LAPORAN PRAKTIKUM

NUTRIGENOMIK DAN APLIKASI TEKNIK MOLEKULER

PRAKTIKUM 2 “ISOLASI DNA”

Dosen Pengampu:
Dr. Diana Nur Afifah, S.TP., M.Si.
Faizah Fulyani, S.Si., M.Sc., Ph.D.

Disusun oleh:
Kelompok 1 Kelas B
Jean Amelia Putri Marbun 22030120110030
Ria Irmelin Br Barus 22030120120002
Laela Kholisoh Widyaningsih 22030120120020
Wayu Taruli Octavia Sihotang 22030120120022
Fathin Nur Hidayati 22030120130036
Galuh Regganis Nugrahaini 22030120130044
Reghina Afrisyia Suparman 22030120130050

PROGRAM STUDI S-1 GIZI

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2023
1. TINJAUAN PUSTAKA

A. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan pemisahan molekul DNA dari komponen sel.

Isolasi DNA mempunyai dua prinsip, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Gaya
sentrifugasi dan perbedaan berat molekul menjadi prinsip kerja dari sentrifugasi,
sedangkan pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang berasal dalam sel
menjadi prinsip kerja dari presipitasi. Tahapan isolaso DNA secara umum yaitu
sentrifugasi, inkubasi, presipitasi, elusi, pencucian, dan pengeringan. Metode
isolasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan kit maupun konvensional.
Metode ini memerlukan persiapan alat dan bahan yang relative rumit dan lama
dengan hasil isolasi tergantung dengan jenis dari sampel yang digunakan.
Sedangka kelebihan dari metode ini adalah harganya yang relative lebih murah.
Sementara itu, isolasi DNA menggunakan kit lebih praktis karena dalam satu
paket kit terdapat larutan isolasi yang siap pakai sehingga dapat menghemat waktu
kerja namun harganya yang relatif lebih mahal (1).

B. Kromosom Manusia

Kromosom adalah berbentuk seperti benang yang terbuat dari protein dan
molekul tunggal DNA yang berfungsi untuk membawa informasi genomik dari sel
ke sel. Pada tumbuhan dan hewan (termasuk manusia), kromosom berada di inti
sel. Manusia memiliki 22 pasang kromosom bernomor (autosom) dan satu pasang
kromosom seks (XX atau XY), dengan total 46 kromosom. Setiap pasangan
mengandung dua kromosom yang berasal dari orang tua, sehingga anak-anak
mewarisi setengah kromosom berasal dari ibu dan setengah lainnya dari ayah.
Kromosom dapat dilihat melalui mikroskop ketika nukleus larut selama
pembelahan sel (2).

Gambar 1. Chromosom
 Kromosom memiliki jumlah dan bentuk yang bervariasi di antara
organisme hidup. Sebagian besar bakteri memiliki satu atau dua kromosom
melingkar. Sedangkan manusia dan hewan serta tumbuhan memiliki kromosom
linier. Pada manusia, pasangan kedua puluh tiga adalah kromosom seks,
sedangkan 22 pasang pertama disebut autosom. Secara biologis, individu
perempuan memiliki dua kromosom X (XX) sedangkan laki-laki memiliki satu
kromosom X dan satu kromosom Y (XY). Kromosom memiliki ukuran yang
berbeda. Kromosom X manusia sekitar tiga kali lebih besar daripada kromosom Y
manusia, kromosom X mengandung sekitar 900 gen, sedangkan kromosom Y
memiliki sekitar 55 gen. Struktur kromosom yang unik membuat DNA terikat erat
di sekitar protein seperti gulungan, yang disebut histones. Tanpa kemasan seperti
itu, molekul DNA akan terlalu panjang untuk masuk di dalam sel. Apabila semua
molekul DNA dalam satu sel manusia terlepas dari histonesnya, mereka akan
meregang sepanjang 6 kaki (2).

2. TUJUAN PRAKTIKUM

Mempelajari dan memahami cara mengisolasi DNA kromosom manusia.

3. ALAT DAN BAHAN

A. Alat :

a. Warm water bath

b. Micro centrifuge
c. Buccal swab
d. Micropipettor
e. Tabung sampel

B. Bahan :

a. Lysis solution
b. Concentrated salt solution
c. Resuspension buffer
d. Ethanol
e. Isopropyl alcohol
4. METODE

Gambar 2. Metode Kerja

5. HASIL PRAKTIKUM

Jawablah pertanyaan-pertanyaan berikut!

