KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT berkat

rahmat, hidayah dan karunia-Nya sehingga penulis berhasil menyelesaikan

makalah dengan judul “Teknik Isolasi, Pemurnian dan Pembacaan Urutan

Asam Amino pada Molekul Protein”.

Makalah ini dapat terselesaikan atas bantuan dari berbagai pihak. Oleh

karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih yang

sebesar-besarnya kepada segala pihak yang telah membantu menyelesaikan

makalah ini. Penulis menyadari bahwa makalah ini masih kurang sempurna maka

saran dan kritik yang bersifat membangun dari semua pihak sangat diharapkan

demi penyempurnaan selanjutnya.

Harapan penulis, semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi semua

pihak, khususnya bagi penulis dan para pembaca, semoga Allah SWT meridhoi

dan dicatat sebagai ibadah disisi-Nya,

Tanjungpinang, 21 Maret 2019

Tim Penulis
 DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ............................................................................................. iii

BAB I PENDAHULUAN ......................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................... 2

1.3 Tujuan Penulisan ..................................................................... 2

BAB II ISI DAN PEMBAHASAN ........................................................... 3

2.1 Isolasi Protein .......................................................................... 3

2.2 Pemurnian Protein ................................................................... 6

2.3 Teknik Analisis Pembacaan Urutan Asam Amino .................. 10

BAB III KESIMPULAN DAN SARAN .................................................. 19

3.1 Kesimpulan.............................................................................. 19

3.2 Saran ........................................................................................ 19

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 20

ii
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kata protein berasal dari protos atau proteos yang berarti pertama atau

utama. Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan

atau manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein

yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan

dan pertumbuhan tubuh. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan

baik, karena adanya enzim, suatu protein yang berfungasi sebagai biokatalis

(Anonim, 2011).

Pemurnian protein adalah serangkaian proses yang yang dimaksudkan

untuk mengisolasi satu jenis protein dari campuran kompleks. Pemurnian protein

sangat penting untuk karakterisasi struktur, fungsi dan interaksi dari suatu protein.

Bahan awal biasanya adalah jaringan biologis atau budaya mikroba. Berbagai

langkah dalam proses pemurnian dapat bebas protein dari matriks yang batas-

batas itu, memisahkan protein dan bagian non-protein campuran, dan akhirnya

memisahkan protein yang diinginkan dari semua protein lainnya. Langkah

Pemisahan dapat mengeksploitasi perbedaan (misalnya) protein ukuran, sifat

fisika-kimia, afinitas mengikat dan aktivitas biologis.

Metode yang digunakan dalam pemurnian protein secara umum dapat dibagi

menjadi 2 yaitu metode analisis dan preparatif. Metode analisis bertujuan untuk

mendeteksi dan mengidentifikasi protein dalam campuran, sedangkan metode

preparatif bertujuan untuk menghasilkan jumlah besar protein untuk keperluan

lain, seperti biologi struktural atau penggunaan industri.

1
1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dalam makalah ini ialah sebagai berikut :

1. Bagaimana teknik isolasi protein?

2. Bagaimana proses pemisahan dan pemurnian protein?

3. Bagaimana pembacaan urutan asam amino pada protein?

1.3 Tujuan Penulisan

Adapun tujuan dalam makalah ini ialah sebagai berikut :

1. Mengetahui teknik isolasi protein

2. Mengetahui proses pemisahan dan pemurnian protein

3. Mengetahui pembacaan urutan asam amino pada protein

2
 BAB II

ISI DAN PEMBAHASAN

2.1 Isolasi Protein

Isolasi protein merupakan salah satu cara memisahkan protein dari

makromolekul yang lain atau memisahkan protein dari protein lain yang tidak

diinginkan. Secara sederhana proses dari suatu isolasi protein memiliki konsep

yang sama dengan isolasi DNA namun yang membedakan yaitu pada isolasi

protein menggunakan buffer lysis untuk melisiskan sel. Suatu teknik isolasi dan

identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan

kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya

tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki

daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan ammonium sulfat.

