LAPORAN PRAKTIKUM

NUTRIGENOMIK DAN APLIKASI TEKNIK MOLEKULER

PRAKTIKUM 3 dan 4 “PCR dan RT-PCR”

Dosen Pengampu:
Dr. Diana Nur Afifah, S.TP., M.Si.
Faizah Fulyani, S.Si., M.Sc., Ph.D.

Disusun oleh:
Kelompok 1 Kelas B
Jean Amelia Putri Marbun 22030120110030
Ria Irmelin Br Barus 22030120120002
Laela Kholisoh Widyaningsih 22030120120020
Wayu Taruli Octavia Sihotang 22030120120022
Fathin Nur Hidayati 22030120130036
Galuh Regganis Nugrahaini 22030120130044
Reghina Afrisyia Suparman 22030120130050

PROGRAM STUDI S-1 GIZI

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2023
1. TINJAUAN PUSTAKA
A. PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik amplifikasi
asam nukleat in vitro yang paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas. PCR
digunakan untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan
menganalisis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target
melalui enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle. Untuk
melakukan proses PCR diperlukan beberapa komponen seperti thermocycler, DNA
template, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), buffer, primer, dan DNA
polimerase. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida
yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target
disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse.
Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal
disebut enzim polimerase (1–3).
Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat;
(2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4)
pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (post extension). Tahap (2)
sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus
terjadi duplikasi jumlah DNA (1–3).
 Gambar 1. Proses PCR
Keberhasilan reaksi PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor: (1)
deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), (2) oligonukleotida primer, (3) DNA
template (cetakan), (4) komposisi larutan buffer, (5) jumlah siklus reaksi, (6) enzim
yang digunakan, dan (7) faktor teknis dan non-teknis lainnya, misalnya kontaminasi
(1–3).
Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses
PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan
kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat
dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini
berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR dan waktu (1–3).
B. Faktor – faktor yang memengaruhi PCR
1. Jenis Polimerase DNA
Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang
terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan untuk
DNA rantai pendek. Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang
DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA lebih besar
dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan aktivitas tinggi.
2. Konsentrasi dNTP, MgCl2, dan Polimerase DNA
Konsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang
diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya
digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 μM, sedangkan untuk panjang target
DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200
uM.
Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 – 1,5 mM.
Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR.
Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk
non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming. Jumlah polimerase DNA
yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi.
Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 – 2 unit
per 50 μL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar
dari dua kilobasa diperlukan 3 – unit per 50 μL campuran reaksi.
3. Suhu
Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan
salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu
berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer.
Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 – 95°C, ini semua tergantung
pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA
target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase
DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak
DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses
denaturasi DNA templat tidak sempurna.
Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60°C.
Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk
proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm –
 5)°C sampai dengan (Tm + 5)°C. Dalam menentukan suhu annealing yang
digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan
nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen.
Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72°C
karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa
digunakan untuk proses PCR.
4. Buffer PCR
Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer
nya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu “Low-salt buffer” (pH
8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt buffer” (pH 9,2 dan kapasitas
buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis polimerase
DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan
diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 – 5 kilobasa biasanya
diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari
lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”.
5. Waktu
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA
templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat umumnya
dilakukan selama 30 – 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang
digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan
sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu
denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi tidak
sempurna. Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang
primer. Untuk panjang primer 18 – 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan
untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60
detik.
Pemilihan waktu ekstensi primer tergantung pada panjang fragmen DNA
yang akan diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo
basa DNA diperlukan waktu 30 – 60 detik. Pada setiap melakukan PCR harus
dilakukan juga kontrol positif, ini diperlukan untuk memudahkan pemecahan
masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan. Selain itu juga harus dilakukan
terhadap kontrol negatif untuk menghindari kesalahan positif semu.
 C. RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction)
Selain PCR secara konvensional pada masa kini sudah terdapat PCR modern
yang bernama Real Time-PCR. Real Time PCR adalah teknik yang digunakan untuk
memonitor progress reaksi PCR pada waktu yang sama atau selama proses PCR
berlangsung. RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk
PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat dihitung secara kuantitatif.
Real Time Polymerase Chain Reaction atau RT-PCR telah menjadi metode pengujian
utama yang memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi, serta dapat mendeteksi
sampel dalam jumlah yang banyak dan waktu yang singkat (4).
Dalam mendeteksi dan mengidentifikasi DNA pada sampel, Real Time PCR
membutuhkan pewarna fluoresens. Pewarna fluoresens yang umum digunakan adalah
SYBR Green dan Hydrolysis Probe. Pewarna fluoresens SYBR Green akan berpendar
ketika terinterkalasi dengan untai ganda DNA. Sedangkan fluoresens dari Hydrolysis
Probe akan berpendar ketika Probe, yang merupakan dua pewarna fluoresens (terdiri
atas Reporter dan Quencher), secara fisik terpisah melalui hidrolisis oleh aktivitas
nuclease. Dibandingkan Hydrolysis Probe, metode SYBR Green lebih ekonomis dan
mudah dalam penanganan. SYBR Green tidak memerlukan Probe yang membutuhkan
banyak biaya untuk mensintesisnya. Namun demikian, SYBR Green sangat
tergantung dari spesifisitas primer karena dapat menyebabkan terjadinya mis-priming
dan primer-dimer sehingga menyebabkan terbentuknya produk amplifikasi yang
nonspesifik. Sedangkan Hydrolysis Probe lebih mampu mencegah terjadinya produk
amplifikasi yang nonspesifik (5).

2. TUJUAN PRAKTIKUM
a. Mempelajari dan memahami prinsip kerja PCR dan kegunaannya.
b. Mempelajari dan memahami prinsip kerja dan pemanfaatan RT-PCR.

3. ALAT DAN BAHAN

a. Alat:
1. Ember berisi es
2. Mikropipet dan tip
3. Tabung reaksi
4. Mesin PCR / rapid cycler
 b. Bahan:
1. Primer
2. DNA polimerase
3. Nukleotida (dNTP)
4. Garam, air, dan buffer
5. Floroscence (TaqMan probe dan SYBR Green dye)*
* digunakan untuk RT-PCR

4. METODE PRAKTIKUM
a. PCR (Polymerase Chain Reactions)

Gambar 2. Diagram Alir PCR

b. RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reactions)

1. Metode SYBR
Dalam uji SYBR, pewarna berpendar ketika terikat pada DNA untai ganda
tetapi menampilkan fluoresensi lemah di hadapan DNA untai tunggal. Ini
menghasilkan peningkatan sinyal fluoresensi saat reaksi berlangsung dan DNA
beruntai ganda terbentuk.
 2. Metode TaqMan probe
Dalam uji TaqMan, domain endonuklease flap 5-prime dari Taq DNA
polimerase membelah probe spesifik target, memisahkan fluorofor pada ujung 5-
prime dari quencher pada ujung 3-prime, menghasilkan peningkatan fluoresensi
yang bergantung pada amplifikasi.