1. DNA, Deoxyribo Nucleic Acid merupakan materi genetik yang dimiliki oleh
setiap organisme hidup. Bergantung pada tipe selnya, DNA dapat disimpan dan
dikemas dengan cara yang berbeda. Pada sel manusia dimanakah DNA dapat
ditemukan?
Jawab :
Manusia termasuk ke dalam organisme eukariotik yaitu organisme yang
memiliki nukleus atau inti sel. Pada sel eukariotik bagian terbesar dari DNA
berada pada nukleus yang. Pada manusia dan hewan terdapat dua bentuk DNA
yaitu DNA kromosom yang berlokasi di inti sel, dan DNA mitokondria yang
berlokasi di organel mitokondria. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu
adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut
merupakan bagian dari metode isolasi DNA (3), (4).

2. Apakah terdapat perbedaan antara DNA pada organisme prokaryotes dan

eukaryotes? Kaitkan jawaban dengan poin no 1.
Jawab :
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
Masing-masing organisme prokaryotes dan eukaryotes memiliki DNA yang
berbeda. Sel prokariotik yaitu sel yang tidak memiliki membran inti sel (tidak
terdapat struktur inti sel) maupun membrane organel (tidak memiliki struktur
organel bermembran seperti kloroplas dan badan golgi). Hal ini tidak berarti
bahwa sel prokariotik tidak memiliki materi genetik, melainkan materi genetiknya
tersebar di dalam sitoplasma yang dikenal dengan istilah nukleoid. Struktur dasar
sel prokariotik sangat sederhana dibandingkan dengan sel eukariotik. Prokariotik
memiliki dinding sel sebagai lapisan pelindung yang kuat. Lapisan ini
mengelilingi membran plasma dan membungkus satu sel yang mengandung
sitoplasma dan DNA (3), (4).
Sedangkan sel eukariotik yaitu sel yang memiliki inti atau nukleus (karion)
yang dikelilingi oleh membran, sehingga sel ini memiliki dua membran yaitu
 membran sitoplasma dan membran inti (membran nukleus). Sel eukariotik ini
terdapat pada organisme yang lebih kompleks seperti pada sel hewan, sel
tumbuhan, dan sel termasuk sel manusia. Pada sel eukariotik bagian terbesar dari
DNA berada pada nukleus yang terdiri dari 90% keseluruhan DNA seluler. Sisa
DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Pada manusia dan
hewan terdapat dua bentuk DNA yaitu DNA kromosom yang berlokasi di inti sel,
dan DNA mitokondria yang berlokasi di organel mitokondria. Sedangkan pada
tanaman terdapat bentuk tambahan DNA yaitu DNA kloroplas yang terdapat di
organel kloroplas. Perbedaan diantara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk
linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein
histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan
DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua (4), (5).
Perbedaan struktur DNA pada DNA prokariot dan eukariot yaitu DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular. Prokariot umumnya
memiliki satu molekul DNA dengan struktur lingkar yang terkonsentrasi pada
nukleoid. Selain itu, prokariot sering kali juga memiliki bahan genetik tambahan
yang disebut plasmid yang juga berstruktur DNA lingkar. Pada umumnya, plasmid
tidak dibutuhkan oleh sel untuk pertumbuhan meskipun seringkali plasmid
membawa gen tertentu yang memberikan keuntungan tambahan pada keadaan
tertentu, misalnya resistansi terhadap antibiotik, sedangkan DNA eukariot
berbentuk linear dan memiliki protein histon (3), (4).

3. Uraikan mengenai struktur DNA, komponen penyusunnya beserta ikatannya.

Jawab :
Molekul DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida panjang yang terdiri dari
empat jenis subunit nukleotida. Masing-masing rantai ini dikenal sebagai rantai
DNA atau untai DNA. Kedua rantai polinukleotida saling terhubung oleh ikatan
hidrogen. Nukleotida terdiri dari five-carbon sugar yang melekat pada satu atau
lebih gugus fosfat dan basa yang mengandung nitrogen. Gula tersebut adalah
deoksiribosa yang melekat pada gugus fosfat tunggal, sehingga disebut asam
deoksiribonukleat, dan basa berupa adenin (A), sitosin (C), guanin (G), atau timin
 (T). Nukleotida secara kovalen dihubungkan bersama dalam rantai polinukleotida
melalui gula dan fosfat (6).

