optimal.
II.1.5. Afinitas biologi
Kromatografi afinitas jauh lebih spesifik daripada teknik pemurnian
lainnya. Hal ini tergantung pada persiapan bunga matriks yang kompleks, dan
sebaiknya hanya senyawa ini, akan mengikat secara reversible. Matriks itu
biasanya berupa manik-manik agarosa (Sepharose atau BioGel A), poliakrilamida
(misalnya, BioGel P), dekstran silang (misalnya, Sephacryl), atau silica gel yang
ligan biospecific (antibodi, enzim, atau protein reseptor) telah kovalen. Ligan
amobil berinteraksi hanya dengan molekul yang selektif dapat mengikat. Senyawa
lain dalam sampel, tidak mampu mengikat biospecific, yang larut. Senyawa
ditahan bisa pulih dengan mengubah pH dan / atau komposisi penyangga untuk
mengganggu interaksi ligan-solut. Sebuah teknik elusi alternatif melibatkan
penambahan agen kompetitif yang dapat bersaing dengan zat terlarut yang
menarik situs pengikatan spesifik pada kolom. beberapa ligan mungkin memiliki
afinitas kepada sekelompok zat terkait daripada tunggal dan dapat digunakan
untuk memurnikan beberapa zat. Terlepas dari selektivitas yang tinggi,
kromatografi afinitas tidak sering diterapkan pada isolasi hasil alam laut. Hal ini
terutama karena teknik ini sangat mahal. Banyak kesulitan yang dihadapi dalam

pemilihan ligan yang sesuai dan persiapan fase diam. Ligan harus menunjukkan
afinitas pengikatan yang spesifik dan reversibel untuk substansi yang akan
dimurnikan. Hal ini juga harus memiliki modifikasi kelompok kimia yang
memungkinkan untuk melekat pada matriks tanpa merusak mengikat aktivitas.
Selain itu, hubungan kovalen digunakan untuk melumpuhkan ligan harus stabil di
segala kondisi yang digunakan selama kromatografi.
II.2.Fasa gerak di LC
Dalam adsorpsi dan sistem kromatografi partisi, aturan lama ''memiliki
afinitas seperti'' memegang makna khusus dalam hal sistem pelarut yang dapat
berhasil digunakan untuk sampel elusi. Sebuah pelarut polar dibutuhkan untuk
mengelusi analit polar dari kolom fase normal yang polar, sedangkan pelarut
organik hidrofobik diperlukan untuk elusi analit hidrofobik dari kolom fase
terbalik hidrofobik. Sifat-sifat pelarut lainnya seperti volatilitas, viskositas, mudah
terbakar, toksisitas, reaktivitas, kompatibilitas dengan metode deteksi, dan biaya
harus dipertimbangkan. Tabel 5 berisi informasi rinci tentang sifat-sifat pelarut
organik yang paling umum. Penambahan berbagai pengubah fase gerak seperti
asam (atau kurang umumnya, basa), reagen pasangan-ion, atau garam penyangga
anorganik bisa berharga dan menimbulkan resolusi yang lebih baik. Garam Buffer
biasanya ditambahkan ke fase gerak kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik
(RP-HPLC). Bagaimanapun, pilihan garam penyangga dikendalikan oleh banyak
faktor. Ini harus transparan pada panjang gelombang deteksi dan bebas dari
kontaminan organik. Selain itu, harus menunjukkan larut sempurna ketika
komponen organik dan fase gerak berair dicampur.
Tabel 5
Sifat umum Pelarut Digunakan Pemurnian Bahan Alam

Umumnya, garam penyangga digunakan pada konsentrasi 10-100mM

(20). Namun, penggunaan garam-garam ini memerlukan langkah desalting
berikutnya. Di IEC, fase gerak terutama larutan buffer. Faktor-faktor kritis adalah
pH dan kekuatan ion dari fase gerak. Tradisional buffer anorganik seperti fosfat,
asetat, dan format biasanya digunakan dalam pemisahan pertukaran ion. Beberapa
penulis lebih suka menggunakan buffer volatile untuk menghilangkan langkah
desalting berikutnya. Contoh buffer volatile yaitu amonium bikarbonat dan
amonium asetat. Buffer volatile terutama mengandung piridin, yang sangat
beracun. Namun, penguapan buffer ini bukanlah tugas yang mudah, dan selama

proses penguapan larutan penyangga, perubahan drastis dalam pH dapat terjadi

sehingga dapat mempengaruhi komponen yang diinginkan (19).
II.3.Bentuk LC
II.3.1. Berlawanan Chromatography (CCC)
Kedua fase diam dan gerak yang cair. Pemisahan zat terlarut
dicapai dengan partisi. Dua bentuk CCC tersedia (lihat Bab. 7). Bentuk
lama adalah tetesan berlawanan dan didasarkan pada berlalunya tetesan
dari fase gerak melalui fase diam yang jaraknya lebih lama. Fase diam
yang terkandung dalam 200 atau lebih tabung kaca dihubungkan secara
seri dengan lembam Teflon tabung. Fase gerak dipompa melalui sebagai
serangkaian terus menerus tetesan yang cukup kecil untuk naik (atau
jatuh) melalui fase diam tanpa menyentuh sisi tabung. CCC sentrifugal ini
merupakan lanjutan mengenai hal ini dan memberi hasil jauh lebih cepat.
Fase diam diadakan di tabung sebagai lapisan tipis dengan kekuatan
sentrifugal. Meskipun CCC menawarkan pemulihan sampel sangat baik,
terbatas berbagai campuran pelarut yang dapat digunakan dan tingginya
biaya yang terlibat membatasi penerapannya (25).
II.3.2. Kromatografi Lapis Tipis
Fase diam padat dan tersebar di lembaran datar. kedua adsorpsi dan
partisi fase diam yang tersedia. Fae diam yang paling umum digunakan
adalah silika gel dan oktadesil silika. Teknik ini berguna dalam fraksinasi,
tidak hanya sebagai proses akhir untuk pemurnian relatif sejumlah kecil
senyawa yang hampir murni, tetapi juga sebagai metode untuk merancang
beberapa jenis pemisahan kolom dan juga untuk monitoring komposisi
fraksi yang diperoleh oleh proses fraksinasi lain (lihat Bab. 4) (25).
II.3.3. Kromatografi Kolom
Kromatografi