5. HASIL PRAKTIKUM
A. Praktikum 3 Polymerase Chain Reaction (PCR)
1. Apakah fungsi dari reaksi PCR dan Jelaskan prinsip kerjanya.
Jawaban:
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah
metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial
suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Dengan metode ini dapat
diperoleh pelipatgandaan suatu sekuen DNA dalam genom virus yang mana hanya
dengan mencampurkan kulturnya di dalam tabung Polymerase Chain Reaction
(PCR). PCR memungkinkan produksi DNA tertentu dalam jumlah banyak dari
template DNA yang kompleks menggunakan reaksi enzimatik sederhana (6,7).
Beberapa fungsi Polymerase Chain Reaction (PCR) sebagai berikut: (7)
a. Isolasi dari material genom
b. Sekuensing dan deteksi dari penyakit genetik
c. Teknik DNA rekombinan
d. Sidik jari genetik dan uji paternitas
e. Amplifikasi DNA dan kuantitatif DNA
f. Analisis DNA fosil
g. Deteksi DNA virus
h. Kuantitasi DNA dan pembandingan ekspresi gen
Prinsip dari teknik PCR adalah memperbanyak bagian spesifik yang
ditargetkan dengan DNA polimerase yang diinisiasi oleh pelekatan primer dengan
menghubungkan deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) dalam reaksi termal (8).
Posisi dan orientasi primer dalam reaksi PCR memungkinkan salinan terbentuk
secara eksponensial. Dalam PCR, primer yang direkayasa manusia mengarahkan
DNA polimerase ke urutan target yang diinginkan. PCR memiliki dua primer yang
mengapit urutan target. Jika Anda mengatur reaksi dengan satu primer, Anda
dapat membuat satu salinan DNA sekaligus. Tetapi dengan dua primer, jumlah
 salinan tumbuh secara eksponensial dengan setiap siklus. Satu salinan menjadi
dua, dua menjadi empat, empat menjadi delapan, dan seterusnya. Orientasi primer
juga penting. Kedua primer menempel pada untaian DNA yang berlawanan, di
kedua ujung urutan target. DNA polimerase dapat menyalin DNA hanya dalam
satu arah (dari 5-prime ke 3-prime) dan primer diatur untuk polimerase untuk
memperpanjangnya satu sama lain. Reaksi ini berpotensi mengamplifikasikan satu
molekul DNA menjadi lebih dari 1 miliar molekul dalam waktu kurang dari 2 jam.
(7)

2. Identifikasi alat dan bahan yang dibutuhkan untuk PCR

Jawaban:
a. Alat yang dibutuhkan untuk PCR:
 Ember berisi es
Beberapa bahan reaksi akan mulai terurai setelah dihangatkan
sehingga menyimpan bahan di atas es membuatnya tetap segar.
 Mikropipet dan tip
Volume cairan dalam reaksi PCR sangat kecil. Mikropipet
memungkinkan untuk mengukur dan mentransfer cairan dalam jumlah
yang sangat kecil dengan tepat. Plunger di bagian atas memungkinkan
untuk menarik cairan ke atas dan mendorongnya keluar. Ujung plastik
dipasang pada ujung mikropipet. Cairan masuk ke ujung, bukan
mikropipet itu sendiri. Dengan beralih ke ujung yang bersih di antara
setiap bahan, sehingga dapat menghindari kontaminasi silang.
 Tabung reaksi
Semua bahan yang ditambah sampel akan masuk ke tabung reaksi.
Tabung reaksi dapat berupa tabung tunggal, strip tabung, atau pelat dengan
96 tabung reaksi atau bahkan 384 tabung reaksi terpisah. Tabung reaksi
memiliki dinding yang tipis sehingga memudahkan panas dan dingin
dengan cepat.
 Mesin PCR / rapid cycler
Mesin PCR adalah perangkat yang dapat diprogram dengan siklus
suhu terjadi dengan waktu yang cepat. Sebagian besar memiliki blok
logam dengan bagian untuk memasukkan tabung reaksi. Dahulu dapat
melakukan PCR tanpa mesin ini. Sebelum ada mesin PCR, para ilmuwan
 menggunakan penangas air pada suhu dan pengatur waktu yang berbeda.
Namun, menghabiskan berjam-jam memindahkan tabung reaksi di antara
bak air.
b. Bahan yang dibutuhkan untuk PCR:
 Primer
Panjangnya sekitar 20-25 nukleotida. Diproduksi ataupun dirancang
untuk menjadi target spesifik. Melampirkan urutan DNA di kedua ujung
target. Multiplex PCR menggunakan beberapa pasang primer untuk
memperkuat beberapa target dalam satu tabung reaksi. Analisis DNA
forensik bekerja dengan cara ini. Dengan menandai primer dengan tag
fluoresen yang berbeda, mudah untuk membedakan produk dari urutan
target yang berbeda.
 DNA polimerase
Semua sel hidup membuat enzim ini dan menggunakannya untuk
menyalin DNA mereka. Polimerase tidak pilih-pilih, karena akan menyalin
DNA dari spesies apa pun. Polimerase apa pun dapat berfungsi, tetapi PCR
menggunakan polimerase dari bakteri yang hidup di sumber air panas.
 Nukleotida
Blok bangunan DNA dengan menambahkan semua 4 jenis nukleotida:
A, C, G, dan T. Polimerase menambahkan nukleotida komplementer ke
ujung primer saat menyalin untai DNA
 Garam, air, dll
Air, garam, dan buffer membantu menciptakan kondisi dimana DNA
polimerase dapat bekerja. Tujuannya untuk meniru kondisi di dalam sel.

3. Apakah fungsi primer dalam proses PCR, ada berapa jenis primer yang digunakan
pada proses PCR dan apa perbedaan keduanya?
Jawaban:
Primer adalah suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa, nukleotida)
yang dapat mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi dengan rantai polimerase.
Fungsi primer pada proses PCR adalah sebagai pembatas fragmen DNA target
yang akan diamplifikasi serta menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’
yang dibutuhkan pada proses eksistensi DNA. Dalam mendesain suatu primer
perlu memperhatikan beberapa hal, yaitu panjang primer 18 – 30 pb dengan
 kandungan masing – masing primer harus berada pada kisaran 40 – 60% (9).
Terdapat dua jenis primer, yaitu primer forward dan primer reverse. Hal yang
membuat beda dari kedua jenis primer tersebut adalah arah sintesis saat dikatalis
oleh DNA polimerasenya. Pada primer forward arah sintesis maju, sedangkan
pada primer reverse arah sintesisnya terbalik (3).

