Riska’s Note

Analisis Kromosom

Kultur darah sel limfosit

Kultur darah yang digunakan berasal dari sel limfosit, karena sel ini sangat mudah
membelah (bermitosis) dalam waktu 48 jam secara in vitro dan setiap 24 jam berikutnya akan
terjadi mitosis berikutnya. Kultur darah limfosit dapat digunakan untuk :
1. Melakukan analisis kromosom dalam bentuk kariotip (banding), hal ini dapat dilakukan
karena sel limfosit dapat membelah dengan cepat sehingga bisa dilihat kultur dengan set
kromosom yang cukup banyak pada fase antara profase dengan metaphase
Menilai status imunitas seluler dengan cara menghitung indeks transformasi sel blast. Sel
limfosit dikultur kemudian ditunggu sampai sel tsb melakukan transformasi menjadi sel
blast. Kemampuan sel yang bertransformasi inilah yang dinilai dan dibandingkan dengan
jumlah seluruh sel. indeks transformasi yang rendah artinya respon imun kurang baik.
!"#$%& ()$ *%+, -)./.%+(01.#%(2
Indeks transformasi = !"#$%& ()$ ()$"."&+*% 3%$%# 4"$/".

Pada kultur sel limfosit T saat akan dilakukan penilaian imunitas seluler maka
diberikan stimulant/ mitogen. Stimulant yang diberikan bisa berupa PHA (phyto
hemagglutinin) stimulant ini bersifat poliklonal artinya sebagian besar sel T akan
terstimulasi dan sebagian kecil sel B. sedangkan saat akan menstimulasi sel B saja maka
distimulasi dengan stimulant ConA (Canavalia A) yang bersifat monoclonal. Saat akan
menstimulasi respon imun humoral maka stimulant yang diberikan berupa PWM
(pokeweed mitogen) yang akan menstimulasi sel limfosit B.
Pemeriksaan kromosom dapat dilakukan saat seseorang memiliki indikasi berikut :
a. Masalah pertumbuhan dan perkembangan awal, keterlambatan mental, malformasi ganda,
hambatan tinggi tubuh, genetalia yang meragukan dan retardasi mental
b. Kematian saat lahir (neonates)
c. Masalah kesuburan (fertilitas) seperti wanita dengan amenorrhoe, pasutri dengan riwayat
infertilitas dan abortus habitualis
d. Riwayat keluarga dengan abnormalitas kromosom
e. Neoplasia (keganasan kanker)
f. Wanita yang hamil dengan usia lanjut, karena terdapat peningkatan resiko kelainan
kromosom pada fetus yang dikandung wanita dengan usia > 35 tahun. Indikator
menggunakan nilai ASKA (Asosiasi Kromosom Akrosentrik) jika nilainya tinggi maka
kemungkinan kelahiran dengan kelainan kromosom juga akan tinggi.
Sumber kromosom
1. Darah tepi : sel yang memiliki inti dengan waktu kultur 3-4 hari karena stadium sel yang
berbeda-beda.
2. Biopsy kulit : menghasilkan kultur fibroblast
3. Specimen lekosit : spesifik pada limfosit T dan membentuk limfoblastoid
4. Sumsum tulang : digunakan untuk diagnosis keganasan hematologis (tidak perlu dikultur,
karena sifatnya yang hematopoetik)
5. Fetal cell : berasal dari cairan amnion dan biopsy villi khorialis (diawal kehamilan)
Identifikasi kromosom
Kromosom diidentifikasi dengan menggunakan teknik banding. Teknik banding merupakan
suatu pewarnaan kromosom dengan gambaran gelap/terang dimana gambaran gelap dan terang
yang dihasilkan dipengaruhi oleh komposisi heterokromatin dari tiap kromosom. Macam-macam
pewarnaan banding adalah
1. G banding: pewarna Giemsa
2. Q banding: pewarna Quinacrine, keunggulannya bisa membedakan lengan panjang kromosom
Y lebih mudah dilihat.
3. R banding (reverse): teknik dengan pemanasan tinggi, bagian telomer akan terwarnai sehingga
mudah dilihat apakah terjadi perubahan pada ujung telomer.
4. C banding (centromere): bagian yang terwarnai adl daerah dekat sentromer
5. Banding dengan resolusi tinggi: menggunakan teknik sikronisasi saat kultur dimana diberikan
bahan khusus agar tahap replikasi berjalan bersamaan dari setiap sel kultur. Sel akan
ditahan pada fase S
6. FISH (fluorescence in situ hybridization): teknik
pemeriksaan ada tidaknya gen/ sekuens DNA
tertentu pada kromosom yang dilakukan dengan
bantuan probe/ pelacak spesifik. Teknik ini
dapat mendeteksi delesi kecil pada kromosom,
duplikasi dan rearrangement kromosom. Aplikasi
teknik FISH digunakan untuk mendeteksi
struktur dan jumlah abnormalitas kromosom,
identifikasi kromosom marker, monitoring efek
terapi, deteksi dini penyakit genetic dan deteksi
delesi & amplifikasi gen