kolom

adalah

bentuk

paling

umum

dari

kromatografi. Semua cara pemisahan diwakili. Fase diam solid dan

dikemas dalam kolom yang terbuat dari kaca, stainless steel, atau material
inert lainnya. Campuran sampel diterapkan ke bagian atas kolom dan fase
gerak melewati kolom dengan baik oleh gravitasi, vakum, atau tekanan
untuk memberikan LC gravitasi terbuka, LC vakum, atau menengah atau
HPLC, masing-masing (lihat Bab. 5).
II.3.4. Ekstraksi Fase Padat (SPE)
SPE menyediakan cara yang cepat dan sederhana untuk pemurnian analit
dan konsentrasi. Keuntungan dari teknik ini adalah bahwa ia menghindari
masalah emulsi yang sering dihadapi dengan prosedur ekstraksi cair-cair. Teknik
ini dapat digunakan dengan semua jenis fase diam, kecuali yang digunakan untuk
kromatografi eksklusi. Format yang paling umum digunakan terdiri dari laras
jarum suntik (cartridge) yang berisi 50 mg sampai 20 g sorben materi melalui
larutan sampel sehingga dapat dengan perlahan dipaksa oleh plunger atau vakum
(lihat Bab. 5). Ketika digunakan untuk pemurnian sampel, fase diam
mempertahankan zat terlarut yang diinginkan dengan baik sementara lewat
komponen yang tidak diinginkan (mode kuat) atau melewati zat terlarut yang
diinginkan sementara mempertahankan komponen campur (mode nonretentive).
Pengenceran sampel larutan juga dapat terkonsentrasi dengan mengekstraksi zat
terlarut ke SPE sorben diikuti oleh elusi dalam volume kecil eluen yang kuat
(24,26).
III.

Pendekatan Umum untuk Pemurnian Bahan Alam Laut

III.1. Pengumpulan dan Penyimpanan Organisme Laut
Penanganan organisme laut selama pengumpulan sangat kritis. Tindakan
harus diambil untuk menghindari dekomposisi senyawa. Informasi pada
organisme dan tempat pengumpulan harus hati-hati dicatat untuk memfasilitasi
pengumpulan kembali dan identifikasi taksonomi berikutnya.
Gambar 4 menyajikan contoh lembar catatan koleksi yang harus selesai
untuk setiap sampel yang dikumpulkan.

Di tempat pertama, masing-masing sampel harus memiliki sejumlah

koleksi khusus. Jumlah ini dapat dipilih untuk menunjukkan koleksi tahun, nomor
ekspedisi, dan nomor spesimen, misalnya, koleksi nomor 97212 berarti tahun
1997, nomor ekspedisi yaitu 2, dan nomor spesimen yaitu 12. Lokasi harus
direkam pada peta atau grafik daerah dengan skala yang sesuai untuk
mengaktifkan koleksi kembali. Jika memungkinkan, aparat posisi global (GPS)
harus digunakan untuk mendapatkan koordinat yang akurat untuk 10 m. Informasi
tentang habitat (misalnya, sampel tumbuh di atas batu atau pada permukaan
organisme lain) sebagai pengamatan ekologi juga (misalnya, mampu mencegah
pertumbuhan organisme tetangga) harus dicatat. Sebuah penjelasan rinci tentang
ciri-ciri morfologi organisme, termasuk warna, bentuk, tekstur, harus ditulis. Foto
closeup organisme, diambil di bawah dan di atas air, adalah sangat penting untuk
identifikasi taksonomi dan harus melekat pada lembar pengumpulan (lihat Catatan
3). Spesimen voucher untuk tujuan taksonomi harus disiapkan dengan mengambil
sebagian kecil (misalnya, 2-5 cm) bagian dari jaringan dan melestarikan dalam
larutan formalin 10% dalam air laut. Spesimen ganggang biasanya diawetkan
dalam larutan formalin 5% dalam air laut. Spesimen harus mewakili dari seluruh
organisme dan mencakup banyak jaringan yang relevan dengan taksonomi,
misalnya, untuk spons, baik exo- dan endosome sangat penting untuk identifikasi
akurat. Untuk tunicates dan karang lunak, sering menjadi bagian dari organisme
atau seluruh organisme (jika tidak terlalu besar) harus dikumpulkan, termasuk
'root. Setelah spesimen mencapai laboratorium, larutan formalin harus
dituangkan dan diganti dengan etanol 70% untuk penyimpanan jangka panjang.
Jumlah organisme yang akan dikumpulkan biasanya ditentukan mengingat
kelimpahan. Ukuran sampel yang ideal adalah 1-2 kg berat basah (100-200 g
berat kering). Pemanenan lengkap organisme harus