4. Perhatikan segmen DNA berikut. Apabila segmen hendak di amplifikasi dengan

menggunakan metode PCR maka buatlah suatu rancangan primer. Berikanlah
tanda ujung 5’ dan 3’ pada rancangan primer yang anda buat.
5’ATGCGTAATCCCACGCTGTTACAATGTTTTCACTGGTATTACCCGGA
AGGCGGTAAGCTCTGGCCTGAACTGGCCGAGCGCGCCGACGGTTTTAA
TGATATTGGTATCAATATGGTCTGGTTGCCGCCCGCCTATAAAGGCGC
ATCGGGCGGGTATTCGGTCGGCTACGACTCCTATGATTTATTTGATTTA
GGCGAGTTTGATCAGAAAGCCTTTAGCCGCAGTGGCACCGACGAATTT
CCCGGCTGCGTGGTGGTCATGTCGAACGGGGATGATGGCGAAAAAAC
CATTCATCTGGGAGAGAATTACGGCAATAAAACCTGGCGTGATTTTCT
GGGGAACCGGCAAGAGAGAGTAGTGACCGACGAAAACGGCGAAGCA
ACCTTCTTTTGCAACGGCGGCAGCGTCAGCGTGTGGGTTATCGAAGAG
GTGATTTAA 3’
Jawaban :
Total nukleotida : 145 nukleotida
Reverse primer : 3’ GTACAGCTTGCCCCTACTAC 5’
Forward primer : 5’ TATAAAGGCGCATCGGGCG 3’
5’TATAAAGGCGCATCGGGCGGGTATTCGGTCGGCTACGACTCCTATGATTTATTT
GATTTAGGCGAGTTTGATCAGAAAGCCTTTAGCCGCAGTGGCACCGACGAATTTC
CCGGCTGCGTGGTGGTCATGTCGAACGGGGATGATG 3’
(Reverse Primer) 3’ GTACAGCTTGCCCCTACTAC 5’
5’ TATAAAGGCGCATCGGGCG 3’ (Forward Primer)
3’ATATTTCCGCGTAGCCCGCCCATAAGCCAGCCGATGCTGAGGATACTAAATAA
ACTAAATCCGCTCAAACTAGTCTTTCGGAAATCGGCGTCACCGTGGCTGCTTAAA
GGGCCGACGCACCACCAGTACAGCTTGCCCCTACTAC 5’
 Gambar 3. Hasil Termofisher
Desain primer yang diperlukan untuk PCR adalah sepasang primer yang
dikenal dengan forward primer dan reverse primer. Primer yang diperoleh
merupakan rangkaian basa nukleotida yang unik dan diusahakan memiliki ukuran
pendek untuk meminimalkan biaya. Panjang primer berkisar 18-30 basa. Primer
dengan panjang lebih dari 30 basa tidak disarankan, karena tidak menunjukkan
spesifisitas yang lebih tinggi. Selain itu, primer yang panjang dapat berakibat
terhibridasi dengan primer lain sehingga tidak membentuk polimerisasi DNA.
Panjang primer yang digunakan pada penelitian berbeda-beda, namun tetap
meminimalkan ukuran primer (2).
Menurut literatur tersebut dan video panduan praktikum, primer yang kami
buat sudah memenuhi kriteria yaitu :
1. Memiliki panjang antara 18-30 basa. Untuk forward primer kami terdapat 20
nukleotida dan untuk reverse primer terdapat 19 nukleotida.
2. Memiliki persentase GC antara 50-60%. Untuk forward primer kami memiliki
55% GC dan untuk reverse primer terdiri atas 57,89% GC.
3. Memiliki TM ideal yang berkisar 55-65°C.
4. TM (melting temp) pada primer pair seharusnya memiliki beda suhu <5°C.

5. Perhatikan dua segmen DNA berikut. Kedua segmen memiliki jumlah nukleotida
yang sama tetapi terdenaturasi pada suhu yang berbeda. Apakah yang anda
ketahui mengenai melting temperature (Tm) DNA? Faktor apa saja yang
mempengaruhinya? Dan dari kedua segmen berikut manakah yang memiliki Tm
yang lebih tinggi.
(1) 5’AGCAATGATAAAATGAATCGATTGGAATCGAGTTAGTAATATAA
GTAAAT 3’
(2) 5’AGCGGTGATCCCCTGAATCGATTGGAATCGAGTTAGTAATATCCG
TAAAT 3’
Jawaban:
Melting temperature (Tm) DNA adalah temperatur saat setengah untai DNA
ganda terpisah, dimana nilai Tm ini akan berpengaruh pada suhu denaturasi untai
double helix DNA dan suhu annealing (penempelan) primer. Beberapa faktor
yang dapat mempengaruhi melting temperature yaitu panjang primer dan
banyaknya ikatan CG dalam primer. Untuk dapat memutuskan ikatan hidrogen
guanin dan sitosin membutuhkan energi yang besar dan suhu yang tinggi,
sehingga semakin panjang ukuran primer dan besarkan persentase GC primer
maka akan semakin tinggi nilai melting temperature primer tersebut. Dari kedua
segmen tersebut yang memiliki nilai Tm yang lebih tinggi adalah segmen (2)
dengan nilai Tm 76,6oC, dimana nilai tersebut sudah melebihi suhu yang
seharusnya pada proses annealing, yaitu 50 – 65oC (9,3).

Gambar 4. Nilai Melting Temperature (Tm)

B. Praktikum 4 (Real Time-PCR)
1. Pada temperatur berapakah denaturasi terjadi? Faktor apa yang dapat
mempengaruhi temperatur denaturasi DNA?
Jawaban :
Denaturasi umumnya terjadi pada temperatur 95°C. Namun, pada kondisi
tertentu dimana amplicon yang mengandung komposisi basa guanin (G) dan
sitosin (C) yang cukup tinggi atau amplicon yang membentuk suatu struktur
geometris tertentu (G4-quadruplex, stem-loop) penggunaan suhu standar (95°C)
untuk denaturasi menjadi tidak optimal lagi yang bisa menyebabkan proses
perbanyakan gen target terhambat dan memicu kegagalan PCR. Menaikan suhu
denaturasi sebesar 1°C, atau menambahkan enhancer seperti betaine merupakan
dua strategi yang digunakan untuk mengurangi error PCR tersebut. Amplicon
dengan komposisi basa G dan C yang tinggi memiliki jumlah ikatan hidrogen
yang cukup untuk menstabilkan duplex DNA sehingga dibutuhkan kalor yang
lebih besar untuk memutus ikatan hidrogen agar pemisahan dua utas DNA bisa
terjadi secara sempurna. Sedangkan betaine bisa menurunkan suhu yang
dibutuhkan oleh DNA untuk terdenaturasi setengahnya (melting temperature)
sehingga pada suhu denaturasi standar (95°C) amplicon dengan komposisi basa G
dan C yang tinggi bisa terdenaturasi sempurna (1). Selain itu, suhu juga
bergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang
fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan
aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu
juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat
menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna.