Sumber produk untuk isolasi protein terdapat pada hewan, tumbuhan dan

mikroorganisme. Sel hewan umumnya lebih mudah dipecah dibandingkan dengan

sel tanaman karena sel hewan tidak berdinding sel, sedangkan tanaman berdinding

sel selulosa. Proses isolasi dimulai dengan mengetahui letak ataupun lokasi

produk yang akan diisolasi yaitu berada pada intrasel, ekstrasel ataupun terikat

pada membran. Proses isolasi ekstraseluluer lebih mudah dibandingkan dengan

intraseluler. Isolasi ekstraseluler umumnya hanya melakukan pemisahan

berdasarkan sifat fisik.

Pada proses pelisisan sel terdapat dua langkah yang digunakan yaitu metode

mekanik dan kimiawi. Untuk metode mekanik dapat dilakukan dengan

homogenisasi tingkat tinggi, ekstruksi tekanan tinggi, metode blending,

3
pengerusan dan sonikasi. Sedangankan untuk metode kimiawi dapat dilakukan

dengan penambahan larutan buffer, detergen, kelator dan inhibitor protease.

Metode yang umum digunakan pada pelisisan sel langkah mekanik yaitu

pengerusan yang berfungsi untuk memecah dinding sel dan memperluas

permukaan sampel agar dapat mempermudah proses ekstraksi sehingga interaksi

antara sampel dan pelarut akan semakin luas.

Setelah melakukan pelisisan sel maka langkah selanjutnya yaitu sentrifuge

namun sebelum itu dilakukan penambahan ammonium sulfat yang bertujuan

untuk presipitasi garam secara salting out, sehingga menyebabkan interaksi

hidrophobik antar molekul protein. Interasi hidrophobik antar molekul protein

akan mengakibatkan kelarutan protein menjadi rendah dan akan mengakibatkan

penggumpalan, sehingga mudah dapat dipisahkan dengan sentrifuse. Penggunaan

amonium sulfat lebih didasarkan pada sifat kelarutannya yang tinggi, tidak

merusak struktur protein.

Sel

Lisis Sel

Sentrifugasi

Presipitat Supernatan

Gambar 1. Skema Analisis Protein

4
 Adapun beberapa contoh langkah kerja isolasi protein dari hewan dan

tumbuhan sebagai berikut:

Isolasi Protein Hewan. Langkah kerjanya yaitu memotong kecil- kecil

organ hati, limpa, dan jantung sebanyak 1 gram. Kemudian menggerusnya dengan

mortal dan pastle dalam keadaan dingin (pemecahan secara mekanik) sambil

menambahkan dengan buffer ekstraksi sebanyak 300- 500 μl (pemecahan secara

kimiawi). Memasukkan homogenate kedalam tabung Eppendorf, dan di vorteks

selama 10 menit. Dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000

rpm selama 15 menit. Memisahkan antara supernatan dan peletnya. Mengambil

supernatannya dan menambahkan dengan etanol absolut dingin dengan

perbandingan 1:1.setelah itu menginkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada

suhu 4 oC untuk pemisahan etanol dan proteinnya Mensentrifugasi selama 15

menit pada kecepatan 10.000 rpm Mengambil endapan dan mengeringkan hingga

bau etanol hilang,serta menambahkan buffer Tris-HCL 20 mM sebanyak 100 μl

untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Setelah proses tersebut

akan mendapatkan ekstrak protein kasar. Mengukur kadar protein hasil ekstraksi.

Pertama membuat larutan blanko yang terdiri dari 200 μl larutan Bradford dan

ditambah 800 μl akuades. Kedua membuat larutan sampel yang terdiri dari 10 μl

protein sampel hasil isolasidan 200 μl larutan Bradford, serta ditambah 790 μl

akuades. Mengukur nilai OD protein sampel dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 595 nm. Menghitung konsentrasi protein dengan rumus Y=

0,0465 X – 0,0157 ( Y adalah nilai OD, X adalah konsetrasi protein). Supernatan

disimpan dalam refrigerator -20% sampai dilakukan elektroforesis.