dihindari. Jika hanya

organisme tunggal yang besar tersedia, bagian dari itu mungkin dikumpulkan.
Idealnya, sampel harus liofilisasi segera setelah pengumpulan untuk mencegah
degradasi kimia. Jika hal ini tidak mungkin, sampel harus harus disimpan pada
suhu -20C sampai 0C sampai pengeringan beku. Sebuah pendekatan alternatif
adalah untuk memperbaiki sampel dengan merendamnya dalam campuran etanol-

air (50:50 v/v) untuk kira-kira 24 jam setelah cairan tersebut akan dibuang.
Organisme basah tersebut kemudian ditempatkan dalam botol high-density
polyethylene (Nalgene 2 L wadah lebar mulut adalah yang terbaik) dan dikirim
kembali ke laboratorium rumah di suhu lingkungan (27) (lihat Catatan 4). Sampel
diawetkan dengan cara ini biasanya tetap dalam kondisi baik hingga 2 minggu
dalam kondisi tropis dengan tidak ada kerugian yang signifikan dari konten
metabolit sekunder. Penambahan MeOH

harus terjadi segera setelah sampel

mencapai laboratorium.
EKSTRAKSI
Strategi ekstraksi tiga yang banyak digunakan di bidang bahan alam laut . Pilihan
metode tergantung pada tujuan proses isolasi, fasilitas yang tersedia, serta keuntungan
intrinsik dan kerugian prosedur (lihat Catatan 5). Metode pertama melibatkan maserasi
sampel dengan pelarut, diikuti dengan penyaringan atau sentrifugasi. Residu jaringan
dikembalikan ke wadah ekstraksi dan diekstraksi lagi. Proses berlanjut sampai tidak ada
hasil ekstraktif diperoleh (lihat Catatan 6). Sampel biasanya dipotong menjadi potonganpotongan kecil atau ditumbuk menjadi partikel halus untuk memfasilitasi penetrasi
pelarut.
Pengadukan atau sonikasi dapat diterapkan untuk meningkatkan tingkat difusi.
Dalam kebanyakan kasus, MeOH atau EtOH adalah pelarut pilihan. Namun, penggunaan
serangkaian pelarut meningkatkan polaritas juga umum untuk mencapai tingkat fraksinasi
tertentu. Bantuan filter dan vakum biasanya digunakan untuk mempercepat proses filtrasi.
Setelah ekstraksi, pelarut dihilangkan dengan penguapan rotary tidak lebih dari 35C
untuk menghindari degradasi senyawa (lihat Catatan 7). Metode ini sederhana dan tidak
memerlukan peralatan yang canggih. Di sisi lain, sejumlah besar pelarut yang terlibat dan
energi yang dibutuhkan untuk penguapan mereka, serta prosedur yang panjang dapat
membatasi aplikasi industrinya. Skema ekstraksi kedua dikembangkan oleh para ilmuwan
di US National Cancer Institute (NCI) sebagai bagian dari program skrining yang luas
dari produk alami untuk mendeteksi senyawa dengan aktivitas antitumor atau anti-HIV.
Sampel beku yang digiling dengan es kering (CO2) dan diekstraksi dengan air pada 4C.
Ekstrak air dihilangkan dengan sentrifugasi dan liofilisasi. The marc kering kemudian

berturut-turut diekstraksi dengan MeOH-CH2Cl2 (1: 1 v / v), diikuti oleh MeOH (100%).
Ekstrak organik digabungkan dan dipekatkan menggunkan vakum (28,29). Metode ini
sangat efisien. Selain itu, liofilisasi dalam menghilangkan ekstrak air berisiko menabrak
dan terjadi degradasi panas. Protokol ekstraksi ketiga melibatkan penggunaan SCFs (lihat
Bab. 3). Titik kritis didefinisikan sebagai suhu tertinggi dan tekanan di atas yang tidak
ada perbedaan dalam kepadatan antara bentuk cair dan gas dari substansi. Pada suhu dan
tekanan di atas titik kritis, cairan homogen tunggal terbentuk dan dikatakan superkritis.
Suhu dan tekanan kritis berbeda dengan substansi dan dengan kemurniannya. Untuk air,
masing-masing 37C dan 220 atm, sedangkan untuk karbon dioksida nilai masing-masing
yang sesuai adalah 31C dan 74 atm.
SCFs memiliki keuntungan dari viskositas rendah, sifat perpindahan massa
unggul, dan daya solvasi baik. Mereka juga memiliki kemampuan untuk menembus
bahan mikro. Dengan demikian, penggunaannya dalam ekstraksi produk alami secara
luas dihargai. Karbon dioksida superkritis adalah pelarut suhu rendah paling disukai dan
dapat digunakan. Keuntungan lain, seperti tidak beracun, nonflammability, tidak korosif,
inert, dan efektivitas biaya. Selain itu, akan mudah menguap ke atmosfer setelah ekstraksi
(30). CO2 superkritis menyerupai pelarut nonpolar heksana dan benzene dalam kekuasaan
pelarut mereka. Afinitas untuk senyawa polaritas yang lebih tinggi dapat ditingkatkan
dengan meningkatkan densitas (dengan perubahan kecil suhu dan tekanan) atau
menambahkan pelarut organik (misalnya, MeOH, EtOH, atau DCM). Namun,
penambahan tersebut pengubah organik akan mengubah suhu dan tekanan kritis pelarut
organik dan akan memerlukan modifikasi prosedur untuk menghapus cairan ekstraksi
pada akhir proses (25). Referensi (31,32) termasuk contoh untuk aplikasi teknik ini
dalam ekstraksi rumput laut. Meskipun metode ini menawarkan cara yang cepat dan
efektif untuk ekstraksi dan penghapusan pelarut selanjutnya, perlu peralatan canggih dan
beberapa eksperimen untuk memilih pengubah organik terbaik.
Fraksinasi Ektrak Laut
Ekstrak laut sangat kompleks, dan terdiri campuran senyawa netral, asam, basa,
lipofilik, dan amphiphilic. Sifat senyawa (s) dari bunga mungkin berbeda sesuai dengan
tujuan proyek, dan sebagai akibatnya tidak ada prosedur fraksinasi umum atau resep yang