Gambar 2. Struktur DNA

Berdasarkan gambar di atas, DNA terbuat dari empat jenis nukleotida

yang dihubungkan secara kovalen ke dalam rantai polinukleotida (untai DNA)
dengan tulang punggung gula-fosfat dengan basa (A, C, G, dan T) memanjang.
Molekul DNA terdiri dari dua untai DNA yang disatukan oleh ikatan hidrogen
antara basa berpasangan (A dengan T dan C dengan G). Panah di ujung untai
DNA menunjukkan polaritas kedua untai yang saling bertentangan dalam
molekul DNA. Molekul DNA tidak berbentuk lurus, melainkan dipelintir menjadi
double helix (6).

4. Jelaskan struktur rantai sense dan anti sense DNA.

Jawab :
Rantai sense adalah rantai utama DNA dengan arah 5’ – 3’, sedangkan
rantai antisense adalah rantai pengganti apabila rantai sense terjadi kerusakan,
arah dari rantai antisense yaitu 3’ – 5’. Antisense merupakan untai DNA non-
coding dari suatu gen. Dalam sel, DNA antisense berfungsi sebagai template
untuk memproduksi mRNA yang akan mensintesis protein (7).
 Gambar 3. Struktur Rantai DNA

DNA adalah molekul memiliki dua rantai, satu rantai DNA disebut rantai
sense karena ketika dibaca dengan arah yang benar maka ia menyediakan kode
untuk membuat protein. Rantai sense terhubung pada rantai DNA yang berlawanan
yaitu rantai antisense. Masing-masing rantai terdiri dari serangkaian basa yang
sering diberi label dengan huruf A, T, C, dan G. Setiap basis pada rantai sense
berpasangan dengan basis komplementer atau cocok pada rantai antisense. Jadi A
pada rantai sense selalu berpasangan dengan T pada rantai antisense dan C selalu
berpasangan dengan G. Selama produksi protein, kedua rantai DNA berpisah untuk
sementara waktu. Rantai antisense kemudian menjadi template untuk membuat
mRNA, lalu mRNA diterjemahkan menjadi protein yang sesuai (7).

5. Sebutkan beberapa kegunaan dari pemeriksaan berbasis DNA terkait aplikasinya

pada analisis makanan!
Jawab :
a. Pengujian keamanan pangan
Makanan yang tercemar oleh bakteri patogen dapat menyebabkan
infeksi dan keracunan makanan bagi yang mengkonsumsinya. Banyaknya
penjual makanan dan minuman menyebabkan kesulitan dalam mengontrol
produk makanan dan minuman yang terbebas dari bakteri patogen dan
kontaminasi lainnya yang membahayakan konsumen. Salah satu cara dalam
 menguji keamanan pangan adalah dengan menggunakan molekul DNA bakteri
seperti Salmonella sp dengan proses isolasi DNA dan amplifikasi DNA
dengan PCR (8).

b. Menentukan kehalalan produk makanan

Sejumlah proses makanan berbahan dasar daging ditemukan tercampur
pada olahan daging sapi untuk menurunkan harga produksi. Sebagian besar
hal tersebut tidak diinformasikan pada konsumen. Oleh karena itu, dibutuhkan
adanya deteksi cemaran zat-zat yang tidak diinginkan seperti hanya babi pada
produk makanan untuk melindungi konsumen. Pengujian cemaran daging babi
salah satunya dapat dilakukan dengan Porcine Detection Kit dan metode
amplifikasi DNA menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) (9).
c. Pengawetan Makanan
Iradiasi gamma merupakan teknik pengawetan makanan dengan
mereduksi bakteri patogen pada bahan pangan, seperti Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Vibrio sp., dan Clostridium
perfringens dengan merusak DNA dari bakteri-bakteri tersebut. Teknologi ini
perlu dikombinasikan dengan pengawetan lainnya, seperti pembekuan sebagai
teknologi hurdle yang dapat memberikan hasil yang lebih maksimal dalam
menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan mencegahnya untuk
memperbaiki DNA pasca iradiasi (10).