5
 Isolasi protein dari tanaman. Langkah kerjanya yaitu empat spesies

spons dipotong-potong kecil lalu ditimbang sebanyak 500 gram kemudian

dihomogenisasi dengan blender menggunakan pelarut buffer A (Tris-HCl 0,1 M

pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; -merkaptoetanol 1 %; Triton X-100 0,5 %)

kemudian disaring pada corong Buchner kemudian filtrate yang diperoleh

dibekukan cairkan 2 sampai 3 kali lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm 4 oC

selama 30 menit selanjutnya supernatanya disimpan pada lemari es sebelum

dilakukan proses pemurnian dan penelitian selanjutnya.

Isolasi protein dari tanaman. Langkah Kerjanya yaitu daun sebanyak 0,1

gram digerus dengan ditambahkan 500 µL ekstrak buffer dalam keadaan dingin.

Homogenate yang dihasilkan dipindahkan ke eppendorf yang telah diisi dengan

250 µL ekstrak buffer. Homogenate ditambahkan dengan 26 µL PMSF 40 mM

dan diinkubasi selama satu jam dalam refrigerator dengan dishaker sekali 15

menit. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C.

Supernatan yang didapatkan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan disimpan

dalam refrigerator. Pellet disuspensikan dengan menambah 500µL ekstrak buffer

dan 26µL PMSF 40 mM (6,97 mg PMSF dalam 1 ml dMSO) Inkubasi pada suhu

40C selama satu jam dan digoyang sekali 15 menit. Sentrifugasi pada 13.000 rpm

selama lima menit dengan suhu 40C. Supernatan yang didapatkan dicampur

dengan supernatant pertama dan diendapkan dengan TCA 20% (1 ml volume

supernatan berbanding dengan 200 µL TCA 20% Inkubasi pada suhu -200C

selama satu jam. Campuran kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm dengan

suhu 40C selama lima menit, Supernatan yang didapatkan dibuang dan peletnya

dicuci dengan menambahkan 1000 ml aceton absolute, Sentrifugasi dengan

6
13.000 rpm 40C selama satu menit. Pellet yang didapatkan dicuci kembali dengan

menambahkan 1000 ml aceton absolute, Sentrifugasi 13.000 rpm 40C satu menit.

Pellet yang didapatkan adalah protein, untuk menghilangkan aseton pellet

dikering anginkan. Protein yang didapatkan dilarutkan dengan 15 µL aquabides

dan selanjutnya dielektroforesis.

2.2 Pemurinan Protein

Pemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal dari

dari satu campuran kompleks. Pemurnian ini bertujuan untuk mengetahui

lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika suatu senyawa yang

terdapat di bahan alam, sehingga diperoleh senyawa protein dalam keadaan

murni. (Mayes, P.A et al, 1990)

Setelah melalui isolasi, tahap yang selanjutnya adalah memisahkan protein

dari senyawa yang berbobot molekul rendah yang berada dalam ekstrak sel

dengan proses dialisis. Protein merupakan molekul yang berukuran besar, hal ini

menyebabkan molekul protein akan terjebak di dalam kantong membran dialisis

sementara molekul molekul kecil akan berdifusi dengan sendirinya keluar dari

kantung membran. Selanjutnya dapat dilakukan pemisahan protein yang

diinginkan berdasarkan ukuran atau muatannya (Lehninger 1982).