dapat melayani segala kemungkinan. Perlu dicatat bahwa meskipun kemajuan terbaru
dalam teknologi pemisahan, pengalaman masih memiliki peran yang sangat diperlukan
dalam isolasi hasil alam laut.
Umumnya, prosedur fraksinasi melewati empat tahap (Gambar. 5). Tahap pertama
meliputi pengumpulan informasi tentang profil kandungan kimia dan aktivitas biologis
ekstrak, sifat senyawa yang menarik, serta jenis kotoran. Informasi ini sangat berharga
untuk perencanaan strategi isolasi. Pada tahap kedua, dereplication (lihat Bab. 12)
biasanya terjadi. Tujuannya adalah untuk mengidentifikasi ekstrak yang mengandung
senyawa dapat dikenal sedini mungkin sebelum langkah fraksinasi rumit yang dilakukan,
dan untuk memprioritaskan ekstrak dalam hal kandungan senyawa baru mereka dan / atau
aktif menarik. Ini mungkin berguna untuk menunjukkan bahwa semua prosedur yang
terlibat dalam tahap 1 dan 2 harus dilakukan untuk semua fraksi yang diperoleh setelah
langkah pemisahan. Dengan cara ini, komponen yang menarik dapat dilacak sampai
tahap pemurnian akhir. Tujuan dari tahap ketiga sering dilakukan untuk menghilangkan
sebagian besar bahan yang tidak diinginkan, misalnya, lemak dan garam menggunakan
resolusi cukup rendah pada langkah pemisahan, misalnya, partisi cair-cair, SPE, dan SEC.
Tahap keempat biasanya melibatkan langkah-resolusi tinggi pemisahan, misalnya, HPLC
dengan tujuan pemurnian senyawa yang menarik yang memungkinkan penjelasan
struktur berikutnya. Prosedur yang terlibat dalam empat tahap yang disebutkan dibahas di
bawah ini dengan beberapa rincian.

Gambar. 5. Pendekatan umum untuk fraksinasi ekstrak laut.

Tahap 1: Investigasi Sifat Komponen Ekstrak

Ini mungkin merupakan tahap yang paling penting dalam proses isolasi.
Perencanaan skema fraksionasi yang bijksana terutama tergantung pada informasi yang
tersedia pada sifat zat yang ada dalam ekstrak. Selain itu, pengetahuan tentang sifat kimia
dan/atau aktivitas biologis senyawa target yang efisien dapat memandu proses pemisahan.
Akibatnya, beberapa informasi dapat diungkapkan oleh taksonomi yang tepat identifikasi
organisme diselidiki. Pencarian literatur dapat memberikan informasi tentang senyawa
yang sebelumnya terisolasi dari spesies. Jika kandungan kimia spesies belum diteliti,
informasi yang berguna dapat diperoleh dengan mencari spesies yang terkait erat dalam
genus. Namun, perlu diingat bahwa kandungan kimia dari organisme laut dapat benarbenar berbeda jika dikumpulkan dari sebuah wilayah yang berbeda dan / atau di musim
lain. Jenis pelarut yang digunakan dalam ekstraksi juga dapat memberikan beberapa
informasi yang berguna. Ekstrak air biasanya mengandung senyawa yang sangat polar

