Konsep dasar PCR

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan
suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR
dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar
106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya.
Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama
pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA
target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi
molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini
penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi
evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

Komponen PCR

1. Template DNA

Sampel DNA utuh yang menyimpan sekuens yang ingin diperbanyak. Pada tahapan
awal(=denaturasi), suhu tinggi diberikan pada template DNA agar struktur ganda DNA bisa
lepas dari satu sama lain.

2. Enzim DNA Polymerase

Enzim yang mensintesis rantai baru sesuai dengan rantai target DNA nya. DNA Polymerase
yang paling sering digunakan adalah Taq-Polymerase; diambil dari nama sumbernya,
mikroorganisme Thermis Aquaticus, ada juga varian DNA Polymerase yang disebu Pfu-
Polymerase yang diambil dari mikroorganisme Pyrococcus furiosus. Sifat kedua sumber yang
tahan suhu ekstrim membuat keduanya menjadi penghasil enzim DNA Polymerase yang baik.

3. Primer PCR

Potongan rantai tunggal DNA yang sesuai dengan sekuens target. Enzim Polymerase mulai
mensintesis DNA dari ujung primer PCR.

4. Nukleotida
Unit protein A, C, T dan G yang menjadi fondasi pembangunan DNA baru.

5. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

PCR yang diawali oleh konversi DNA sampel menjadi cDNA dengan bantuan enzim reverse
Transkriptase.

Desain Primer PCR

Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni forward dan
reverse. Forward primer bergerak dengan arah 5′ –> 3′ untai DNA template. Sementara reverse
primer bergerak dengan arah 3′ –> 5′ untai DNA template. Kedua primer ini dapat didesain
dengan mengunakan program aplikasi yang terdiri dari BIOEDIT, GENAMICS EXPRESSION,
OLIGOCALCULATOR, dan FAST PCR. Untuk memahami cara kerjanya, berikut ini saya
contohkan langkah mendesain primer untuk gen selulase pada Bacillus subtilis atau bglC.
1. Menentukan posisi bglC dalam whole genom Bacillus subtilis.
2. Mencari tahu enzim restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan menggunakan
program aplikasi BIOEDIT.
3. Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan mempelajari peta
sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang sesuai dengan pET-
21ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, XhoI, EagI, AvaI,
4. Menentukan posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics Expresion. Posisi
primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs pemotongan
enzim restriksi.
Keterangan: Data sumber gen selulase diperoleh B.subtilis str. DLG

5. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop kodon sulit disesuaikan dengan
posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan pada 2-3 nukleotida. Mutasi 2-3
nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan mengurangi daya lekat primer terhadap untai
DNA asalkan presentase Guanin (G) dan Sitosin (C) primer cukup tinggi.
6. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator (pada Genamics Expression) dan atau
dengan Oligocalculator.
contoh tampilan:
Hasil oligo shelf complimentary untuk reverse primer
7. Mengecek desain primer dengan Fast PCR untuk mengetahui tingkat spesifitas primer dan
ukuran produk PCRnya.

Tahapan PCR

1. Denaturasi

Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang menyebabkan terjadinya
pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang
menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

2. Penempelan (Annealing)

Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA
berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang
menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer.
Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah
sekitar 550C selama 30-60 detik.

3. Pemanjangan (Extension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polymerase akan memanjangkan
sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan
nukleotida.

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan
kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai
DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru
secara eksponensial.