2. Apa yang menjadi perbedaan mendasar Real time PCR(RT) dengan PCR
konvensional ?
Jawaban :
Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase
adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara
eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Dengan metode ini
dapat diperoleh pelipatgandaan suatu sekuen DNA dalam genom virus yang mana
hanya dengan mencampurkan kulturnya di dalam tabung Polymerase Chain
Reaction (PCR). Selain PCR secara konvensional pada masa kini sudah terdapat
 PCR modern yang bernama Real Time-PCR. Real Time PCR adalah teknik yang
digunakan untuk memonitor progress reaksi PCR pada waktu yang sama atau
selama proses PCR berlangsung. RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR
(qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat
dihitung secara kuantitatif. Pada qPCR, prosesnya akan dimonitor dengan sinyal
fluorescence (dsDNA binding dye (SYBR Green I) atau Target-spesific probe
(TaqMan). Real Time Polymerase Chain Reaction atau RT-PCR telah menjadi
metode pengujian utama yang memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi,
serta dapat mendeteksi sampel dalam jumlah yang banyak dan waktu yang singkat
(4,2).
Real time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan
secara Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung
pada waktu yang bersamaan. Real Time-RT PCR memiliki tambahan siklus
Reverse Transcription yang memacu perubahan molekul DNA dari molekul RNA.
Real Time-RT PCR diperlukan karena RNA kurang stabil dibandingkan dengan
DNA (4).
Pada dasarnya proses amplifikasi menggunakan metode Real Time-PCR sama
dengan konvensional yaitu berfungsi untuk memperbanyak materi DNA.
Tahapannyapun juga sama yaitu terjadi proses reverse transcription di awal
proses yang berfungsi merubah virus RNA menjadi DNA berantai. Amplifikasi
virus RNA menggunakan metode Real Time PCR memiliki prinsip yang sama,
dimana terdiri dari 4 tahapan yaitu pre-denaturasi, denaturasi, anneling,
extension. Alat PCR untuk metode Real Time PCR memiliki prinsip memecah
rantai ganda (double-stranded) menjadi rantai tunggal (single-stranded), proses
tersebut dipengaruhi oleh suhu dan waktunya. Pembelahan untai ganda menjadi
tunggal (denatures) memerlukan waktu 15 detik pada suhu 94ºC. Denaturasi pada
proses Real Time-PCR lebih cepat dibandingkan dengan proses pada PCR
konvensional (4).

3. Komponen apa yang terdapat pada RT PCR yang tidak terdapat pada PCR
konvensional? Jelaskan fungsi komponen tersebut!
Jawaban :
Komponen yang terdapat pada RT PCR dan tidak terdapat pada PCR
konvensional adalah molecular probes. Molecular probes merupakan senyawa
 fluorescence yang dapat berpendar sehingga menciptakan sinyal yang dapat
melacak amplifikasi DNA selama proses PCR. Pada umumnya, jenis probes yang
sering digunakan untuk qPCR sampel adalah TaqMan probe, dan SYBR Green
dye.
Taqman adalah probe, yang diberi label fluoresensi dan secara khusus
mengikat produk PCR target dalam PCR waktu nyata. Oleh karena itu, perlu
dirancang probe khusus untuk mendeteksi uji PCR tertentu. Dengan demikian,
keuntungan utama dari probe Taqman adalah hibridisasi spesifik targetnya. Selain
itu, penggunaan probe yang diberi label dengan pewarna reporter yang dapat
dibedakan memungkinkan deteksi dua sekuens yang berbeda dalam satu tabung
reaksi. Umumnya, probe Taqman adalah probe oligonukleotida dengan pewarna
reporter fluoresen pada ujung 5′ dan pewarna quencher pada ujung 3′. Ketika
probe utuh, kedekatan pewarna quencher sangat mengurangi fluoresensi yang
dipancarkan oleh pewarna reporter melalui transfer energi resonansi fluoresensi
(FRET). Namun, ketika probe anil ke urutan target hilir dari salah satu situs
primer, aktivitas nuklease 5′ dari Taq DNA polymerase memotong ujung 5′ probe
selama ekstensi primer. Oleh karena itu, ini memisahkan pewarna reporter dari
pewarna quencher, meningkatkan sinyal pewarna reporter (10).
SYBR Green adalah pewarna pengikat dsDNA yang digunakan untuk
menodai DNA dan RNA dalam biologi molekuler. Umumnya juga digunakan
untuk mendeteksi produk real-time PCR. Selama kemajuan PCR, SYBR green
berikatan dengan setiap produk PCR yang baru diperkuat. Oleh karena itu, pada
akhir PCR, jumlah produk yang terbentuk sebanding dengan intensitas fluoresensi
sampel. Selain itu, keuntungan utama SYBR Green adalah memungkinkan
pemantauan amplifikasi sekuens DNA beruntai ganda. Namun, ini, di sisi lain,
mengurangi spesifisitas pengujian dengan menghasilkan sinyal positif palsu. Ini
mengurangi biaya pengujian dengan menghilangkan penggunaan probe. Selain itu,
penggunaan SYBR Green secara teknis merupakan proses yang mudah.
Sementara itu, pengikatan beberapa pewarna ke satu produk PCR meningkatkan
sensitivitas pendeteksian (10).

4. Jelaskan prinsip analisis kuantitatif qPCR yang berdasarkan kurva standar

(absolute quantification)
Jawab:
 Kuantifikasi absolut adalah pilihan analisis PCR real-time bagi peneliti yang
perlu menentukan jumlah salinan sebenarnya dari target yang sedang diselidiki.
Untuk melakukan kuantifikasi absolut, solusi templat target dengan konsentrasi
yang diketahui diencerkan pada beberapa kali lipat, diperkuat dengan PCR real-
time, dan data digunakan untuk menghasilkan kurva standar di mana setiap
konsentrasi target diplot terhadap nilai Ct yang dihasilkan. Sampel Cts yang tidak
diketahui kemudian dibandingkan dengan kurva standar ini untuk menentukan
nomor salinannya (11).
Kuantifikasi absolut menentukan jumlah salinan target yang sebenarnya, tetapi
juga merupakan bentuk kuantisasi yang paling padat karya dan sulit. Metode ini
membutuhkan perencanaan yang matang dan kurva standar yang sangat akurat.
Kuantisasi absolut sering digunakan untuk menentukan titer virus. Kuantifikasi
komparatif masih membutuhkan perencanaan yang hati-hati, tetapi data yang
dihasilkan adalah untuk kelimpahan relatif daripada jumlah salinan yang tepat. Ini
adalah metode pilihan untuk studi ekspresi gen dan menawarkan dua opsi utama
untuk kuantifikasi: ΔΔCt dan kuantifikasi kurva standar (11).
Dalam kuantifikasi absolut, terdapat dua hal yang perlu dipertimbangkan,
yaitu (11):
1. Templat untuk pembuatan kurva standar serta metode yang digunakan untuk
mengukur template tersebut adalah dasar untuk percobaan. Akurasi pemipetan
untuk seri pengenceran sangat penting. Ingat juga bahwa sensitivitas PCR
waktu nyata memperkuat kesalahan kecil manusia.
2. Efisiensi RT dan PCR yang serupa untuk templat target dan seri pengenceran
sampel aktual sangat penting.