dan sejumlah besar garam anorganik. Di sisi lain, ekstrak organik sering mengandung
senyawa yang kurang polar dan banyak lemak. Informasi lebih lanjut dapat diperoleh
dengan melakukan pengujian biologis, analisis TLC, spektrometri massa (MS), dan
percobaan NMR.
PENYARINGAN BIOLOGI
Bioassay-dipandu fraksinasi sangat menarik untuk penelitian tentang penemuan
obat dari sumber alami. Hal ini penting untuk menjaga referensi sampel dari fraksi yang
diperoleh setelah setiap langkah pemisahan sehingga dapat diuji secara biologis dan
berfungsi sebagai catatan bahan pulih pada setiap tahap proses (21). Namun, salah satu
masalah yang paling sulit dalam bioassay-diarahkan fraksinasi adalah kemungkinan
mendapatkan positif palsu dan negatif palsu. Salah positif biasanya terjadi jika salah satu
komponen tidak aktif dalam ekstrak memiliki kemampuan untuk berinteraksi nonspesifik
dengan target molekul assay (misalnya, mampu mengendapkan protein dan karenanya
menunjukkan aktivitas penghambatan dalam banyak tes berbasis enzim). Demikian pula,
beberapa komponen tidak aktif dapat menimbulkan hit positif dengan berinteraksi dengan
beberapa komponen dari sistem uji selain target. Orang lain mungkin mengganggu
deteksi metode uji, misalnya, quenchers UV (18). Di sisi lain, negatif palsu biasanya
terjadi jika senyawa aktif bekerja pada target molekul lain daripada pengujian tersebut.
Hal ini juga harus dicatat bahwa banyak entitas kimia menarik mungkin diaktifkan secara
in vivo oleh enzim metabolik, faktor yang tidak dipertimbangkan dalam banyak sistem
penyaringan in vitro. Dengan demikian, kita dapat menyimpulkan bahwa proses
fraksinasi tidak boleh hanya mengandalkan skrining biologis.
ANALISIS TLC
Analisis pelat TLC dapat digunakan untuk mendapatkan ide tentang tingkat
polaritas dan/atau hidrofilisitas komponen ekstrak yang berbeda. Mereka juga banyak
diterapkan dalam mendeteksi senyawa melalui beberapa langkah pemisahan. Selain itu,
mereka dapat digunakan untuk memprediksi pola pemisahan pada kromatografi kolom,
dan dengan demikian membantu dalam memilih sistem kolom kromatografi terbaik.
Mereka mungkin membantu juga dalam menilai tingkat kemurnian senyawa hasil isolasi.

Dalam semua aplikasi di atas, lebih dari satu sistem pelarut harus diadili sebagai senyawa
yang berbeda mungkin memiliki nilai Rf yang sama dalam satu sistem dan dengan
demikian muncul sebagai satu tempat. Pelat TLC dapat disemprot dengan reagen yang
bereaksi khusus dengan kelas-kelas senyawa tertentu. Penggunaan reagen penyemprotan
yang berbeda dapat memberikan banyak informasi tentang kelas kimia yang ada dalam
ekstrak. Ada banyak reagen penyemprotan tercantum dalam beberapa teks standar pada
subjek (33,34) dan juga dalam Bab 4. Tabel 6 daftar penyemprotan reagen yang paling
banyak digunakan untuk produk alami laut.
Selain itu, kombinasi langsung TLC dengan bioassay (bioautografi) dapat
memberikan informasi lebih lanjut tentang komponen aktif dalam ekstrak campuran. Hal
ini dicontohkan dalam penemuan agen antimikroba.
Tabel 6
Reagen Penyemprot Kromatografi Lapis Tipis yang Umum Digunakan di Kebanyakan
Laboratorium Bahan Alam Laut
Reagen
Vanillin

Resep

Perawatan

Catatan

/ Larutkan vanillin(4g) Panas pada 100 C Reagen

asam sulfat

pada

terkonsentrasi sampai

H2SO4 (100 mL)

Anisaldehida Tambahkan
/ asam sulfat

asam

0.5ml Panas pada 100 C Mendeteksi

asetat muncul

glasial dan kemudian

menambahkan
campuran

warna Universal

muncul

anisaldehida ke 10 sampai
mL

Penyemprot

warna senyawa,

banyak
terutama

terpen, gula, fenol, dan

steroid

ke
85mL

MeOH dan 5 mL
H2SO4
terkonsentrasi, dalam
urutan ini
Reagen

Tambahkan 10 mL Tidak ada panas yang Mendeteksi alkaloid dan

Dragendorff

larutan 40% dari KI diperlukan

senyawa

ke 10 mL larutan

nitrogen

0,85

heterosiklik

subnitrate

bismut dasar dalam

asam asetat (10 ml)
dan air suling (40
ml). Encerkan larutan
yang

dihasilkan

dengan asetat asam

dan air dalam rasio:
1: 2: 10
Ninhydrin

Larutkan

ninhidrin Panas pada 100 C Deteksi

reagen

(30 mg) di 10 mL n- sampai

asam

amino,

warna amina, dan peptida

butanol. Tambahkan muncul

asam asetat 0.3mL
untuk solusi

Dari ekstrak laut. Setelah pengembangan, pelat KLT dari ekstrak kering
dan kemudian dilapis dengan lapisan tipis agar yang mengandung organisme uji
terhadap yang ekstrak aktif. Setelah masa inkubasi yang tepat, zona inhibisi
pertumbuhan agar dapat dilihat pada daerah-daerah pelat yang mengandung
senyawa aktif (35). Metode yang sama juga dapat diterapkan untuk mendeteksi
senyawa dengan aktivitas antitumor (36).
III.3.1.3. ANALISIS NMR
Analisis spektroskopi NMR memiliki peran yang sangat diperlukan dalam
menjelaskan struktur senyawa murni. Hal ini juga dapat memberikan banyak informasi
tentang sifat kimia senyawa dalam campuran. Maka dari itu, disarankan untuk
memperoleh 1H- dan 13C- spektrum NMR untuk ekstrak laut. Tujuannya adalah untuk
mendeteksi ada atau tidaknya artefak umum, misalnya, plasticizer (lihat Catatan 8) dan

