.

BIOTEKNOLOGI
FARMASI
KELOMPOK 5
LAURA ELISABET PANDIANGAN
201951120
MASFUFAH RISQIANI 201951127
RUHSIYAM FEBRIANI 201951182
SHERLY PRAMEI SHELLA 201951193
TISON SILAEN 201951212
YESI AYU NADILLA LORENZA
201951226
1
 1. PRINSIP KERJA PCR
Sama seperti dalam proses replikasi DNA pada organisme, teknologi PCR juga membutuhkan DNA
polimerase yang tugasnya membuat kopian strand DNA baru dengan menggunakan stand DNA yang sudah
ada sebagai template. DNA polimerase yang biasa digunakan dalam teknologi pemrosesan PCR disebut Taq
polimerase, yang merupakan DNA polimerase stabil yang telah diisolasi dari bakteri termofilik Thermus
aquaticus yang hidup di dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal
untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA. Selain Taq polimerase, juga diperlukan
primer, urutan nukleotida pendek yang dapat memulai titik awal sintesis DNA. Dalam reaksi berantai PCR
(polymerase chain reaction), pelaku eksperimen menentukan terlebih dahulu wilayah DNA yang akan
direplikasi dan diperkuat dengan memilih sekuens primer yang akan digunakan. Primer PCR adalah DNA
untai tunggal, dengan panjang kira-kira 20 nukleotida.

2
 PRINSIP KERJA PCR
Dalam prinsip kerja PCR, digunakan dua jenis primer, dan primer ini dirancang untuk memblokir daerah DNA yang
akan direplikasi

Setelah primer berikatan dengan DNA templat, untai tunggal DNA akan diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan
daerah yang diapit akan terkopi.

3
 PRINSIP KERJA PCR
Langkah kerja PCR melewati 3 tahap
1. Denaturation (denaturasi)
Denaturasi tahap awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. proses denaturasi menggunakan suhu sekitar
92-94oC biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai
tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)
secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR (Murray dkk, 2006).
2. Annealing (Penempelan Primer)
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan
primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat.
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25
basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Waktu annealing yang biasa
digunakan dalam PCR adalah 30-45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran
temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36ºC sampai dengan 72ºC, namun temperatur yang biasa dilakukan
itu adalah antara 50 – 60ºC (Handoyo dan Rudiretna, 2000).
4
 PRINSIP KERJA PCR
3. Reaksi Polimerisasi (Extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah
menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3‟nya dengan penambahan dNTP yang komplemen
dengan templat oleh DNA polimerase. Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang
DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada temperatur 72ºC
diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA
target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari
cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap
ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.
Reaksireaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh
molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih
banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan

5
Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan
waktu sekitar 2-4 jam bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi.
Jika reaksinya efisien, wilayah target dapat berubah dari hanya satu atau
beberapa salinan menjadi milyaran. Karena ada banyak salinan atau untai
ganda primer dan banyak molekul Taq polymerase yang mengambang di
sekitar reaksi, sehingga jumlah molekul DNA kira-kira bisa berlipat
ganda dalam setiap putaran siklus. Pola pertumbuhan eksponensial ini
ditunjukkan pada gambar di berikut ini.

6
2. Kenapa PCR bisa mendeteksi porcine babi pada
produk Viostin DS?

7
 3. manfaat PCR dalam bidang kesehatan
1. Peranan PCR dalam Diagnostik Kesehatan
Aplikasi PCR dalam diagnostik kesehatan telah banyak dilakukan dengan tingkat sensitifitas dan spesifitas
yang cukup tinggi, teknologi ini cukup mumpuni dalam mendeteksi mikroorganisme berbahaya yang
titernya cukup kecil sekalipun dalam beragam sampel, mendeteksi suatu mutasi gen tertentu pada
pasien penderita kanker, dan mendeteksi kelainan gen-gen bawaan. metode PCR dapat dipakai sebagai
metode komplemen terhadap metode baku dalam diagnostik klinis seperti FISH (Flouresence In Situ
Hybdridization) yang menggunakan prinsip kerja yaitu pelabelan DNA target pada jaringan secara in situ
menggunakan probe berflourensensi, IHC (Immuno Histo Chemistry) yang menggunakan prinsip yaitu
deteksi protein menggunakan antibodi spesifik yang sudah ditempelkan probe khusus, maupun sanger
sequencing yang menggunakan prinsip kerja yaitu pengurutan basa-basa DNA oleh DNA polymerase
dengan memasangkan basa-basa DNA yang sudah dimodifikasi secara kimia hanya dengan melibatkan
penggunaan satu primer.
8
Berikut ini adalah tabel kompilasi dari beberapa hasil penelitian beserta aplikasi klinis PCR dalam diagnostik
kesehatan terkait deteksi penyakit berbahaya, penyakait turunan dan penyakit kanker.

9
 manfaat PCR dalam bidang kesehatan

 Kebutuhan diagnostik kesehatan saat ini kaitannya dengan metode

molekular yaitu tersedianya metode molekular yang memenuhi kriteria
akurat, cepat, dan murah.
 Akurasi metode PCR sangat ditentukan oleh kemampuan kita dalam hal :
(1) Merancang pasangan primer spesifik dari gen yang akan diperbanyak,
(2) Pemilihan gennya,
(3) Pemilihan metode PCR yang akan dipakai

10
Thanks!

11