Metode yang sudah umum digunakan dalam pemisahan protein

berdasarkan ukurannya adalah filtrasi gel. Pada filtrasi gel protein akan dialirkan

pada butiran berpori kecil dari polimer hidrofilik. Protein yang berukuran kecil

akan teradsorb pada pori sementara protein yang berukuran besar akan keluar

lebih dulu. Sementara itu pemisahan berdasarkan muatan protein dapat dilakukan

dengan metode kromatografi penukar ion. Kromatografi penukar ion akan

7
memisahkan protein berdasar perbedaan densitas dan tanda muatan listrik pada

pH tertentu (Bollag et al 1996).

Gambar 2. Ilustrasi dua metode kromtografi.

(A) Kromatografi penukar ion: muatan protein digunakan dalam pemurnian
protein. (B) Filtrasi gel: fraksinasi protein berdasarkan ukuran
(Hedhammar, 2005)

Ilustrasi mengenai filtrasi gel dan kromatografi penukar ion dapat diamati

pada Gambar 1 diatas. Setelah proses permurnian protein, masih harus dilakukan

langkah untuk memastikan apakah kemurnian protein sudah mencapai tingkat

kemurnian yang diinginkan atau belum. Tingkat kemurnian protein yang

diinginkan umumnya dipastikan dengan metode elektroforesis gel poliakrilamid

natrium dedosil sulfat (SDS PAGE). Protein akan terdenaturasi menjadi

subunitnya, kemudian protein akan terpisah berdasarkan ukurannya. Melalui

metode elektroforesis SDS PAGE ini dapat diketahui apakah protein yang

8
diisolasi merupakan protein dengan bobot molekul yang diinginkan dan apakah

masih terdapat molekul protein nontarget (Koolman & Roehm 2005).

Gambar 3. Pemisahan Molekul dengan SDS PAGE

Prinsip dasar analisis dengan SDS PAGE ialah :

1. Larutan protein yang akan dianalisis dicampur dengan SDS terlebih dahulu,

SDS merupakan detergen anionik yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki

muatan negative dalam range pH yang luas. Muatan negative SDS akan

mendenaturasi sebagian besar struktur kompleks protein, dan secara kuat

tertarik kearah anoda bila ditempatkan pada suatu medan elektrik.

2. Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui gel poliakrilamid

menuju kutub poitif (anoda), molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat

daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan.

3. Pada proses elektroforesis dengan SDS dilakukan di dalam gel polyacrilamide,

molekul protein akan melewati pori-pori gel, sehingga kemudahan pergerakan

melalui pori tergantung pada diameter molekul.

9
4.Molekul yang lebih besar akan tertahan dan akibatnya bergerak lebih lambat.

Karena molekul terdenaturasi, diameternya tergantung dari berat molekulnya,

semakin lambat gerakannya.

5. Dengan demikian, SDS-PAGE akan memisahkan molekul berdasarkan BM-

nya.

2.3 Teknik Analisis Pembacaan Urutan Asam Amino

2.3.1 Pemecahan Urutan Asam Amino

Terdapat 6 tahap untuk memecahkan urutan asam amino pada rantai

polipeptida, yaitu:

Tahap 1. Penentuan Komposisi Asam Amino

Semua ikatan peptida dihidrolisis dari polipeptida murni. Campuran asam

amino yang terbentuk dianalisis dengan khromatografi pertukaran ion untuk

menetukan asam amino mana yang ada dan jumlah relatif masing-masing.

Tahap 2. Identifikasi Residu Terminal Amino dan Karboksil

Dengan mengidentifikasi residu terminal amino dan karboksil, kita dapat

menentukan 2 titik acuan penting dalam deret asam amino. Untuk

mengidentifikasi residu terminal karboksil, polipeptida diinkubasi dengan enzim

karboksipeptidase yang menghidrolisis ikatan peptida pada ujung

terminalkarboksil. Sedangkan untuk mengidentifikasi residu terminal amino

Sanger menggunakan pereaksi 1-fluoro-2,4-dinitrobenzena yang dapat mencirikan

residu terminal-amino dari rantai polipeptida sebagai turunan 2,4-dinitrofenil

(DNP) berwarna kuning. Jika turunan DNP polipeptida ini dihidrolisis oleh asam,

semua ikatan peptida pada rantai akan terhidrolisis kecuali ikatan kovalen antara