5. Buatlah resume protokol aplikasi RT-PCR yang berkaitan dengan nutrisi yang
bersumber dari jurnal penelitian dengan topik berikut:
a) pemanfaatan RT PCR untuk analisis kehalalan produk makanan
b) pemanfaatan RT PCR untuk analisis jumlah mikrobiota gastro intestinal
golongan Bifidobacterium sp. dan Lactobacillus sp.
c) pemanfaatan RT PCR untuk analisis bakteri patogen pada makanan
d) pemanfaatan RT PCR untuk analisis variasi genetik (SNPs) pada gen FTO
Jawaban :
a. Pemanfaatan RT PCR untuk analisis kehalalan produk makanan
 Berdasarkan artikel yang berjudul “Application of real-time
polymerase chain reaction using species specific primer targeting on
mitochondrial cytochrome-b gene for analysis of pork in meatball products”
diperoleh resume protokol aplikasi RT-PCR yang berkaitan dengan nutrisi
berdasarkan guideline MIQE menghasilkan keterangan sebagai berikut (12):
Tabel 1. Protokol RT-PCR Analisis Kehalalan Produk Makanan

qPCR protocol

Complete Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer spesifik

Reaction yang berasal dari mitokondria cytb dari Sus Scrofa (1F1R
Condition primer) yang digunakan dalam analisis bakso babi
menggunakan metode real time polymerase chain
reaction (RT-PCR). Primer yang dirancang tersebut
divalidasi dan ini termasuk spesifisitas primer, linieritas,
dan sensitivitas metode serta uji pengulangan. Primer
secara khusus ditegaskan dalam jaringan segar ayam,
sapi, babi, dan kambing. Linearitas dan sensitivitas
metode dilakukan dengan mengukur kurva amplifikasi
dari rangkaian pengenceran (0, 1, 1, 10, 100, 1.000, dan
10.000 pg/µl DNA) yang diekstraksi dari formulasi bakso
babi 100%. Uji keterulangan dilakukan dengan
menentukan cycle threshold (Ct) nilai amplifikasi RT-
PCR dari formulasi bakso babi 100% sebanyak enam
kali.

Reaction Analisis RT-PCR menggunakan campuran reaksi (20 μl)

volume and yang terdiri dari 10 μl campuran master PCR universal
amount of SYBR Green, 1 μl primer reverse dan forward, 2 μl DNA
cDNA/DNA templat 50 ng, dan 6 μl nuklease bebas air.

Primer, Primer DNA babi dirancang dengan software NCBI-

(probe), Mg2+, Primer BLAST sesuai dengan kriteria yang diinginkan.
and dNTP Secara siliko, primer yang dirancang dikenai alat
concentrations pencarian BLAST atau primerbasic local alignment
 menggunakan alat yang tersedia di situs web di
http://blast.ncbi.nlm.

Polymerase Tidak terdapat keterangan terkait identitas polimerase dan

identity and konsentratsi.
concentration

Buffer/kit Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Pure Link

identity and Genomic DNA Mini Kit, USA (Cat No. K1820-01; Lot
manufacturer No. 1670947) sesuai petunjuk pembuatan. Analisis
kemurnian DNA hasil isolasi dilakukan dengan
mengukur larutan yang mengandung DNA (20 µl dalam
980 µl akuabides steril) pada panjang gelombang 260 dan
280 nm. Selain itu, konsentrasi DNA hasil isolasi diukur
dari nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
(A260) dikalikan dengan faktor pengenceran dan tetapan
serapan (50 µl/ml).

Additives Analisis RT-PCR menggunakan campuran reaksi (20 μl)

(SYBR Green I, yang terdiri dari 10 μl campuran master PCR universal
DMSO, and so SYBR Green, 1 μl primer reverse dan forward, 2 μl DNA
forth) templat 50 ng, dan 6 μl nuklease bebas air.

Complete Program suhu menggunakan suhu 94°C selama 30 detik,

thermocycling yang dilanjutkan dengan 30 siklus pada suhu 94°C
parameters selama 3 detik untuk tahap denaturasi. Tahap selanjutnya
adalah annealing primer pada suhu annealing 47,1°C
yang telah dioptimalkan selama 3 detik ditambah 72°C
selama 3 detik untuk tahap elongasi. Kurva peleburan
dilakukan pada suhu 65°C–95°C dengan kemiringan
0,5°C/5 detik.

Manufacturer RT-PCR menggunakan campuran reaksi (20 μl) yang

of qPCR terdiri dari 10 μl campuran master PCR universal SYBR
instrument Green, 1 μl primer reverse dan forward, 2 μl DNA
 templat 50 ng, dan 6 μl nuklease bebas air.

Berdasarkan penelitian pada artikel tersebut, dari data guideline MIQE

diatas, ternyata sudah memiliki kelengkapan protokol yang baik. Dilihat dari
checklist paper yang memenuhi aspek informasi penting (E), baik pada bagian
qPCR protocol. Apabila ada yang tidak memiliki keterangan maka itu berasal
dari artikel tersebut yang tidak memiliki keterangan dari data yang diminta.

b. Pemanfaatan RT PCR untuk analisis jumlah microbiota gastro intestinal

golongan Bifidobacterium sp. dan Lactobacillus sp.
Berdasarkan artikel yang berjudul “Increase in Bifdobacterium
is  A  Characteristic of The Diference in The Salivary Microbiota of Pregnant
and  Non-Pregnant Women” Diperoleh Resume Protokol Aplikasi RT-PCR
yang berkaitan dengan nutrisi berdasarkan guideline MIQE menghasilkan
keterangan sebagai berikut (13):
Tabel 2. Protokol RT PCR Analisis Microbiota GI

qPCR protocol

Complete Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer spesifik

Reaction yang berasal dari sampel air liur ibu hamil yang
Condition digunakan dalam analisis komposisi mikrobioma
menggunakan metode real time polymerase chain
reaction (RT-PCR). Reaksi PCR menargetkan daerah V3-
V4 dari gen 16S rRNA bakteri. PCR kadar bakteri
dikuantifikasi menggunakan RT-PCR dengan pasangan
primer spesifik untuk P. gingivalis, P. intermedia, A.
actinomycetemcomitans, dan genus Bifdobacterium 16S
rRNA

Reaction Analisis RT-PCR dilakukan dalam volume total 20 μl

volume and yang mengandung 10 μl FastStart Essesntial DNA Probes
amount of Master, masing-masing 0,5 μl primer reverse dan
cDNA/DNA forward, 1,0 μl larutan DNA templat, dan air bebas
DNase-RNase steril dalam jumlah yang sesuai.
Primer, Probe dan primer disintesis oleh Eurofns Genomics
(probe), Mg2+, (Tokyo, Jepang). Probe oligonukleotida diberi label
and dNTP dengan FAM di ujung 5’ dan TAMRA di ujung 3’. PCR
concentrations waktu nyata dilakukan menggunakan Light Cycler 96.

Polymerase Tidak terdapat keterangan terkait identitas polimerase dan

identity and konsentratsi.
concentration

Buffer/kit Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan uji

identity and imunosorben terkait enzim (ELISA) untuk mendeteksi
manufacturer estradiol (Salivary 17-Estradiol Enzyme Immunoassay
Kit; Metrik Sali) atau progesteron (Kit Immunoassay
Enzim Progesteron Saliva; Salimetri) sesuai petunjuk
pembuatan.
PCR indeks dilakukan menggunakan KAPA HiFi HS
ReadyMix dan kit indeks Nextera XT (Illumina).
Sequencing library preparation dibersihkan
menggunakan Agencourt AMPure XP (Beckman Coul
ter, Brea, MA, USA) dan dihitung pada perangkat Qubit
3 (Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, USA).
Kemudian, diencerkan menjadi 8 pM (konsentrasi akhir),
dicampur dengan PhiX (Illumina), dan diterapkan ke
sistem Illumina MiSeq untuk diurutkan dengan kit reagen
MiSeq v3 (600 siklus, Illumina).

