BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu
kimia karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa
campuran. Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus
melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan
untuk memisahkan campuran .
Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara
berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan
yang semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah
pengembangan di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan
Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode
elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan
penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-
sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir
abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari
listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan
listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam
Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal
dari bahasa Junani yangmempunyai arti transport atau perpindahan melalui
partikel-partikel listrik.
Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh
ilmuwan Swedia Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan
chanrge mereka dalam tabung berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan
lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi hadiah nobel pada tahun 1948.
Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel elektroforesis
dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan

1
 lebih baru pada 1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang
merupakan metode yang berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan
industri . banyak modus yang berbeda elektroforesis telah dikembangkan
untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di sini adalah set pada
teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.

B. Maksud
a. Aapa prinsip dan teori elektroforesis ?
b. Apa saja Jenis-Jenis Elektroforesis?
c. Apa Instrumen dari Elektroforesis?
d..Apa manfaat dan kegunaan/ aplikasi elekroforesis?

C. Tujuan
a. Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis
b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis
c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis
d.. Mengetahui kegunaan/ aplikasi elekroforesis

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Prinsip dan Teori Elektroforesis

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan
mobilitas analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode
elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan
variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat.
pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif. keuntungan
utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari
pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas
Manz, et.al, 2010)

Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau

molekul dalam medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan.
media konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run
penyangga. campuran analit dimasukkan ke dalam medium yang mengandung
jangka penyangga dan medan listrik diterapkan. Dalam contoh yang
ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung molekul bermuatan
negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak
menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan
mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel
yang berbeda. sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam
medan listrik diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010)

3
 Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al,
2010)

Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam

larutan yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau
poliakrilamid gel. gratis pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit
digunakan. pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas,
perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit hanya dapat dipisahkan
jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. pemisahan analit
dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel
memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang
lebih kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya
dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam
ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Secara luas teknik ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis
free boundary, elektroforesis wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).

Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial,
fase tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau
anoda sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan
suatu ketidakhomogenen atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid,
protein enzim menunjukan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik
yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat
dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan
bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free
boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan
sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan
larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian
biarkan menyerap vertikal pada tabung elektroforesis yang akan digunakan,

4
sehingga terbentuk gradien perbedaan kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain
bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah
perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan temperatur. Pada
medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat
dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin,
butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga-rongga kapiler.
Kertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang
sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik
horizontal maupun vertikal dan interferensi anomali paling kecil pada boundary.
Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan
berdasarkan perbedaan transfor fisik zat terlarut yang bermuatan didalam medium
kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar, 2008).
Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-
partikel bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan
bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif
akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak
. Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006)
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut
akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada
bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang
terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan(Ricardson dkk. 1986):
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996
ektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan

5
molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar
muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986 Pemisahan
dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang
dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu
medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen
protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardsondkk. 1986).
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan
besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut
dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada
suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah
yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh oleh suatu partikel bermuatan sesuai
dengan :
𝑈𝑡𝑒 𝑈,𝑉
d= = (persamaan 2.1)
𝑞𝑘 𝐿
dimana V= tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U
= Mobilitas ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang
ditempuh (Kopkar, 2008).
Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama: mobilitas
elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas
Manz, et.al, 2010)

a. Mobilitas elektroforesis

Mobilitas elektroforesis μep merupakan parameter spesifik untuk senyawa

yang diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik
diterapkan. senyawa dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain.

Ketika pertukaran ion q diposisikan kedalam medan listrik E,

pengalamannya sebuah gaya listrik Fef:

6
 Fef = q.E (persamaan
2.2)

Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode

negative (katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda
negative (anoda). Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul
menengah. gaya ini berbanding lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi
elektroforesis, Vep serta viskositas medium, ἠ. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Ffr = 6 . ἠ . π . r. Vep (persamaan

2.3)
Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan
gaya listrik (persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan
konstan, Vep (persamaan 2.5).
Fef = Ffr (persamaan
2.4)
Vep = q.E (persamaan
2.5)
6. ἠ.π.r
Mobilitas elektroforesisμep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan
migrasi Vep atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). μep lebih sering
digunakan daripada VEP untuk menggambarkan migrasi ion.
μep = Vep / E = q.E (persamaan
2.6)
6. ἠ.π.r

