MAKALAH

Dasar-Dasar Rekayasa Genetik

“Isolasi dan Pemurnian DNA dan RNA ”

Oleh:
Musrifah Tahar
H311 13 035

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2016
 KATA PENGANTAR

Tiada untaian kata yang lebih indah selain ucapan syukur ke hadirat Allah

SWT yang telah melimpahkan karunia, taufik, hidayah, serta inayah-Nya,

sehingga makalah ini dapat terselesaikan. Tidak lupa pula senantiasa kita

panjatkan salawat serta salam kepada junjungan dan panutan kita Muhammad

SAW. Dalam penyusunan makalah ini, disadari bahwa dalam tahap

penyusunannya, tidak terlepas dari berbagai kendala yang menghambat

penyusunan. Namun berkat bantuan dan motivasi dari berbagai pihak, sehingga

kendala dan halangan tersebut dapat teratasi.

Ucapan terima kasih saya sampaikan kepada dosen mata kuliah, teman-

teman, serta pihak – pihak lainnya yang telah membantu dalam menyelesaikan

makalah ini yang tidak sempat disebutkan.

Dalam penulisan ini masih terdapat kekurangan, oleh karena itu, kritik dan

saran yang sifatnya membangun sangat saya harapkan. Walau demikian, saya

tetap berharap makalah ini dapat memberikan manfaat.

Amin.

Makassar, 16 Maret 2016

PENYUSUN
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL……………………………………………………………i

KATA PENGANTAR………………………………………………………….ii

DAFTAR ISI…………………………………………………………..……….iii

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang………………………………………...………….………....1

1.2 Rumusan Masalah……………………………...………………….…….......3

1.3 Tujuan………………………………………………………….....................3

BAB II. PEMBAHASAN

2.1 Isolasi dan Pemurnian DNA/RNA....................……..…………...…………4

2.2 Prinsip isolasi DNA/RNA .............................................................................5

2.3 Langkah-Langkah Isolasi DNA/RNA ..........................................................6

2.4 Uji Kualitas dan Kemurnian DNA ...............................................................11

BAB III. PENUTUP

3.1 Kesimpulan………………………………………………………...………13

3.2 Saran……………………………………………………………...………..13

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………….....……...14
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok

basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimdin.

Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin,

dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin

berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. Molekul molekul yang

berisi ikatan demikian itu mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah

struktur kimia yang berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai

kebebasan tertentu (Restu dkk., 2012).

Studi genetik terutama studi populasi genetik terhadap jenis tumbuhan

hutan tropis berlangsung sangat lambat, disebabkan oleh banyak kesulitan yang

menghambat seperti penyediaan sampel segar setelah dibawa dalam perjalanan

jauh sering menginduksi senyawa fenol dan polisakarida pada jenis tumbuhan

berkayu. Senyawa-senyawa tersebut dapat mengontaminasi sediaan DNA dan

akan menghambat analisis lebih lanjut. Ekstraksi untuk mendapatkan DNA

berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam

analisis molekuler. Masalah-masalah dalam ekstraksi DNA masih merupakan hal

penting yang perlu diatasi (Restu dkk., 2012).

Berbagai teknik analisis dalam pemuliaan tanaman dan biologi molekuler

yang berdasarkan pada hibridisasi molekuler atau Polymerase Chain Reaction

(PCR) membutuhkan DNA dalam jumlah yang cukup dan kualitas yang baik.

Oleh karena kandungan senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda-beda, maka
setiap tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA

genom yang dapat digunakan sebagai bahan dalam analisis molekuler. Optimasi

prosedur tersebut dapat dilakukan terhadap komposisi larutan buffer lisisnya

ataupun teknik penanganan fisik dalam pemisahan DNA genom dari senyawa lain.

Pada prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan melindungi DNA genom dari

degradasi akibat senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan atau

kerusakan akibat penanganan fisik (Milligan 1992).