6. Apa yang dimaksud denaturasi dan renaturasi DNA? Jelaskan

Jawab :
Denaturasi DNA adalah proses penghancuran struktur heliks ganda dengan
cara memanaskan DNA hingga suhu 95oC. Proses denaturasi diiringi dengan
pemisahan untai rangkap menjadi untai-untai tunggal yang sedikit fleksibel.
Denaturasi memberikan dasar pendekatan yang sangat tepat dan sensitif untuk
identifikasi urutan tertentu dalam DNA maupun RNA. Sedangkan, renaturasi adalah
proses penggabungan kembali SNA komplementer yang telah dipisahkan oleh panas
(pada proses denaturasi) secara spontan ketika suhu diturunkan atau menggunakan
proses pendinginan. Proses denaturasi dan renaturasi menyediakan informasi
mengenai sifat-sifat penting DNA yang diperoleh dari berbagai sumber (11).
 Table 1. Denaturasi dan Renaturasi DNA

Denaturasi Renaturasi

Proses pembentukan DNA beruntai Proses pembentukan DNA beruntai

tunggal dari DNA heliks beruntai ganda dari untai DNA tunggal
ganda

Dilakukan dengan pemanasan Dipengaruhi oleh pendinginan

Melibatkan pemutusan ikatan Melibatkan pembentukan ikatan

hidrogen antara pasangan basa hidrogen antara pasangan basa
komplementer komplementer

Tingkat kenaikan absorbansi Tingkat renaturasi berbanding lurus

berbanding lurus dengan tingkat dengan konsentrasi urutan
denaturasi komplementer

Setelah denaturasi, viskositas Setelah renaturasi, viskositas

menurun meningkat

7. Bagaimana cara mengkuantifikasi DNA?

Jawab :
Kuantifikasi DNA adalah proses pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA
dengan menggunakan alat spektrofotometer. Prosedur dari kuantifikasi DNA adalah
dengan mengatur spektrofometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Selanjutnya, dilakukan uji blanko dengan memasukkan blanko ddH2O pada
spektrofotometer dan melakukan kalibrasi. Lalu, DNA hasil ekstraksi diambil
sebanyak 4 μL dan dimasukkan ke dalam tube steril yang berbeda. Setelah itu,
menambahkan ddH2O 6 μL dan menghomogenkan sampel menggunakan vortex
selama 5 detik. Kemudian, sebanyak 4 μL yang telah dihomogenkan ditambahkan ke
dalam kuvet steril dan memasukkan blanko sampel ke dalam spektrofotometer. Lalu,
menekan tombol yang menunjukkan proses perhitungan DNA. Hasil dari pengukuran
muncul dalam konsentrasi ng/ μL dan kemurnian DNA yang baik adalah A260/280 ≥
1,8. Konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus hasil uji kuantitatif
DNA = OD260 x 50 x faktor pengenceran (12).
8. Berdasarkan pengamatan anda, Uraikan alat dan bahan yang dibutuhkan untuk
mengisolasi DNA (lengkapi dengan gambar).
Jawab :

Table 2. Alat dan Bahan

Warm water bath

Microcentrifuge

Buccal swab

Mikropipet
 Blue tip

Tabung sample

Larutan lisis

Larutan garam pekat

Penyangga resuspensi
 Etanol

Alkohol isopropil

9. Uraikan komposisi dari bahan-bahan yang digunakan beserta fungsinya.

Jawab :
a. Larutan Lisis
Mengandung deterjen dan enzim yang disebut proteinase K. Deterjen
mengganggu membran sel dan selubung inti, menyebabkan sel pecah dan
melepaskan DNA mereka. DNA masih terbungkus sangat erat di sekitar protein
yang disebut histon, dan proteinase K memisahkan histon untuk membebaskan
DNA. Senyawa yang berbeda biasanya digunakan untuk isolasi DNA yang
sukses. Deterjen (untuk melisiskan sel dan mendenaturasi kompleks
nukleoprotein), Proteinase K (untuk mencerna protein), agen pengkelat (untuk
mengikat kation bivalen dan DNase yang tidak aktif), RNase A (untuk
menghilangkan kontaminan RNA), pelarut organik, termasuk fenol, kloroform,
dan alkohol isoamyl (untuk memurnikan DNA dalam kebanyakan prosedur
umum). Sebagian besar metode saat ini menggunakan zat beracun (fenol atau
guanidin isotiosianat) dan tidak hemat biaya karena penggunaan Proteinase K atau
RNase A (13).
b. Concentrated salt solution
 Mengandung protein dan debris yang menggumpal. Fungsi larutan ini adalah
untuk menggumpalkan protein dan puing-puingnya.