METODE KULTUR SEL LIMFOSIT

Identifikasi kromosom dengan teknik banding dilakukan dalam 3 tahapan, yaitu kultur sel,
harvesting, pewarnaan (banding).
Bahan yang digunakan untuk kultur sel limfosit adalah :
1. Medium kultur RPMI 1640 steril : medium ini merupakan medium standar untuk kultur sel
limfosit. Komposisinya Biotin, vitamin B12, PABA, glutation, choline, vitamin inositol.
2. Fetal bovine serum (FBS) berfungsi sebagai growth factor dan nutrisi pertumbuhan sel
3. PHA (Phytohaemaglutinin) berasal dari ekstrak Phaeolus vulgaris yang berfungsi sebagai
stimulant/mitogen untuk mestimulasi mitosis sel limfosit. Stimulat akan bertindak sebagai
antigen non-spesifik bagi sel limfosit T sehingga menstimulasi terjadinya transformasi sel
T menjadi sel blas yang memiliki kemampua mitosis. PHA bisa menjadi stimulant untuk sel
limfosit T karena sel T mengandung reseptor CD4 yang berfungsi sbg PHA reseptor.
4. KCl 0.56%/ 0,075 M sebagai larutan hipotonis
5. Pewarna giemsa/leisman
6. Larutan buffer fosfat pH 6.8
7. Methanol absolut dan Asam asetat glasial sebagai bahan pembuatan larutan fiksatif
kromosom disebut dg larutan Carnoys
8. Kolcemid untuk menghentikan proses pertumbuhan sel sehingga sel hanya akan membelah
sampai tahap metaphase sehingga kromosom dapat dilihat dengan baik. Kolcemid akan
menghentikan perkembangan mikrotubul sehingga sel tidak akan berlanjut ke tahap
anafase karena kromosom tidak bisa ditarik ke masing2 kutup.

2
A. Tahapan Kultur sel
- Medium RPMI dimasukan ke tabung sentrifuge 5ml ditambah FBS 0.8ml, PHA 70 𝜇l dan
sampel darah 0.5-0.8ml *untuk kultur darah bayi baru lahir sampai umur < 1 bulan,
sampel yang digunakan hanya 3 tetes karena masih mengandung banyak limfosit, untuk
bayi umur > 1 bulan digunakan sekitar 800 𝜇l.
- Inkubasi 72 jam suhu 37oC dengan penambahan CO2 5-10% untuk menjaga pH dari medium
kultur tetap stabil
- Lakukan penghentian proses mitosis kira-kira 1 jam sebelum pemanenan dengan
memberikan kolcemid 0,2 ml