Untuk media pemisahan diberikan viskositas adalah konstan. maka

mobilitas elektroforesis μep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti
yang disebutkan sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas
dasar rasio q / r, ketika mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam
medan listrik. perubahan pH penyangga mengubah muatan suatu analit dan
dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas Manz, et.al, 2010)

7
b. Aliran elektroosmosis (EOF)

Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti

kaca, menyatu silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan
yang paling bioanalitik, pH buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif
yang dihasilkan. Kelompok Silanol (-SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan
jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler menjadi negatif . Ini
menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi massal.
(Andreas Manz, et.al, 2010)

Dalam penerapan medan listrik kation dilapisan difus bergerak menuju

katoda dan tariksolusi massal dengan mereka. gerakan ini dari solusi massal
disebut aliran elektro osmosis. Dalam elektroforesis gel phenomenonof EOF juga
disebut sebagai electroendoosmosis. Kecepatan dari EOF ,VEOFberbanding lurus
dengan konstanta dielektrikdan potensizeta, dari buffer serta kekuatan medan
listrik diterapkan, E.Veof berbanding terbalik dengan viskositas buffe rpemisahan.

𝜺 . ᶊ. 𝑬
VEOF = ( persamaan 2.7)
𝟒 .𝝅.ἠ

μ EOF = VEOF / E (persamaan

2.8)

Seringkali arah mobilitas elektro osmosis dari solusi massal adalah

melawan arah dari iona nalit. Ini adalah karena bagi kebanyakan pemisahan
biomelecularion analit bermuatan negatif dan akan diseret ke araha noda
sedangkan EOF diarahkan katoda.

Profil aliran EOF memiliki bentuk plug. kecepatan aliran identik atas
seluruh diameter kapiler , kecuali untuk bergerak lebih lambat lapisan difus dekat
dengan dinding kapiler. Distribusi kecepatan homogeneusme minimalkan
pelebaran pita dan dengan demikian meningkatkan efisiensi pemisahan. Situasi
yang sangat berbeda terjadi dengan tekanan aliran didorong digunakan dalam

8
Chromatografy cair.di siniprofil aliran parabola kecepatan aliran memiliki
distribusi besar atas diameter kolom. Analit dalam arus tengah jauh lebih cepat
dari pada analit lebih dekat kedindingsaluran.Hasil ini dalam pelebaran pita dan
hilangnya efisiensi pemisahan.
c. Efisiensi Pemisahan dan Resolusi

Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh

aliran elektroforesis (EOF). mobilitasnyata μappdarisuatu analitditentukan

olehjumlah darimobilitaselektroforetiknyaμep dan

mobilitaselektroosmosisμEOF.(Andreas Manz, et.al, 2010)

μapp = μep + μEOF (persamaan 2.9)

JikaEOFmendominasigerakanelektroforesis, maka
semuakomponenanalitbergerak menujukatoda. mereka dipisahkandari satu sama

lainkarena perbedaanmereka dalammobilitasjelas. kationmemilikiμapp

tertinggikarenamerekaberada diarah yang samadenganμEOF. Spesiesnetraltidak

memilikiμep. Karenanya merekadiseretpadakecepatandari

solusimassal.Anionmencapaikatodaterakhir, μepnya menentangarahμEOF.

Kecepatan perpindahan ,V pada analit didefinisikan sebagai produk dari

mobilitas nyatanya , μapp, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8).

kekuatan medan, E, adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L.

Karena itu v, dapat dijelaskan sebagai:

v = μapp . E = (μep + μEOF ) . V/L (persamaan

2.10)

Waktu perpindahan, t, dari analit didefinisikan sebagai panjang kapiler , L,

kecepatan perpindahan ,v. Substitusi v untuk persamaan 3.9 menjadi:

9
 L2

t = L/v = (persamaan
2.11)

μapp . V

Oleh karena itu kekuatan medan listrik lebih besar , E, lebih cepat
velocitynya dan lebih cepat waktu perpindahannya. Pada elektroforesis , pelebaran

pita utamanya disebabkan ileh difusi longitudinal. Distribusi peak τ 2

berbanding

lurus dengan koefisien difusi, D dari analit dan waktu perpindahannya.