Modifikasi genetik suatu organisme baru bisa dilakukan sejalan

dengan penemuan dan pengembangan berbagai teknik dalam biologi molekuler.

Antara lain teknik isolasi dan pemurnian DNA, penemuan enzim restriksi

endonuklease, enzim DNA polimerase dan DNA ligase, penemuan DNA plasmid

dan teknik transfer DNA, teknik deteksi DNA, teknik pemetaan gen, dan teknik

kultivasi (Radji, 2011).

Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara

lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang,

daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari

berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama.Isolasi DNA

merupakan langkah tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu

Sentrifugasi dan Presipitasi (Juwita dan Sinaga, 2012).

Maka disusunlah makalah ini untuk mengetahui bagaimana cara

mengisolasi dan memurnikan DNA/RNA serta mengidentifikasinya dengan

menggunakan beberapa alat instrumen.

B. Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dalam makalah ini, yaitu:

1. Apa yang dimaksud dengan isolasi dan pemurnian DNA/RNA?

2. Bagaimana prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA/RNA?

3. Bagaimana teknik isolasi DNA/RNA?

4. Bagaimana teknik pemurnian DNA/RNA?

5. Bagaimana cara Uji Kualitas dan Kemurnian DNA?

C. Tujuan

Adapun tujuan dalam penulisan makalah ini, yaitu:

1. Untuk mengetahui isolasi dan pemurnian DNA/RNA

2. Untuk mengetahui prinsip-prinsip dalam isolasi DNA/RNA

3. Untuk mengetahui teknik isolasi DNA/RNA

4. Untuk mengetahui teknik pemurnian DNA/RNA

5. Untuk mengetahui cara Uji Kualitas dan Kemurnian DNA

 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Isolasi dan Pemurnian DNA/RNA

Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuan asal Swiss

bernama Friedrich Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa

asam yang mengandung nitrogen dan fosfat pada inti sel dari sel darah

putih. Senyawa ini diberi nama nuklein, namun pada tahun 1889 muridnya

yaitu Richard Altmann menamainya asam nukleat. Metode yang digunakan

oleh Miescher adalah alkalyne lysis untuk memecahkan sel dan mengisolasi

DNA (Muladno, 2002).

Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni dari

makhluk hidup untuk keperluan bioteknologi. Isolasi DNA merupakan suatu

proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan

pemeriksaan atau diagnosA (Chawla,2000). Secara spesifik untuk mengisolasi

DNA yang mencakup gen tertentu dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu:

 Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom menggunakan

enzim endonuklease retriksi.

 Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen yang dimaksud

kemudian dilanjut dengan membuat turunan (Complementery DNA/cDNA),

 Mensintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen sintetik)

dengan teknik sintesis kimiawi.

 Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain Reaction).

 Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni

yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNA dapat di

isolasi dari berbagai sal yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti

sel. beberapa sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah

urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya (Adityawarman, 2010).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari

DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan

membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah

organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada

nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana

metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan

adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pada

dasarnya isolasi DNA genom total dari sel bakteri.

2.2 Prinsip isolasi DNA/RNA

Isolasi DNA merupakan tahap penting dalam setiap eksperimen. Isolasi

DNA merupakan pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel,

membran sel, dan membran inti sehingga dapat dilihat strukturnya. Molekul DNA

dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan

seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA

dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,

lemak, dan karbohidrat.

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),

ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA. Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu

diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA

tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan

bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah

struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

2.3 Langkah-Langkah Isolasi DNA/RNA

1. Isolasi dan Purifikasi DNA Genom

Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan

adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri.

Pada dasarnya isolasi DNA genom total dari sel bakteri terdiri dari beberapa

tahap yaitu:

1.Kultivasi sel dalam media yang sesuai

2.Pemecahan dinding sel

3.Ekstraksi DNA genom

4.Purifikasi DNA

Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya

dengan cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan

enzim lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari

keduanya. Pada kondisi tertentu pemecahan dinding sel cukup dilakukan

dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi sering ditambahkan bahan lain yang

dapat melisiskan dinding sel antara lain deterjen triton X-100 atau sodium

dedosil sulfat (SDS). Setelah sel mengalami lisis, tahap selanjutnya adalah

memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi. Komponen sel yang tidak
larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel dalam

supernatan yang jernih (Radji, 2011; Thermo Scientific, 2009).

Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Disamping

DNA, ekstrak sel mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup

besar. Umumnya cara pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan

fenol atau campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1, untuk

mengendapkan protein dengan cara di sentrifugasikan dan dihancurkan secara

enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih

tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan

DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian

dimurnikan dengan cara “presipitasi etanol”. Dengan adanya larutan garam

(kation monovalen seperti Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat

mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara

sentrifugasi (Radji, 2011; Thermo Scientific, 2009).

Pada isolasi dan purifikasi DNA sel total yang berasal dari sel eukariot,

misalnya sel tanaman atau sel hewan, walaupun pada dasarnya tahapan isolasi dan

purifikasinya sama, namun memerlukan suatu modifikasi cara isolasi sehubungan

dengan sifat-sifat khusus dari sel yang digunakan. Modifikasi yang sering

dilakukan adalah pada proses pemecahan sel eukariot. Senyawa kimia yang

digunakan untuk memecah sel bakteri tidak selalu dapat digunakan untuk

memecah sel tanaman maupun sel hewan. Untuk memecah sel tanaman

dibutuhkan ezim-enzim degeneratif yang spesifik dan sering dikombinasi dengan

cara pemecahan dinding sel secara fisik antara lain menggunakan butiran-butiran

gelas. Sedangkan untuk mengisolasi DNA total dari sel hewan yang tidak
memiliki dinding sel umumnya hanya digunakan deterjen untuk memecah

membran sel dan membran nukleusnya (Radji, 2011).

2. Isolasi dan Purifikasi DNA Plasmid

Isolasi dan purifikasi DNA plasmid dari sel bakteri pada dasarnya

sama dengan cara isolasi DNA genom. Sel bakteri yang mengandung DNA

plasmid dibiakkan dan dipanen. Sel bakteri dilisiskan dengan penambahan

deterjen dan enzim lisozim, kemudian disentrifugasi untuk memisahkan debris sel

dengan ekstraksel.

Proses selanjutnya adalah memisahkan protein dan RNA dari DNA

plasmid. Namun demikian terdapat perbedaan penting dalam isolasi DNA

plasmid dengan isolasi DNA genom. Isolasi DNA plasmid memperhatikan

keberadaan DNA genom yang berasal dari sel bakteri. Pemisahan antara DNA

plasmid dengan DNA genom sangat penting untuk dilakukan apabila DNA

plasmid akan digunakan sebagai Vektor kloning. Adanya sedikit kontaminasi

DNA genom bakteri dalam jumlah kecil pun dapat mempengaruhi keberhasilan

kloning DNA (Radji, 2011; Thermo Scientific, 2009).

Beberapa cara untuk menghilangkan DNA genom pada pemurnian DNA

plasmid telah banyak dikembangkan. Cara pemisahan DNA plasmid dengan DNA

genom pada prinsipnya berdasarkan ukuran dan konformasinya. Ukuran DNA

plasmid sangat kecil bila dibandingkan dengan ukuran DNA genom. Ukuran

DNA plasmid yang terbesar, kurang dari 8% ukuran DNA genom bakteri, dan

sebagaian besar DNA plasmid berukuran lebih kecil daripada ukuran tersebut.

Dengan demikian teknik yang dapat memisahkan molekul DNA yang kecil
dengan DNA yang berukuran besar akan sangat efektif untuk memisahkan DNA

plasmid (Radji, 2011).