B. Harvest (panen hasil kultur)

- Keluarkan kultur dari incubator
- Sentrifuse 1300rpm 10 menit, ambil bagian pellet tambahkan dengan larutan hipotonis
KCL 0,075 M 5-10ml lalu homogenkan. Larutan KCl bersifat hipotonis sehingga sel akan
menyerap larutan ini kemudian sel akan mengalami lisis dan menyebabkan kromosom
keluar dari sel.
- Inkubasi 37oC 20 menit agar sel pecah dan kromosom dapat keluar
- Buat larutan fiksatif carnoys dengan perbandingan 3 : 1 (methanol absolut : asam asetat
glasial). Larutan carnoy berfungsi untuk menjaga posisi sel tetap pada posisinya dan
untuk mencuci sel
- Masukan 10 tetes carnoy untuk membuang sel darah merah yang ada didalam sampel,
sentrifuse 1300rpm 10 menit, supernatant dibuang karena mengandung sel darah merah
- pellet ditambahkan lagi larutan fiksatif carnoy 5-10ml untuk fiksasi dan pencucian,
sampel ini dapat disimpan dalam kulkas -20oC
- Sentrifuse 1300rpm 10 menit (sampai pellet berwarna putih), buang supernatant dan
sisakan sekitar 1 ml, dan emulsikan dengan pellet
- Emulsi di teteskan ke kaca objek
- Keringkan preparate kemudian warnai dengan larutan Giemsa/Leisman dan amati dengan.
mikroskop
C. Pewarnaan (banding)
- Siapkan 4-5 preparat yang akan diwarnai, sebelumnya simpan slide pada suhu kamar
minimal 48 jam kemudian masukan ke oven 65oC selama semalam sebelum melakukan
banding
- Siapkan 3 buah jar untuk proses banding
a. Jar 1 berisi larutan tripsin working sollution untuk denaturasi protein histon sehingga
sampel bisa menyerap warna yang diberikan dengan baik dan hasil banding terlihat
jelas. Dibuat dari 0.0625gr tripsin dilarutkan dalam 50ml PBS
b. Jar 2 berisi PBS digunakan untuk mencuci
c. Jar 3 berisi PBS digunakan untuk mencuci
- Celupkan preparat ke dalam jar 1 selama 8 detik, kemudian jar 2 beberapa celup dan jar
3 beberapa celup.
- Tambahkan pewarna leisman yang dibuat dengan melarutkan 1gr bubuk leysman kedalam
500ml methanol sebagai larutan stock. Leysman stock kemudian diencerkan lagi dengan
perbandingan 1:3 (leysman stock : gurr buffer). Pemberian warna leysman sebanyak
1cc/slide dengan lama waktu pewarnaan 4 menit
- Siram dengan akuades dan keringkan
- Tutup dengan cover glass dan entellan kemudian lihat dibawah mikroskop

3
Jelaskan kelainan kromosom Philadelphia pada leukimia dalam Teknik FISH atau Banding
Kelainan kromosom Philadelphia ini terjadi karena adanya kelainan struktur dapat dilihat
dengan metode banding melihat corak gelap terang dari kromosom. Philadelphia ini terjadi karena
adanya translokasi balance pada kromosom 9 dan kromosom 22 ditandai dengan limfoblastik.
Teknik FISH (flouresense in situ hybridization) : menggunakan probe / penanda yang
spesifik dari gen atau sekuens dna pada kromosom 9 dan kromosom 22. Sehingga metode ini lebih
spesifik dan tidak perlu melakukan kultur terlebih dahulu dan hasinya berupa sub mikroskopik.
Ketika ada kelainan, maka probe itu akan mendeteksi spesifik pada gen atau sekuens DNA yang
dituju sehingga akan terlihat berpendar. Metode FISH ini selain spesifik juga bisa dilakukan
pada tahap interfase dan mitosis.
Metode membuat preparate
1. Dengan akuades
- Slide diberi label kemudian direndam didalam air
- Ambil sampel, teteskan ke slide dan tuang sisanya
- Miringkan agar tiris
2. Metode tiup
- Teteskan sampel di slide yang sudah diberi label
- Tiup sampai sampel menyebar dipermukaan slide
- Tunggu kering

HASIL PRAKTIKUM

A. Hasil kultur sel B. diwarnai dengan teknik banding