Additives Analisiss RT-PCR dilakukan dalam campuran volume

(SYBR Green I, total 20 μl yang mengandung 10 μl FastStart Essesntial
DMSO, and so DNA Probes Master, masing-masing 0,5 μl primer
forth) reverse dan forward, 1,0 μl larutan DNA templat, dan air
bebas DNase-RNase steril dalam jumlah yang sesuai.

Complete Program suhu menggunakan suhu 94°C selama 10 menit,

thermocycling yang dilanjutkan dengan 45 siklus pada suhu 95°C
parameters selama 10 detik untuk tahap denaturasi. Tahap
 selanjutnya adalah annealing primer pada suhu annealing
58°C selama 90 detik.

Manufacturer RT-PCR menggunakan campuran reaksi dengan total 20

of qPCR μl yang mengandung 10 μl FastStart Essesntial DNA
instrument Probes Master, masing-masing 0,5 μl primer reverse dan
forward, 1,0 μl larutan DNA templat, dan air bebas
DNase-RNase steril dalam jumlah yang sesuai.

Berdasarkan penelitian pada artikel tersebut, dari data guideline MIQE

diatas, ternyata sudah memiliki kelengkapan protokol yang baik. Dilihat dari
checklist paper yang memenuhi aspek informasi penting (E), baik pada bagian
qPCR protocol. Apabila ada yang tidak memiliki keterangan maka itu berasal
dari artikel tersebut yang tidak memiliki keterangan dari data yang diminta.

c. Pemanfaatan RT PCR untuk analisis bakteri patogen pada makanan

Berdasarkan artikel yang berjudul “Deteksi Molekuler Mikroorganisme
Patogen pada Bahan Pangan dengan Metode RT-PCR” diperoleh resume
protokol aplikasi RT-PCR yang berkaitan dengan nutrisi berdasarkan
guideline MIQE menghasilkan keterangan sebagai berikut (14):
Tabel 3. Protokol RT PCR Analisis Bakteri Patogen pada Makanan

Experimental Design

Definition of Bakteri Escherichia coli O157:H7 merupakan foodborne

experimental pathogen, bila masuk dalam saluran pencernaan manusia
and control dapat menyebabkan sakit bahkan kematian. Beberapa
groups kasus yang terjadi adalah tercemarnya produk daging
beku, susu, jus dan salad sayur. Penelitian ini menitik
beratkan pada isolasi dan identifikasi E. coli O157:H7
pada produk susu dan salad sayur. Kontaminasi E. coli
O157:H7 pada salad dapat berasal dari sayur yang
tercemar pupuk yang berasal dari kotoran hewan.
Identifikasi dan kuantifikasi menggunakan alat Real
Time PCR. Metode analisis yang dikembangkan
 divalidasi dengan melakukan amplifikasi menggunakan
kontrol positif (standar), kontrol negatif, dan sampel.
Kontrol negatif adalah bakteri yang sudah diketahui
secara pasti tidak mengandung amplificate target yang
dimaksud, sedangkan kontrol positif sebaliknya.

qPCR protocol

Complete Melakukan pengembangan metoda analisis untuk isolasi

Reaction Deoxyribonucleic Acid (DNA) bakteri patogen
Condition Escherichia coli O157:H7 dalam produk susu dan salad
sayur yang disimpan dingin. Prinsipnya dilakukan
kontaminasi buatan (artificial contamination)
Escherichia coli O157:H7 ke dalam sampel susu dan
salad sayur dingin dan kemudian DNA target diisolasi.
Isolat DNA diamplifikasi dengan menggunakan 4
pereaksi KAPA Probe Fast Master Mix, primer dan probe
spesifik. Probe dilabel dengan FAM dan BHQ dan
dideteksi menggunakan Real Time PCR. Pembacaan
produk hasil Real-Time PCR ditampilkan dalam bentuk
grafik amplifikasi dan kurva standar. Tahapan validasi
metoda analisis meliputi penentuan spesifisitas, limit
deteksi, keseksamaan atau presisi, dan kecermatan atau
akurasi.

Reaction Volume master mix keseluruhan untuk pengujian satu

volume and jenis template DNA adalah 18 µL. Bahan-bahan tersebut
amount of dicampur dalam satu tabung eppendorf 2 ml berwarna
cDNA/DNA gelap dan divortex. Untuk melakukan pengujian beberapa
jenis template DNA, maka volume masing-masing
reagensia dikali dengan banyaknya jenis template DNA
yang akan diuji pada Real-Time PCR dan dicampur di
dalam tabung eppendorf. Sejumlah 18 µL campuran
master mix dipipet ke dalam setiap well yang kemudian
 ditambahkan dengan 2 µL template DNA, ditutup dengan
penutup well, selanjutnya divortex pada MixMate PCR
96 dan dimasukkan pada alat Real-Time PCR.

Primer, Isolat DNA diamplifikasi dengan menggunakan 4

(probe), Mg2+, pereaksi KAPA Probe Fast Master Mix, primer dan probe
and dNTP spesifik. Probe dilabel dengan FAM dan BHQ dan
concentrations dideteksi menggunakan Real Time PCR. Bahan isolasi
DNA meliputi primer forward Stx1- 418-F (SynthID
1222546) dan primer reverse Stx1-617-R (SynthID
1222547), dan probe Stx1-P. Pembuatan baku kerja
primer dilakukan berdasarkan protokol pengenceran
primer dari 1 st base (Anonim, 2012). Baku kerja primer
dibuat dengan konsentrasi 20 dan 10 µM, selanjutnya
dilakukan pengenceran beberapa konsentrasi primer yaitu
4, 8, 12, 16 dan 20 µM yang akan digunakan untuk
optimasi konsentrasi primer dengan range konsentrasi
akhir 0,1 – 0,5 µM. Optimasi dilakukan dengan
menggunakan kultur murni E.coli O157:H7. Kemudian
dipilih konsentrasi primer yang sesuai/tepat. Konsentrasi
primer yang sesuai/tepat adalah konsentrasi primer yang
menghasilkan nilai Ct yang paling rendah dan tanpa
menghasilkan atau seminimal mungkin menghasilkan
primer dimer pada kurva puncak pelelehan. Penentuan
konsentrasi probe dilakukan setelah dilakukan penentuan
konsentrasi primer. Pelacak (probe) dibuat dengan
konsentrasi 20 dan 10 µM, selanjutnya dilakukan
pengenceran beberapa konsentrasi primer yaitu 4, 8, 12,
16 dan 20 µM yang akan digunakan untuk optimasi
konsentrasi probe dengan range konsentrasi akhir 0,1 –
0,5 µM. Optimasi dilakukan dengan menggunakan kultur
murni E.coli O157:H7. Kemudian dipilih konsentrasi
probe yang sesuai/tepat. Konsentrasi probe yang
 sesuai/tepat adalah konsentrasi primer yang menghasilkan
nilai Ct yang paling rendah dan tanpa menghasilkan atau
seminimal mungkin menghasilkan primer-dimer pada
kurva puncak pelelehan. Untuk validasi metode analisis,
baku kerja primer dibuat dengan konsentrasi 6 µM dan
pelacak (probe) dengan konsentrasi 4 µM (hasil optimasi
metode). Master mix PCR (probe) pada penelitian ini
terdiri dari 5,5 µL buffer TE, 10 µL KAPA Probe Fast
qPCR. Ditambahkan masing-masing 1 µL primer reverse
dan forward pada konsentrasi 6 µM. Ditambahkan 0,5 µL
probe konsentrasi 4 µM dan dihomogenisasi.