Salah satu cara yang lazim digunakan untuk memisahkan DNA plasmid

dengan DNA genom adalah dengan menggunakan cara sentrifugasi gradient

densitas. Teknik sentrifugasi gradient densitas etidium Bromida sesium klorida,

yang berkecepatan tinggi, merupakan cara yang sangat efektif untuk memperoleh

DNA plasmid murni. Dengan teknik tersebut DNA plasmid akan membentuk pita

pada titik tertentu yang terpisah dengan pita genom, dimana protein akan

mengapung pada permukaan gradient, dan RNA akan berada pada dasar tabung.

Posisi pita-pita DNA dalam tabung bisa terlihat melalui pendaran etidium bromida

yang disinari dengan ultra violet. DNA plasmid dapat diambil dengan

menusukkan jarum suntik pada dinding tabung dimana pita DNA plasmid terlihat

dan menyedotnya. Sedangkan etidium bromida yang terikat pada DNA plasmid

dapat diekstraksi dengan n-butanol, dan CsCl dihilangkan dengan cara dialisis.

Teknik pemisahan ini dapat memperoleh DNA plasmid murni yang dapat

digunakan sebagai vektorkloning (Radji, 2011).

2.4 Uji Kualitas dan Kemurnian DNA

Kuantifikasi dan analisa kualitas DNA/RNA diperlukan untuk mengetahui

kemurnian dan jumlah konsentrasi DNA/RNA yang diisolasi. Kualitas DNA/RNA

terbaik menunjukkan keadaan DNA/RNA bebas dari kontaminasi seperti

kontaminasi protein dan garam yang terdapat pada DNA/RNA yang diisolasi.

Kuantitas DNA/RNA menunjukkan konsentrasi DNA/RNA.

1. Elektroforesis

Elektoforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan

listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan

dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang

ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul

yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus

listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul

tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak

molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan

gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan

kondisi elektris lingkungan. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk

memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Ada dua jenis

elektroforesis yaitu :

a. Elektroforesis kertas

Elektoforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi

konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas

tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas

zat terlarut.

b. Elektroforesis gel

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai

fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel

dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan

biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel

berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

2. Spektrofotometri

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap

cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm, sedang

kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada λ 280 nm. Dengan

adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat

diukur dengan menghitung nilai absorbansi λ 260 nm dibagi dengan nilai

absorbansi λ 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0

(Fatchiyah, 2011). Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih

mengandung kontaminan dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar

DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang

diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit.

 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dalam makalah ini dapat disimpulkan bahwa Isolasi DNA dapat

dilakukan berdasarkan prinsip sentrifugasi dan presipitasi dengan langkah-langkah

yaitu ekstraksi sel, pemurnian, dan pemekatan yang kemurniannya dapat dilihat

dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis.

B. Saran

Dengan adanya makalah ini diharapkan para pembaca dapat

mengetahui lebih banyak lagi tentang isolasi dan pemurnian DNA/RNA

serta manfaat-manfaatnya guna menambah wawasan untuk pembelajaran.

 DAFTAR PUSTAKA

Adityawarman, 2010, Definisi Isolasi DNA,

Chawla, H. S., 2003. Plant Biotechnology: A Practical Approach. Science

publisher.Inc Plymouth.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan

Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya,
Malang.

Juwita, Sinaga, R. N., 2012, Laporan Praktikum Isolasi DNA dan Teknik PCR,

Milligan, B.G. 1992. Plant DNA Isolation. In: A.R. Hoelzel (Ed). Molecular
Genetic Analysis of Populations. A Practical Approach. Oxford University
Press. New York:

Muladno, 2002, Seputar Teknologi Rekayasa Genetika, Pusataka Wirausaha

Muda, Bogor.

Radji, M. (2011). Rekayasa Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan.

Sagung Seto, Jakarta.

Restu, M., Mukrimin, Gusmiati, 2012, Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi
DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman
Genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD),
Jurnal Natur Indonesia, 14 (2); 138-142.

Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase

Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.

Thermo Science. (2009). Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical

Handbook; Featuring Cell Lysis Reagent and Detergents, Ver.2.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Berlin, Heidelberg,

New York: Springer-Verlag.