untuk menetapkan komponen dalam campuran kelas kimia tertentu (lihat Catatan 9).
Kombinasi dari fraksi setelah pemisahan dapat ditetapkan atas dasar spektrum NMR
yang serupa.
III.3.1.4. ANALISIS MS
MS adalah teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari
senyawa yang tidak diketahui oleh pengionnya dan mendeteksi rasio massa terhadap
muatan (m / z) dari ion molekul yang dihasilkan. Molekul yang tidak terionisasi tidak
akan terdeteksi. Salah satu keuntungan dari teknik ini memiliki sensitivitas tinggi. Ia
bahkan bisa mendeteksi jumlah mikrogram senyawa. Masalah dalam generalisasi MS
untuk proses identifikasi komponen ekstrak adalah kurangnya mode ionisasi yang
universal dimana setiap senyawa yang tidak diketahui dapat terionisasi. Untungnya,
banyak teknik ionisasi MS telah diperkenalkan dimana sebagian besar produk alami
laut dapat terionisasi. Umumnya, electrospray (ESI) adalah teknik ionisasi yang
direkomendasikan untuk ekstrak polar, sedangkan ionisasi kimia tekanan atmosfer
(APCI) lebih disukai untuk yang agak polar (37). Analisis MS sulit untuk diterapkan
pada ekstrak laut mentah, tapi bisa digunakan untuk mengidentifikasi senyawa dari
campuran semi murni.
III.3.2. Tahap 2: Dereplikasi
Isolasi senyawa murni dari ekstrak laut adalah proses yang membosankan dan
mahal. Langkah-langkah harus diambil untuk menghindari isolasi senyawa yang dikenal.
Dereplikasi dapat didefinisikan sebagai upaya untuk menghapus duplikat lead atau
senyawa (lihat Bab. 12) (38). Proses ini tergantung pada ketersediaan database yang
komprehensif untuk senyawa yang dikenal. Ada 378 database Houssen dan Jaspars
tersedia saat ini, termasuk yang mengandung informasi mengenai sumber organisme,
identifikasi taksonomi, dan metode ekstraksi, serta karakteristik kromatografi dan
spektroskopi yang berbeda dari senyawa hasil isolasi. Sebagian besar database ini dapat
diakses melalui internet. Tersedia juga pada CD. Tabel 7 berisi beberapa dari database
yang berguna serta URL-nya, terutama dalam kaitannya dengan produk alami laut.
III.3.3. Tahap 3: Fraksinasi Crude

Tujuan dari tahap ini adalah untuk menyederhanakan komposisi ekstrak dengan
membaginya kedalam berbagai kelompok senyawa berbagi karakteristik fisikokimia
yang sama dan atau menghapus sebagian besar bahan yang tidak diinginkan dan dengan
demikian memperbanyak ekstrak sehubungan dengan senyawa sasaran. prosedur umum
melibatkan partisi pelarut, defatting, dan desalting.
III.3.3.1. Partisi pelarut
Prosedur yang dijelaskan pada Gambar. 6 merupakan modifikasi dari
metode yang dikembangkan oleh Kupchan (39). Hal ini dapat digunakan
untuk defatting dan desalting juga.
Tabel 7
Beberapa Database yang Berguna Untuk Dereplikasi Bahan Alami Laut
Database

URL

MarinLit

http://www.chem.canterbury.ac.nz/marinlit/marinlit.shtml

Dictionary of Natural http://www.chemnetbase.com/

Products and others
Chemical

Abstracts http://info.cas.org/

(CAS)
NAPRALERT
(Natural

http://www.cas.org/ONLINE/DBSS/napralertss.html

Product

Alert) database
Beilstein CrossFire

http://www.mimas.ac.uk/crossfire/

Silverplatter

http://web5.silverplatter.com/webspirs/start.ws

NCI data search

http://dtp.nci.nih.gov/docs/dtp_search.html

United States Patents

http://www.uspto.gov/patft/

Chemical

Database http://cds.dl.ac.uk/cds/

Services
National Institute of http://webbook.nist.gov/chemistry/

Standards
Cambridge

http://www.ccdc.cam.ac.uk/products/csd/

Structural Database
Marine

Biological http://www.mbl.edu/

Laboratory,

Woods

Hole, MA, USA

Chromatography

http://www.chromatography.co.uk/apps/hplc/dbases/form.

application database

htm

Gambar. 6. Modifikasi skema partisi Kupchan

Sebagian besar lemak akan hilang dengan fraksi n-heksana, sedangkan
garam anorganik akan hilang dengan sesuatu yang berair. Keuntungan dari
metode ini adalah perolehan kembali senyawa sasaran. Kelemahannya adalah
masalah pembentukan emulsi, ketidakefektifan waktu, dan banyaknya
penggunaan volume pelarut.
III.3.3.2. Defatting

Sejumlah prosedur telah dijelaskan untuk defatting ekstrak laut.