2 . D. L2

τ 2
= 2.D.t = (persamaan 2.12)

μapp. V

Jumlah plat teoritik N, pada elektroforesis dapat dijelaskan dengan:

μapp . V

N = L2 / τ 2
= (persamaan 2.13)

2. D

Jumlah plat tidak tergantung pada panjang kapiler dan waktu perpindahan.
Tegangan yang besar mentebabkan peningkatan dalam jumlah yang meningkat.
Dalam teori jutaan pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan elektroforesis
membuat teknik ini unggul dari LC, di mana jumlah plate per kolom biasanya di
urutan sepuluh ribu. Dalam prakteknya, bagaimanapun, plat nomor yang lebih
rendah diamati pada elektroforesis. pelebaran pita disebabkan oleh injeksi sampel

10
dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan yang mengarah ke plat nomor di
urutan ratusan ribu ketimbang jutaan .

Resolusi, Rs, antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas

elektroforesis antara dua spesies, ∆μep (yaitu selektivitas pemisahan), tegangan

pemisahan,V, mobilitas elektrofoersis nyata, μapp , dan koefeisien difusi, D.

1 1
Rs = ∆μep . √𝑉 .√ . (persamaan
μ 𝑎𝑝𝑝 4 .√2𝐷

2.14)

Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah

untuk meningkatkan selektivitas pemisahan∆μep. ini dapat dicapai misalnya
dengan mengubah pH buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis.
meningkatkan tegangan pemisahan, juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi
untuk molekul besar seperti ini memiliki koefisien difusi yang kecil

B. Jenis – Jenis Elektroforesis

Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan
konvensional yang telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih
canggih atau modern sebagai penyempurnaan dari metode koinvensional yang
sebelumnya. Adapun jenis-jenis elektroforesis yang dikenal 2 (dua) kelompok
teknik elektroforesis, yaitu:
a. Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak /
moving boundary)
Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik
isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh
larutan dan posisinya sebagai fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah
mahal dan pemamfaatan kurang.
b. Dengan pengemban padat atau matriks seperti:
- Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)

11
 - Elektroforesis Kertas
- Elektroforesis selulosa asetat
- Elektroforesis gel

1. Elektroforesis Zone (Elektroforesis Wilayah)

Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju
perpindahan elektroforesis wilayah, faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan
ion-ion adalah mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang
digunakan, kuat ion zat terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena
elektroforesis atau elektroosmosis. Medium yang umum digunakan adalah kertas
saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida dan bubuk gel (Kopkar,
2008).
Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat,
penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan
perubahan mobilitas atau konformasi.
2. Elektroforesis Kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion
kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.
3. Elektroforesis Tirai (elektroforesis kontinu),
Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara
kontinu. Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu
larutan buffer. Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel
masuk dalam aplikator dari suatu resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring
dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang elektroda. Dengan pemberian
tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen terpisahkan dalam
berbagai permukaan seperti pada gambar dibawah ini.

12
 Gambar 2.2 Elektroforesis Tirai ( Elektroforesis Kontinu), (Khopkar,
2008)

4. Elektroforesis Gel (GE)

Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi
molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR,
kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang
(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,
dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam

13
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur
(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif
alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan
(staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida,
perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk
keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya
setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.
Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut
dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak
setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari
"sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis
mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis
dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul
tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk
menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis
marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur
marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan

14
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma
ukuran molekul.
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel
agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan
elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus
diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di
medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif.
Pergerakan kecepatannya tergantung dari :
a. Ukuran molekul DNA
b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan
penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari
sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam
sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen

DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda
ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai
berikut.
a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom
b. DNA Fingerprinting
c. Mendeteksi kelainan genetik.
d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan
tertentu

15
 e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel
organisme atau percobaan perlakuan gen
f. Mempelajari evolusi tingkat molecular
g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam
h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan
protein tertentu.
i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan
DNA plasmid
k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE)

Gel Media
Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang
umum digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu :
mudah atau cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul
biologic, biaya pemisahan yang sangat besar.
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat
dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary
electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul

16
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi
dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari
molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis
daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa
dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose
poliasetat. Adapaun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah
disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan
vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat
sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.
Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida
dan menganalisis pemanjangan primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).
Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa
yang dapat diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa
dilarutkan dalam buffer yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan
dituangkan ke dalam tangki elektroforesis. pada pendinginan gelasi terjadi. pori-
pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm konsentrasi 1% (10 mg mL-1)
sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1). pori-pori besar hanya
terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam nukleat. untuk
sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.

Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen

cross-linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih.

17
ukuran pori dan sifat pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada
konsentrasi total serta tingkat silang C%

Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor

sebagaberikut:
1. Ukuran molekul DNA.
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak
yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.
2. Konsentrasi gel.
Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul
DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA
berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah
mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat
melewati gel.