gugus 2,4-dinitrofenil dan gugus α amino sehingga mudah dipisahkan dari asam

10
amino bebas yang tidak tersubtitusi. Selain itu, dansil-khlorida dapat digunakan

sebagai pereaksi untuk mencirikan gugus α amino. Pereaksi ini akan bereaksi

dengan gugus α amino bebas untuk menghasilkan turunan dansil.

Tahap 3. Pemotongan Rantai Polipeptida

Untuk memisahkan fragmen-fragmen peptida umumnya digunakan metode

hidrolisis enzimatik dengan enzim. Salah satu cara yang sering digunakan

memotong polipeptida mnjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil adalah dengan

hidrolisis oleh enzim tripsin. Tripsin adalah enzim pencernaan yang diproduksi

oleh pancreas. Enzim ini menghidrolisisikatan peptida pada sisi karboksil residu

lisin dan arginin (bermuatan positif):

Tripsin

R1 Lys Ala R2 R1 Lys COO- + NH3+ Ala R2

Gambar 4. Pemotongan Protein oleh Tripsin

Enzim lain yang biasa digunakan untuk pemotongan protein secara selektif adalah

kimotripsin . enzim kimotripsin mnghidrolisis ikatan peptide pada sisi karboksil

residu aromatik (fenilalanin, tirosin, dan triptofan) :

Kimotripsin

R1 Phe Ser R2 R1 Phe COO- + NH3+ Ser R2

Gambar 5. Pemotongan Protein oleh Kimotripsin

Fragmen yang dihasilkan kemudian dipisahkan dengan khromatografi

pertukaran ion pada kolom tertentu sehingga menghasilkan map peptida.

11
Tahap 4. Identifikasi Deret Fragmen Peptida

Tahap ini menggunakan prosedur degradasi Edman untuk mencirikan dan

mengeluarkan hanya residu terminal-amino dari peptida dan membiarkan semua

ikatan peptida yang lain tetap utuh. Asam amino pertama dalam urutan suatu

peptide (residu ujung N) bisa ditentukan dengan cara mereaksikan peptide dengan

fenilisosianat. Pada pH netral, fenilisosianat bereaksi dengan gugus α-amino.

Setelah dilakukan hidrolisis asam lemah, hasil reaksi akan bersiklisasi dengan

melepaskan residu yang paling ujung turunan feniltiohidantoin (PTH).

H O H
S H
+ H2N C C N C
C
N
R R
Phenylisothiocyanate

H S H H O H
H
N C N C C N C

R R

H
HN
+ H3N+ C
N
S H R
Phenylthiohydantoin

Gambar 6. Proses Degradasi Edman

12
Tahap 5. Pemotongan Rantai Polipeptida Semula dengan Prosedur Kedua

Sama seperti tahap II, tetapi bukan dengan metode enzim melainkan

dengan metode kimia. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi sianogen bromida

yang berguna untuk memotong ikatan peptida dengan gugus karbonil pada residu

metionin. Pada polipeptida yang mengandung delapan residu metionin akan

menghasilkan sembilan fragmen peptida.

H H H H
H H
R1 C N C C N R2 R1 C N C C N R2

O CH2 O O H2C O

CH2 C
H2
S CH3 H3C S CN
+ + H2O
-
Br C N Br

H
O
H
R1 C N C C
+ H2N R2
O H2C O

C
H2

Gambar 7. Pemotongan Polipeptida dengan CNBr

Tahap 6. Menyusun Fragmen Peptida dengan Penetapan Bagian Yang Saling

Tumpang Tindih

Deret asam amino pada tiap fragmen yang diperoleh dari polipeptida awal

dengan kedua prosedur pemotongan dianalisis untuk menemukan bagian yang

saling tumpang tindih dengan fragmen yang diperoleh dengan prosedur

pemotongan pertama.