Penggunaan Sephadex LH-20 dan MeOH: CH2Cl2 (1: 1 v / v) sebagai eluen
adalah salah satu prosedur yang umum digunakan. Lemak dan senyawa
organik non polar biasanya dielusi pertama. Prosedur umum lainnya
melibatkan penggunaan cartridge SPE yang mengandung silika C18 dan
MeOH atau H2O sebagai cairan pencuci. Karena sifat hidrofobik yang kuat,
lemak dan lipid dipertahankan pada fase diam, sementara lainnya komponen
ekstrak hidrofilik berlebih dielusi. Prosedur terakhir tidak cocok apabila
senyawa sasaran menunjukkan perolehan kembali dari silika C18 yang buruk.
III.3.3.3.Penghilangan garam
Metode yang paling efisien untuk desalting ekstrak laut telah dijelaskan
oleh West dan Northcote (40) dan West. (41). Dalam prosedurnya, ekstrak
metanol dilewatkan melalui kolom Diaion HP20 resin (styrene-divinil
benzena polimer) sebelumnya dikalibrasi dengan MeOH. Eluen terkonsentrasi
dan melewati lagi kolom yang sama. Eluen yang dihasilkan diencerkan
dengan air dan melewati kolom. Langkah terakhir diulang untuk memastikan
bahwa semua senyawa yang mengandung domain hidrofobik teradsorpsi pada
resin. Desalting dapat dengan mudah dicapai dengan mencuci resin dengan air
yang banyak. Proporsi yang berbeda dari MeOH atau aseton dalam air dapat
digunakan untuk mengelusi senyawa teradsorbsi dan untuk mencapai tingkat
fraksinasi tertentu. Hasil yang lebih baik dapat diperoleh dengan
menggunakan manik-manik dengan ukuran partikel yang lebih kecil
(misalnya, Diaion HP20ss); namun, dalam hal ini, aplikasi tekanan yang
dibutuhkan untuk mencapai sifat alir yang baik.
III.3.4. Tahap 4: Pemurnian Akhir
HPLC preparatif, sejauh ini, merupakan alat yang paling berguna untuk
memisahkan campuran kompleks. Ketika dihubungkan dengan diode array detector
(DAD), HPLC memungkinkan seorang analis untuk mengidentifikasi senyawa yang
dikenal dengan perbandingan waktu retensi dan spektrum UV. Pengenalan evaporative

light scattering detector (ELSD) memungkinkan untuk mendeteksi senyawa yang tidak
memiliki gugus kromofor UV. Dalam beberapa tahun terakhir, tandem atau ditulis dgn
tanda penghubung teknik analisis seperti LC-MS, LC-MS-MS, LC-NMR, dan LCNMR-MS juga telah dikembangkan (lihat Bab. 9). Teknik ini menyediakan alat yang
ampuh untuk identifikasi secara cepat senyawa yang dikenal dan penentuan kelas
struktur yang baru.
III.3.4.1.UV DIODA ARRAY DETECTOR (DAD)
Detektor UV Fotodioda array memungkinkan pengumpulan data absorbansi UV
di banyak panjang gelombang secara bersamaan dan dengan demikian memungkinkan
penilaian kemurnian puncak. Kotoran dasar dapat dengan mudah dideteksi dengan
membandingkan spektra UV pada titik waktu yang berbeda di puncak. DAD paling
modern didukung dengan pustaka yang mengandung spektrum UV senyawa yang
dilaporkan sebelumnya. Operasi perangkat lunak ini memiliki detektor dengan
kemampuan untuk turunan pustaka spektral dan mencari dan dengan demikian
memungkinkan identifikasi cepat senyawa yang dikenal (20).
III.3.4.2.EVAPORATIVE LIGHT-SCATTERING DETECTOR (ELSD)
ELSD telah dikembangkan untuk melengkapi deteksi UV senyawa dengan daya
absorbansi yang lemah. Di ELSD, efluen HPLC nebulized dan kemudian menguap
dalam tabung melayang yang dipanaskan, yang menghasilkan embun partikel analit
yang melewati seberkas cahaya. Partikel analit menghamburkan cahaya dan
menghasilkan sinyal (42). Berbeda dengan detektor UV, koefisien kehilangan analit
tidak berpengaruh pada respon ELSD. Dengan demikian, ELSD sekarang merupakan
metode deteksi konsentrasi pilihan untuk LC. Ketika ELSD terhubung ke HPLC
preparatif, efluen dari kolom dibagi dan hanya sebagian kecil diarahkan ke detektor.
III.3.4.3.LC-MS DAN LC-MS-MS
LC-MS adalah alat yang paling banyak diterapkan untuk dereplikasi bahan alami
(lihat bab. 9 dan 12) (43,44). Hal ini terutama karena berat molekul nominal dapat
digunakan sebagai permintaan pencarian di hampir semua database. Menggunakan LC-

MS-MS, ion molekul tertentu dipisahkan dan mengalami putaran kedua pada
fragmentasi. Pola fragmentasi yang dihasilkan dapat memberikan banyak informasi
tentang struktur induk. Teknik ini cocok untuk identifikasi fragmen dari molekul yang
terbentuk dari beberapa unit individu seperti peptida, depsipeptida, oligosakarida, dan
saponin (13).
III.3.4.4.LC-NMR
Kemajuan terbaru dalam spektroskopi NMR telah memungkinkan rangkaian
langsung dengan sistem HPLC (lihat Bab. 9). Penggunaan medan magnet yang tinggi
(500 MHz atau lebih besar), Sel aliran volume kapiler mikroliter, dan sistem pemrosesan
sinyal digital telah secara dramatis meningkatkan sensitivitas untuk melacak jumlah
analit. Selain itu, desain pemeriksaan baru telah memfasilitasi efisiensi dan spesifikasi
penekanan sinyal NMR pelarut HPLC. Bagaimanapun, teknik ini masih lambat dan
sangat mahal. LC-NMR sangat berguna dalam kasus dimana data dari LC-MS tidak
memungkinkan identifikasi senyawa pasti (misalnya, isomer yang memiliki berat
molekul yang sama). Teknik ini telah berhasil diterapkan pada identifikasi alkaloid
aaptamine dalam ekstrak spons laut Aaptos spesies (45). Penggunaan HPLC-NMR-MS,
diomana sistem pemisahan digabungkan dengan kedua NMR dan MS, juga telah
dilaporkan (46).
IV.