4. Densitas muatan
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan
molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan
per unit volume molekul.
5. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati
gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh
molekul DNA.
6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal
tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik
sehingga migrasi DNA akan lebih cepat.

18
5. Elektroforesis Kapiler (CE)
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis
kapiler merupakan pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep
dasar elektroforesis kapiler adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan
sebagai partikel bermuatan (ion), baik bermuatan positif (kation) maupun
bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan kepada larutan molekul
bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju elektroda yang
berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda.
Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya
kertas atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan
berupa campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah
media tersebut. Salah satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina
atau batang karbon dengan kutub negatif arus searah dan larutan buffer lainnya
dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub positif
arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen campuran bermuatan listrik
maka komponen-komponen campuran tersebut bermigrasi ketika arus listrik
searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak menuju
katoda (kutub negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif
bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang
netral tidak bergerak. Hasil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan
oleh adanya noda-noda berwarna sepanjang media pemisah(Sumar Hendayana,
Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan
sederhana. Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang
satu dengan yang lain kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih
sebagai akibat dari noda-noda tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari
elektroforesis konvensional ini adalah tidak dapat mendeteksi konsentrasi

19
cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk melakukan satu
analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan dengan cara
menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini
disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga
menurunkan efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih
banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan
campuran yang lebih komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang
sangat sedikit dengan konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-
kendala yang terdapat pada elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan
modifikasi peralatan dan muncullah istilah elektroforesis kapiler(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
Aliran Elektroforentik.
Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan,
kation akan bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan
bergerak menuju anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak
akan bergerak. Aliran ion-ion menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut
aliran elektroforetik yang diperlihatkan dalam gambar 2. Aliran elektroforetik
inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam elektroforesa klasik (Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran

elektroforetik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Aliran elektroosmotik.

20
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan
media kertas atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan
buffer dipakai sebagai pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut
berkontak dengan larutan dalam air maka permukaan gelas akan dilapisi anion
(SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika dengan air sehingga permukaan
pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-kation yang berasal dari
buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan kedua pada
permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan
pipa kapiler tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan
kation yang cepat ke katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran
elektroosmotik diilustrasikan dalam gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.5. Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran

elektroosmotik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan
lebih dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian
secara keseluruhan aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam
kenyataannya semua molekul baik yang bermuatan maupun netral akan terbawa
ke katoda. Tentunnya ion positif (kation) bergerak menuju katoda paling cepat
karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran elektroosmotik. Molekul
netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling lambat karena
aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

21
 Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen
elektroforesis kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami
konsep gerakan ion-ion atau molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu
analogi. Aliran elektroosrnotik dapat dianalogikan sebagai aliran sungai yang
deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan sebagai ikan yang sedang berenang
ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan sebagai ikan yang
sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai ikan
mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam
sungai akan menuju ke hilir.
Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda
dipengaruhi oleh medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut

V = 𝜇ef E + 𝜇eo E (persamaan

2.15)
V menyatakan kecepatan solut menuju katoda, 𝜇 ef adalah mobilitas elektroforetik,
𝜇 eo adalah mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis

kapiler (sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Efisiensi Elektroforesis kapiler.
Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor
penentu keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler
menyerupai kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi,
semakin tajam suatu peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi
pemisahan elektroforesis dapat dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC,

22
efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dinyatakan dengan formula
berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
(𝜇𝑒𝑓 + 𝜇𝑒𝑜) 𝐸
N= (persamaan 2.16)
2𝐷
Seperti dalam persamaan, 𝜇 ef menyatakan mobilitas elektroforetik, 𝜇 ef
menyatakan mobilitas elektroforentik, 𝜇 eo adalah mobilitas elektroosmotik, E
adalah tegangan listrik yang diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik
dan koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin
efisien pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam
sistem elektroforesis sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih
cepat berdifusi lambat atau D besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi
lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N) dalam elektroforesis kapiler
berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil koefisien difusi
maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan semakin
baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik
tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai
puncaknya pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak
menyebabkan kenaikan harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi
menghilangkan panas yang ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya
efisiensi dalam elektroforesis konvensional diaktivkan oleh panas yang
ditimbulkan oleh tegangan listrik yang tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

C. Instrumentasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel
Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat
pendingin dan komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel.
pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau horizontal. catu daya
memberikan tegangan typi xallally 200-500 V dengan arus listrik cof 400
Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke dalam waduk penyangga di setiap

23
sisi gel. untuk sebagian pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa analit
bermuatan negatif. sehingga analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh
instrumen dalam kotak isolasi untuk melindungi pengguna dari tegangan
tinggi .
Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam
buffer elektrolit. gel vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau
Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan 3 sampai 10 cm panjangnya.
alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi panjang tipis di mana
beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi
pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam
tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang
memiliki panjang dan lebar sekitar 8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40
x 20 cm juga umumnya digunakan.

Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau

sukrosa solusi kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran
dengan penyangga di upper reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat
selama pengecoran dengan menggunakan sisir atau pembentuk yang tepat.
karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam bentuk pita yang
sempit dan lebar

Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol

temperatrue memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka
membantu untuk mengusir panas dan melindungi analit sensitif dari
degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan waktu beberapa jam.
setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada
divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.

24
Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk
horizontal; c. bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010)

Preparasi Sampel Dan Sistem Buffer

Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya

mengandung gliserol dan diterapkan pada sumur sampel. untuk menghindari
pemblokiran untuk gel sampel pori-pori harus tidak mengandung partikel padat.

25
konsentrasi tinggi dan garam dan penyangga dalam sampel dapat mengganggu
pemisahan elektroforesis. maka harus dijaga agar tetap minimum, biasanya, 50
nm. jumlah sampel yang diperlukan tergantung pada metode deteksi, jumlah khas
di ordee g. yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa
berkisar dari L ke Ml

Visualisasi Dan Deteksi

Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan

pewarnaan dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan
commomly digunakan adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan
alkohol asam ini temperatur tinggi pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam,
pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh jumlah mencuci langkah. Deteksi
batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan perak lebih sensitif
dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip dengan protografhy

Metode Gel Elektroforesis

A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE)

Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada

perbedaan ukuran protein dan berat molekul. protein yang benar-benar
didenaturasi dengan adanya deterjen anionik natrium dedocyl asetat (SDS).
Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan protein pada temperature
950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing seperti

ᵝmercapto etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder

dan tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS
dengan asam amino

B. Isoelektrik Focussing (IEF)

Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit

zwitterionic seperti protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka.
ief diterapkan untuk pemisahan dan pemurnian protein peptida dan asam

26
 amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose dan PA keduanya
digunakan pada metode IEF.

C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)

Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan

gel tunggal. Bagian yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu
dimensi, berikutnya yang lain akan terpisah sama dengan yang pertama.
Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau asam nukleat dapat
dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat dibandingkan
dengan database elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk
mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan
pengalaman personil dalam operasi.

2. Instrumen Elektroforesis Kapiler

Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang
terdiri dari beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan
rekorder(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.8 Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler

(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

27
Pipa Kapiler.
Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti
dengan pipa kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara
25-100 𝜇m dan panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan
panjang ternyata mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler.
Hal ini dapat diperhatikan pada gambar 2.9 dan 2.10

Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N)

elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N
(pada gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka
pemisahan semakin tidak efisien.

28
 Gambar 2.10 pengaruh panjang kapiler terhadap efisiensi (N)
elektroforesis
Kapiler((Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Buffer.
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler
tersebut tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit
untuk menghantarkan arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul.
Karena sutu molekul dapat bermuatan positif, negatif atau netral bergantung pada
pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat menahan pH. Dengan kata lain,
pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis. Hal ini dapat
ditunjukan pada gambar 2.11

29
 Gambar 2.11 Pengaruh pH buffer terhadap selektivitas pemisahan peptide
dengan elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Sumber arus.
Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt
tapi dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi
10.000-30.000 Volt seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju
katoda berbanding dengan tegangan listrik. Oleh karena itu tidaklah
mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler dapat dilakukan dalam
beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional dilakukan
mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi
efisiensi pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4.
Sistem Pemasukan Cuplikan
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung
pipa kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam
pipa kapiler dapat dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan
elektrokinetika yang masing-masing dapat diformasi dengan persamaan.
∆𝑝𝜋4𝑡𝐶
Q= (persamaan 2.17)
8𝜂𝐿
𝜇𝑒𝑓 + 𝜇𝑒𝑜)
Q=( (persamaan 2.18)
𝐿
Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua
ujung pipa kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran
tegangan listrik, C adalah konsentrasi cuplikan, 𝜂 adalah visikositas, 𝜇 ef dan , 𝜇 eo,
kuata rus, dan L adalah panjangh pipa kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan
ke dalam cuplikan maka dengan gaya kapilaritas cuplikan akan terisap dengan
sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di antara kedua ujung pipa kapiler.
Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali ke dalam larutan buffer.
Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa saat ketika salah
satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah

30
cuplikan akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan
mempengaruhi efisiensi elektroforesis kapiler pada gambar 2.12 dan 2.13.

Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak

dancyl leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana,
Ph.D, 2006).

Gambar 2.13 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap

efisiensi (N)
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

31
Detektor.
Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah
yaitu kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian
detektor dapat diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda.
Berbagai detektor telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil
pemisahan, antara lain spektrometri (seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor
elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri). Detektor UV diperlihatkan
dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa kapiler yang terbuat dari gelas
silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini memungkinkan pendeteksian
aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak perlu mengganggu
aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15 dapat
digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama
detector UV, detektor elektrokimia pada gambar 2.16.

Gambar 2. 14 Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D,

2006).
Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati
sinar UV maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya
yang diserap oleh solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.

32
 Gambar 2. 15 Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D,

2006).
D. Aplikasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel (GE)
Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang
ditunjukkan pada gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan
untuk visualisasi asam nukleat. Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar
pencampuran dijalankan secara paralel. Standar pencampuran mengandung
molekul dengan dasar berpasangan panjangnya. Pemisahan pattern dikandung
dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder. Jumlah dasar

33
 berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan pita
ke pita dalam barisan DNA.

Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari

Genomic DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida
2. Elekroforesis Kapiler (CE)
Analisis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar
daripada molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan
metode CE dan HPLC diperlihatkan pada gambar 2.17.

Gambar 2.17 Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode ( A)

CE dan B (HPLC) (sumber Anal, chem. 61, 1188, 1989)

34
 Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE
dilakukan pada pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer
dalam buffer citrate. Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8
(220 x 2 mm) dengan fas gerak 0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam
acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan jumlah peak yang lebih banyak daripada
peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi yang lebih baik daripada HPLC
untuk pemisahan peptide.
Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :
1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA,
setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga
membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu
cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk
PCR.
3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

E. Kelebihan dan Kekurangan dalam Elektroforesis

Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana,

digunakan untuk memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam
nukleat, asam amino dan karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah
dan sederhana. Akan tetapi memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang
rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan berlaku untuk senyawa yang
berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat arus searah yang relative
rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan tegangan listrik yang
searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan noda hasil
pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan
elektroforesis menjadi tidak terlalu jelas memisah.

35
 BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
1. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas
analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode
elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel
dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat.
2. Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-
partikel bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf
akan bergerak kekutub positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan
listrik positif akan bergerak kekutub negative (katoda). Sementara partikel
netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan pada
metode elektroforesis.
3. Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah),
elektroforesis kertas, elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler
4. Gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah gel agarosa dan Gel
poliakrilamida
5. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang,
misalnya :di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan
DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari.
Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.Dalam
kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara
untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk
PCR.Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.
B. Saran
Adapun saran dan masukkan dari para pembaca sekiranya bersifat
membangun untuk menyempurnakan makalah ini.

36
 DAFTAR PUSTAKA

Andreas Manz, et.al, 2010, “Bioanalytical Chemistry” published by Imperial

College Press, London

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher,

Oxford: xvi + 175 hlm.

Richardson, b. J, p. R. Baverstock and m. Adams 1986. Allozyme electro-

phoresis. A handbook for animal sys- tematics and population studies. Aca-
demic press, inc. San diego : 410 pp. Sambrook, j. & d. W. Russell. 2001.
Molecular cloning: a laboratory manual vol 2. 3rd ed. Cold spring harbour
laboratory press, new york: xvii + 3.4--14.53 + 1.44

Rothe, g. M. 1995. Electrophoresis of enzymes. Springer - verlag. Berlin

heidelberg: 278 pp. Hlm.

S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.

Sumar Hendayana , PH.D. 2006, “ Kimia Pemisahan Metode kromatografi dan

Elektroforesis Modern “ PT. Remaja Rosdakarya.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth

Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.

file:///D:/Kelebihan%20Dan%20Kekurangan%20Elektroforesis.htm.
Sumber:Dr.Endang Saepuddin dan Dra. Siswati Setiasih Msi.Apt. 2009.Handout
Kuliah Bioteknologi, Diaccess pada tanggal 15 Mei 2013.

37