2.3.2 Pembacaan Urutan Asam Amino dengan Instrumen

13
 Protein sangat mudah di kuantifikasi dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis oleh karena adanya kehadiran tiga asam amino aromatik

(triptofan, tirosin dan fenilalanin) yang mana biasanya terhitung sebagai asam

amino dalam porsi yang kecil pada protein. Ke-19 asam amino lainnya yang

merupakan asam amino non-aromatik tidak dapat terdeteksi oleh

Spektrofotometer UV-Vis. Kebanyakan asam amino tidak memiliki karakteristik

spektra UV atau cahaya tampak dan tidak berpendar. Oleh karena itu asam-asam

amino tersebut harus dimodifikasi untuk membentuk senyawa yang menunjukkan

flourisensi atau absorpsi cahaya tampak atau dengan kata lain diderivatisasi dan

kemudian dideteksi

Derivatisasi dapat dilakukan dengan metode derivatisasi pre-kolom,

dimana senyawa yang akan dianalisis dalam sampel diderivatisasi terlebih dahulu

sebelum diinjeksi ke dalam kolom kromatografi dan komponen yang bereaksi

kemudian dipisahkan dan dideteksi. Derivatisasi juga dapat menggunakan

derivatisasi post-kolom dimana senyawa yang akan dianalisis dalam sampel

pertama-tama dipisahkan dalam kolom, diikuti dengan derivitasisai inline

kemudian dideteksi. Terdapat dua metode derivatisasi pasca colom yaitu sebagai

berikut:

1. Metode Ninhidrin

Prosedur ini menggunakan Ninhidrin untuk mendeteksi asam amino secara

tidak langsung dengan spektrofotometer UV-Vis setelah asam amino dipisahkan

oeh kolom penukar kation. Reagen Ninhidrin akan membentuk derivat kelompok

asam amino primer dan sekunder. Asam amino primer akan bereaksi dengan

reagen ninhidrin pada suhu 130 0C saat melewati fasa hydrindatin dalam kolom.

14
Derivat asam amino primer akan menghasilkan warna ungu yang dideteksi pada

panjang gelombang 570 nm dan 405 nm.

Gambar 8. Proses derivatisasi dengan Ninhidrin

2. Metode OPA

Metode ini menggunakan reagen OPA untuk membentuk derivat asam

amino yang akan dideteksi dan dihitung oleh Spektrofotometer UV-Vis. Reagen

OPA bereaksi dengan asam amino bebas yang telah dipisahkan oleh kolom

penukar kation. Derivat asam amino dibentuk pada suhu ruang, berbeda dengan

metode Ninhidrin. Isoindol yang berpendar dibawah cahaya UV diproduksi

karena asam amino primer bereaksi dengan reagen OPA dan Thioflour, yang

memungkinkan untuk mendeteksi asam amino dengan UV/Vis dengan metode

pendaran.

15
 Gambar 9. Proses Derivatisasi dengan Menggunakan OPA

Amino Acid Analyzer merupakan instrument yang menggunakan prinsip

LC dalam pengoperasiannya. Amino Acid Analyzer L-8900 merupakan

derivatisasi post-kolom, instrumen LC dengan kecepatan tinggi yang

menggunakan kolom yang terdiri dari polistiren divinilbenzen yang dimodifikasi

oleh gugus sulfonat sehingga membuat kolom ini menjadi resin penukar kation

yang sangat asam dengan diameter partikel 3μm.

Gambar 10. Amino Acid Analyzer

Fasa Gerak yang diguakan adalah buffer natrium sitrat untuk 20 konstituen

16
asam amino dalam metode analisis protein hidrolisat dan larutan buffer lithium

sitrat untuk 40 konstituen asam amino dalam metode analisis cairan biologis.