Vistas baru Pada Teknologi Pemisahan

Walaupun perbedaan tinggi, produk alami telah hadir dari program penelitian dari
berbagai perusahaan farmasi. Hal ini terutama karena dari penggunaan waktu tradisional
dan intensif biaya isolasi dan prosedur identifikasi, dan kurangnya ketersediaan produk
alami dalam format yang sesuai untuk teknologi HTS modern. Akibatnya, integrasi
ekstrak mentah produk alami dalam sistem HTS menjadi sulit. Hal ini terutama karena
ada kemungkinan positif palsu yang tinggi dan senyawa bioaktif berulang diketahui dan
pekerjaan membosankan yang diperlukan untuk identifikasi hit. Baru-baru ini, metode
telah dijelaskan untuk persiapan produk alami yang besar dan beragam dioptimalkan
untuk HTS (47). Salah satu metode bergantung pada menghasilkan sebuah pustaka besar
dari fraksi yang dimurnikan setengah. Keuntungan dari metode ini antara lain yaitu

peningkatan keandalan hasil pengujian biologis dan penurunan yang tajam dalam beban
kerja berikutnya untuk identifikasi hit dan dereplication. Strategi lain tergantung pada
persiapan pustaka senyawa alami murni. Meskipun jenis pustaka ini menawarkan
kehandalan yang paling tinggi dalam pengujian biologis, jumlah besar pekerjaan yang
dibutuhkan untuk persiapan sampel masih sangat kekurangan. Kedua pustaka
bergantung pada ketersediaan teknik fraksinasi yang cepat dan otomatis. Baru-baru ini,
Sepiatec GmbH (Berlin, Jerman) bekerjasama dengan Aventis Pharma Deutschland
GmbH (Frankfurt, Jerman) telah merancang sistem untuk meningkatkan produktivitas
persiapan sampel untuk HTS. Sebuah deskripsi singkat dari dua contoh representatif
sistem ini diberikan di sini.
IV.1. 8X HPLC Paralel
Sistem ini (Gbr. 7), yang dapat berjalan tanpa pengawasan untuk 24 jam dalam
sehari, mampu secara bersamaan menggunakan delapan fraksinasi campuran ekstrak
kompleks dengan sistem pompa gradien tunggal bertekanan tinggi, multi-channel (UV,
DAD, atau ELSD) detektor, dan perangkat lunak ahli. Sampel dipisahkan oleh sebuah
array dari kolom HPLC, menyediakan satu buah kolom untuk setiap sampel. Perlu
dicatat bahwa suntikan cairan dari sampel dengan berbagai polaritas yang luas adalah
pekerjaan yang menantang. Dimethyl sulfoxide (DMSO) benar-benar melarutkan
sebagian sampel untuk injeksi, tetapi juga dapat mengganggu pemisahan kromatografi
berikutnya. Modul injeksi SPE on-line (26) memecahkan kesulitan ini.

Dengan

menggunakan autosampler, sampel dilarutkan dalam DMSO yang disuntikkan kedalam

modul, dan air atau buffer secara bersamaan dipompa sebelum inlet ke kolom SPE (48).
Karena peningkatan cepat ini dalam polaritas gradien, komponen ekstrak tetap
teradsorbsi ke kolom SPE dan DMSO / air dibuang. Selanjutnya, pelarut organik yang
sesuai menyuntikkan ekstrak ke kolom pemisahan.

Gambar. 7. garis Skema pipa dari 8X perangkat HPLC Paralel. Gambar

direproduksi dengan izin dari Perusahaan Brosur Sepiatec.
Elusi fraksi menjadi on-line dan pemeriksaan otomatis sebelum pengumpulan.
Mereka terabsorbsi lagi ke kolom SPE menggunakan prinsip yang sama seperti modul
injeksi sampel yang telah dijelaskan sebelumnya. SPE teradsorpsi fraksi yang memerah
dengan air dan kemudian dielusi dengan pelarut organik murni ke dalam 96-piring baik.
Sistem ini mampu memisahkan lebih dari 100 ekstrak produk alami perhari menjadi
beberapa ribu air dan fraksi penyangga bebas. Kualitas dan kemurnian fraksi yang
diperoleh sesuai dengan tuntutan HTS.
IV.2. Sepbox: Pengaturan HPLC-SPE-HPLC-SPE
Sistem ini (Gbr. 8) didasarkan pada kombinasi HPLC dan SPE. Dalam pengaturan
HPLC-SPE-HPLC-SPE ini, polaritas eluen meningkat dengan penambahan air yang
sedemikian rupa sehingga fraksi dielusi dari kolom pemisahan I yang teradsorpsi ke
kolom perangkap I. Rute fraksi terperangkap kemudian melewati pemisahan kolom II
dimana pemisahan akhir selesai. Setiap komponen yang dielusi teradsorpsi ke kolom
perangkap II, terpisah dari buffer, dan memerah pada pengumpul fraksi. Sistem ini jauh
lebih cocok untuk menghasilkan sebuah pustaka senyawa yang hampir murni.

Gambar. 8. garis Skema pipa dari sepbox. Gambar direproduksi dengan

izin dari Perusahaan Brosur Sepiatec.