Polymerase Tidak terdapat keterangan terkait identitas polimerase dan

identity and konsentratsi.
concentration

Buffer/kit Master mix PCR (probe) pada penelitian ini terdiri dari
identity and 5,5 µL buffer TE. Bahan isolasi DNA meliputi kit
manufacturer diagnostik (QIAamp DNA Mini and Blood Mini 250 rx)
terdiri dari bufer AL, bufer AW 1, bufer AW 2, dan bufer
AE. Isolasi DNA dari matriks pangan menggunakan
metode kit komersial Qiagen kemudian diidentifikasi dan
dikuantifikasi menggunakan alat Real Time Polymerase
Chain Reaction.

Additives Bahan tambahan yang digunakan seperti pada media

(SYBR Green I, untuk pertumbuhan dan isolasi bakteri adalah Sorbitol
DMSO, and so MacKonkey Agar (media selektif E.coli O157:H7),
forth) cemitex tellurite, Eosin Methylene Blue Agar (EMBA,
Oxoid), Nutrient Agar, Nutrient Broth dan Trypticase Soy
Broth (TSB, Oxoid) dan XLDA.

Complete Tidak ada penjelasan secara pasti terkait kata

thermocycling “thermocycling” pada artikel tetapi terdapat keterangan
parameters pada optimasi suhu penempelan primer/probe (annealing)
 suhu dioptimasi dengan mengaktifkan program gradient
pada instrumen real time PCR, kemudian di tentukan
rentang suhu yang akan diuji. Protokol Real Time PCR
E.coli O157:H7 meliputi pra-denaturasi 94°C, 120 detik,
untuk 40 siklus denaturasi 94°C, 20 detik, dan annealing
60°C, 30 detik.

Manufacturer Terkait instrumen qPCR yang digunakan pada artikel ini

of qPCR adalah 10 µL KAPA Probe Fast qPCR untuk membuat
instrument master mix PCR (probe) dengan 5,5 µL buffer TE.
KAPA Probe Fast qPCR Master Mix (2X) with
ROX™mengartikan produk ini merupakan merek dagang
Applera Corporation atau anak perusahaannya di AS
dan/atau negara tertentu lainnya.

Berdasarkan penelitian pada artikel tersebut, dari data guideline MIQE

diatas, ternyata sudah memiliki kelengkapan protokol yang baik. Dilihat dari
checklist paper yang memenuhi aspek informasi penting (E), baik pada bagian
experimental design dan qPCR protocol. Apabila ada yang tidak memiliki
keterangan maka itu berasal dari artikel tersebut yang tidak memiliki
keterangan dari data yang diminta.

d. Pemanfaatan RT PCR untuk analisis variasi genetik (SNPs) pada gen FTO
Berdasarkan artikel yang berjudul “Identification of Selected Genetic
Polymorphisms in Polycystic Ovary Syndrome in Sri Lankan Women Using
Low Cost Genotyping Techniques” diperoleh resume protokol aplikasi RT-
PCR yang berkaitan dengan nutrisi berdasarkan guideline MIQE
menghasilkan keterangan sebagai berikut (15):
Tabel 4. Protokol RT PCR Analisis Variasi Genetik (SNPs) pada Gen FTO

Experimental Design

Definition of Sindrom ovarium polikistik (PCOS), kelainan endokrin

experimental paling umum yang menyerang wanita muda, tampaknya
and control merupakan sifat multigenik dengan gen yang
groups berkontribusi tidak jelas. Oleh karena itu, diperlukan
analisis polimorfisme pada banyak kandidat gen. Tujuan
penelitian ini mengembangkan dan memvalidasi uji
peleburan resolusi tinggi (HRM) dan PCR kuantitatif
real-time spesifik alel (AS-qPCR) untuk genotipe SNP
terpilih yang terkait dengan PCOS dan mengidentifikasi
SNP terpilih dan hubungannya dengan kohort PCOS
berkarakteristik baik di Sri Lanka.
Kasus dan kontrol tidak benar-benar cocok dengan usia,
di mana usia rata-rata kontrol lebih tinggi daripada
subjek PCOS (p = 0,06). Penjelasan untuk kelompok
kontrol yang sedikit lebih tua ini adalah bahwa pencarian
sukarelawan dari lingkungan kerja yang besar dan
mereka telah mencapai kesuburan dan jelas tidak
menunjukkan fenotipe PCOS yang lebih ringan
sekalipun. Perbedaan usia ini tidak mungkin berdampak
pada susunan genetik mereka dan dengan demikian
temuan penelitian ini. Sampel kontrol: Siklus normal
asimptomatik, normo-androgenik, sejak remaja, wanita
usia reproduksi yang tidak berobat, yang menyetujui
PCOS secara objektif dikecualikan dengan penilaian
klinis, biokimia dan ultrasonografi, direkrut sebagai
kontrol. Subyek kontrol direkrut dari satu tempat kerja di
mana program promosi kesehatan dilakukan dari tahun
2012 (3 tahun sebelum penelitian). Wanita pekerja
dengan latar belakang etnis dan sosial yang sama dengan
subjek yang terkena dampak diundang untuk
berpartisipasi dalam penelitian ini.

qPCR protocol

Complete DNA diekstraksi dari wanita dengan PCOS yang ditandai

Reaction dengan baik sejak remaja (n = 55) dan kontrol yang
Condition cocok secara etnis (n = 110). FTO (Gen terkait massa
 lemak dan obesitas; rs9939609), FSHB (Subunit beta
hormon perangsang folikel; rs6169), FSHR (Reseptor
hormon perangsang folikel; rs6165 / rs6166), dan gen
INSR (reseptor insulin; rs1799817) di-genotipe
menggunakan uji HRM. Gen GnRH1 (Gonadotropin
releasing hormone; rs6185), LHB (Luteinizing hormone
beta subunit; rs1800447/rs34349826) dan LHCGR
(Luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor;
rs2293275) gen digenotipe menggunakan metode AS-
qPCR. Hasil genotipe divalidasi menggunakan Sanger
sequencing.

Reaction Campuran reaksi akhir untuk setiap pengujian terdiri dari

volume and 2 μl template DNA (10 ng/μl), 2 μl campuran master
amount of Solis BioDyne (5x HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix),
cDNA/DNA 0,5 μl primer tipe liar (10 μM), primer mutasi 0,5 μl (10
μM), 0,5 μl primer umum (10 μM), dan akhirnya
menambahkan 4,5 μl ddH 2 O ke volume akhir 10 μl.