Botol larutan buffer yang tersedia secara komersial bisa diletakkan ke perangkat

tanpa modifikasi. Setiap fasa gerak ditransfer oleh gas nitrogen dari botol reagen

bertekanan melalui katup elektromagnetik dan selanjutnya pompa 1 fasa gerak.

Pompa ini mampu mentransfer 6 cairan. Autosampler dapat diatur sehingga dia

mampu menampung 200 sampel dalam vial 1,5 mL dan sampel yang diambil

ialah 20 µL yang kemudian diinjeksikan ke kolom pemisah. Jika volume sampel

kecil, maka dapat digunakan mikrovial 200 µL.

Gambar 11 . Bagan Amino Acid Analyzer

Untuk pereaksi ninhidirn, dua botol yang mengandung reagen dapat

diletakkan dalam alat tanpa modifikasi dan larutan akan bercampur sebelum

reaksi. Setiap komoponen asam amino yang dielusi dari kolom akan bercampur

dengan larutan yang bereaksi oleh pompa 2 larutan pereaksi dan kemudian

dipanaskan hingga 135 0C. Asam amino terdeteksi pada panjang gelombang

570 nm yang merupakan spektrum cahaya tampak dan merupakan absorbansi

maksimum untuk Ruhemann ungu yang merupakan salah satu dari komponen

17
pereaksi. Kuantifikasi akan ditampilkan dalam bentuk puncak-puncak

kromatogram (Gambar 5). Prolin dan hidroksiproli yang merupakan asam amino

tidak memiliki absorbansi maksimum dalam spektrum cahaya tampak oleh karena

itu dideteksi pada panjang gelombang 440 nm.

Gambar 12. Output Hasil Analisis dengan Amino Acid Analyzer

18
 BAB III

KESIMPULAN DAN SARAN

3.1 Kesimpulan

Berdasarkan makalah ini dapat disimpulkan bahwa:

1. Secara umum proses isolasi protein dapat dilakukan melalui proses lisis sel

kemudian dilakukan sentrifugasi

2. Pemurnian protein dapat dilakukan dengan berbagai cara diantaranya

filtrasi gel (berdasarkan ukurannya) dan kromatografi penukar ion

(berdasarkan muatannya)

3. Analisis pembacaan urutan asam amino dapat dilakukan dengan cara

konvensional dan juga dengan derivatisasi serta menggunakan insturmen

Amino Acid Analyzer.

3.2 Saran

Saran yang dapat disampaikan ialah sebaiknya dilakukan pengkajian yang

lebih dalam lagi terkhusus mengenai cara pembacaan asam amino dari protein

mengingat keterbatasan literatur yang didapatkan penulis dalam menyusun

makalah ini.

19
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2011, http://biosaefful.blogspot.co.id/2011/04/protein-biokimia.html

Bollag DM, Rozycki MD, Edelstein SJ. 1996. Protein Methods, Michigan:
Willey-Liss.

Holme, D.J and Peck Hazel, 1993, Analytical Biochemistry Second

Edition, Longman Scientific & Technical, New York.

Koolman J., Roehm KH., 2005, Atlas of Biochemistry, New York : Thieme.

Latundra, A.I., Ahmad, A., 2012, Isolasi dan Karakterisasi Protein Bioaktif dari
Beberapa Jenis Spons sebagai Agent Antimikroba, Jurnal tidak
diterbitkan, Universitas Hasanuddin.

Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Jakarta : Erlangga

Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia
Harper Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta

Ngili, Y., 2013, Protein dan Enzim, Rekayasa Sains, Bandung.

Ozawa, S., dan Miyano, H., 2015, Advances in amino acid analysis and Amino
Acid Analyzer L-8900, Technical Magazine of Electron Microscope and
Analytical Instruments, 6(1): 33-43.

Wilson, K. dan Walker J., 2000. Principles and Techniques of Practical

Biochemistry Fifth Edition, United Kingdom : Cambridge University
Press.

20