Primer, Primer dirancang menggunakan metodologi serupa yang

(probe), Mg2+, digunakan oleh alat online SNPgen (
and dNTP http://snp.biotech.edu.lk/ ) dan disintesis khusus oleh
concentrations Macrogen Inc, Korea. Untuk meningkatkan spesifisitas
dan kelayakan diskriminasi alelik yang efisien, teknik
berikut digunakan dalam perancangan primer:
perancangan primer untuk HRM dan PCR kuantitatif
waktu nyata khusus alel (AS-qPCR) didasarkan pada
versi modifikasi dari CADMA (amplifikasi kompetitif
dari amplikon peleburan yang berbeda). Metode ini
menggunakan 3 primer – dua primer spesifik alel dan satu
primer umum. Dari 2 primer spesifik alel, satu primer
dirancang untuk memperkuat hanya alel yang bermutasi
(primer mutan) dan primer lainnya hanya memperkuat
alel tipe liar (primer tipe liar). Primer umum dirancang
 untuk memperkuat alel tipe liar dan mutan. Sampel
dipilih secara acak dan PCR sekuensing dilakukan pada
DNA genom yang mengapit situs polimorfik dengan
menggunakan primer sekuens dan primer umum dari
HRM atau AS-qPCR dan produk yang diamplifikasi
diurutkan secara khusus (Macrogen Inc, Korea) untuk
memvalidasi HRM dan metode PCR waktu nyata khusus
alel. Rincian primer PCR Tetra ARMS dan kondisi PCR
diberikan dalam bahan pelengkap.

Polymerase Tidak terdapat keterangan terkait identitas polimerase dan

identity and konsentratsi.
concentration

Buffer/kit Serum kisspeptin dan kadar testosteron diukur dengan kit

identity and ELISA (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmond, CA dan
manufacturer Teco Diagnostics, USA masing-masing) sesuai
rekomendasi pabrik. DNA diekstraksi dari sampel darah
(2ml) menggunakan kit ekstraksi DNA genomik
(Promega, AS), mengikuti protokol pabrikan. Sampel
DNA selanjutnya disimpan pada suhu -20°C.

Additives Bahan tambahan yang digunakan seperti campuran

(SYBR Green I, reaksi akhir untuk setiap pengujian terdiri dari 2 μl
DMSO, and so campuran master Solis BioDyne (5x HOT FIREPol
forth) EvaGreen HRM Mix).

Complete Tidak ada penjelasan secara pasti terkait kata

thermocycling “thermocycling” pada artikel tetapi terdapat keterangan
parameters PCR kuantitatif waktu nyata dilakukan menggunakan
termocycler (BioRad CFX 96). Denaturasi awal 95°C
selama 15 menit, diikuti oleh 40 siklus denaturasi (95°C
selama 15 detik,) anil (60°C selama 20 detik; suhu anil
bervariasi dengan setiap SNP) dan ekstensi (72°C selama
20 detik). HRM dilakukan dari 50°C hingga 95°C dengan
 kenaikan suhu 0,2°C/s dengan 50 akuisisi/°C.

Manufacturer qPCR yang digunakan adalah CFX96 Touch Real-Time

of qPCR PCR Machine yang diproduksi oleh perusahaan dengan
instrument brand Bio-Rad dari USA.

Berdasarkan penelitian pada artikel tersebut, dari data guideline MIQE

diatas, ternyata sudah memiliki kelengkapan protokol yang baik. Dilihat dari
checklist paper yang memenuhi aspek informasi penting (E), baik pada bagian
experimental design dan qPCR protocol. Apabila ada yang tidak memiliki
keterangan maka itu berasal dari artikel tersebut yang tidak memiliki
keterangan dari data yang diminta.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Widayat W, Winarni Agustini T, Suzery M, Ni’matullah Al-Baarri A, Rahmi Putri S.

Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) sebagai Alat Deteksi DNA Babi
dalam Beberapa Produk Non-Pangan. Indones J Halal. 2019;2(1):26.
2. Budiarto BR. Kaitan genotyping errors dengan performa diagnostik molekuler kanker
berbasis amplifikasi asam nukleat. Biodidaktika, J Biol Dan Pembelajarannya.
2018;13(2):1–18.
3. Eling KS D, Kurniawan R, Muhimmah I. Karakteristik Primer pada Polymerase Chain
Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA: Mini Review. Inform Medis. 2014;93–102.
4. Kurniawati MD, Sumaryam S, Hayati N. Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR)
Konvensional dan Real Time- PCR Untuk Deteksi Virus VNN (Viral Nervous Necrosis)
Pada Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus). Techno-Fish. 2019;3(1):19–30.
5. Zilhadia Z, Izzah AN, Betha OS. Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis
Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan Real Time
Polymerase Chain Reaction. J Sains Farm Klin. 2017;4(1):16.
6. Kusnadi, J., & Arumingtyas, E. L. Polymerase Chain Reaction (PCR): Teknik dan
Fungsi. Universitas Brawijaya Press. 2020.
7. Yustinadewi, P. D., Yustiantara, P. S., & Narayani, I. Teknik Perancangan Primer Untuk
Sekuen Gen MDR-1 Varian 1199 Pada Sampel Buffy Coat Pasien Anak Dengan LLA.
Jurnal Metamorfosa. 2018; 5(1):105-111.
8. Anika M, Putri DH, Wahyuni. Primer Design for Identification of Beta-Carotene
Encoding Genes in Cassava. Journal Bio Sains. 2019;4(1):39–47.
9. Rahmadhan D, Sari R, Apridamayanti P. Pengaruh Suhu Annealing terhadap
Amplifikasi Gen tem Menggunakan Primer dengan % GC Rendah. Jurnal Mahasiswa
Farmasi Fakultas Kedokteran UNTAN. 2019;4(1):1–7.
10. What is the Difference Between SYBR Green and Taqman [Internet]. Molecular
Biology; [cited 2023 March 9]. Available from: https://pediaa.com/what-is-the-
difference-between-sybr-green-and-taqman/
11. Real-time PCR Handbook [Internet]. Life Technologies; [cited 2023 March 9]. Available
from: https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-
update-flr.pdf
12. Orbayinah S, Widada H, Hermawan A, Sudjadi S, Rohman A. Application of Real-Time
Polymerase Chain Reaction Using Species Specific Primer Targeting on Mitochondrial
 Cytochrome-B Gene for Analysis of Pork in Meatball Products. J Adv Vet Anim Res.
2019;6(2):260–5.
13. Kato, S., Nagasawa, T., Uehara, O., Shimizu, S., Dkk. Increase in Bifdobacterium
is A Characteristic of The Diference in The Salivary Microbiota of Pregnant and Non-
Pregnant Women. BMC Oral Health. 2022;22.
14. Nikastari E. Yuliangsih S. Lanovia T. et al. (Analysis of Escherichia Coli O157:H7 in
Milk and Salad Using Real Time PCR). Pusat Riset Obat dan Makanan, Badan POM :
Jakarta. 2015:1-15
15. Branavan U. Jayakody S. S Wijesundera. et al. Identification of Selected Genetic
Polymorphisms in Polycystic Ovary Syndrome in Sri Lankan Women Using Low Cost
Genotyping Techniques. Plos One. 2018:1-19.