c. Resuspension buffer
Larutan ini mengandung cairan yang berfungsi untuk menstabilkan larutan
sampel agar tetap netral dalam waktu penyimpanan dengan jangka pendek atau
panjang.
d. Ethanol
Ethanol memiliki salah satu komposisi berupa alkohol dan berfungsi untuk
membersihkan sisa-sisa reagen atau larutan dari setiap tube sampel. Etanol
merupakan salah satu produk penting dalam bidang kesehatan dan energi, dapat
dibuat menggunakan metode fermentasi atau biasa juga disebut dengan peragian,
yaitu proses perubahan kimia dalam suatu substrat organik yang dapat
berlangsung karena aksi katalisator biokimia, yaitu enzim yang dihasilkan oleh
mikroba-mikroba hidup tertentu, terjadi karena aktifitas mikroba penyebab
fermentasi pada substrat organik sesuai. Fermentasi dapat menyebabkan
perubahan sifat bahan pangan, sebagai akibat dari pemecahan kandungan-
kandungan bahan pangan tersebut terjadi perubahan kimia dari zat organik karena
mikroorganisme penyebab fermentasi bereaksi dengan substrat organik yang
sesuai dengan pertumbuhanny. Etanol merupakan bahan kimia yang mempunyai
kegunaan sangat luas, didapatkan secara fermentasi menggunakan substrat bahan
mengandung gula, bio-katalis dari khamir Saccharomyces cerevisiae yang
diamobilisasi. Saat ini fermentasi lebih banyak menggunakan bio-katalis dari
khamir sebagai sel bebas dan proses secara batch, penggunan sel amobil dengan
proses kontinyu belum banyak dilakukan (14).
e. Isopropyl Alcohol
Membalikkan tabung beberapa kali akan mencampur isoprphyl alcohol ke
dalam larutan DNA. Karena DNA tidak larut (tidak larut) dalam alkohol isopropil,
ia keluar dari larutan. Sekarang dapat melihat DNA yang menggumpal dengan
mata telanjang. Jadi komposisi larutan didalam isopropyl Alcohol adalah larutan
alkohol yang menyebabkan DNA menggumpal dan tidak larut. Pemberian
isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi
presipitasi (15).
10. Apakah fungsi sentrifugasi dan hal apa yang penting untuk dilakukan sebelum
memulai sentrifugasi.
Jawab :
Fungsi dari sentrifugasi adalah untuk memutar sampel sehingga dapat
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar (protein dan puing-puing sel) akan berada di bagian
bawah tabung dan molekul ringan (strand DNA) akan berada pada bagian atas tabung
(15). Sebelum memulai sentrifugasi, pastikan untuk menjaga keseimbangan di dalam
micro centrifuge tersebut karena memiliki kekuatan memutar sampel sebesar 3000x
gravitasi. Hal ini yang sering menyebabkan kesalahan pengoperasiannya. Untuk
menyeimbangkannya, setelah tabung sampel dimasukkan, pastikan untuk menimbang
tabung lainnya yang berisi air dengan berat yang sama dengan tabung sampel dan
letakkan di posisi yang berlawanan sebagai penyeimbang.

11. Pada tahapan presipitasi protein, dilakukan proses sentrifugasi dimana anda akan
memperoleh sampel yang terpisah menjadi dua bagian :
a. Pada bagian manakah DNA akan berada
b. dan jelaskan jawaban anda.

Jawab :
DNA akan berada pada di bagian a yaitu di likuid bagian atas, sedangkan pada
bagian b adalah gumpalan molekul berat yaitu protein dan puing-puing sel lainnya.
Hal ini disebabkan oleh concentrated salt solution yang menggumpalkan protein dan
puing-puing sel tersebut ke bagian bawah tabung. Metode ini sering disebut dengan
salting-out method.
12. Pada tahapan selanjutnya adalah pengendapan DNA, reagen apa yang ditambahekan
untuk mendapatkan DNA?
Jawab:
Reagen yang ditambahkan untuk mendapatkan DNA setelah proses
sentrifugasi, yaitu isopropil alkohol. Karena DNA tidak larut, maka ditambah reagen
alkohol isopropil, sehingga bisa keluar ke larutan. Isopropanol berfungsi
mengendapkan DNA dari larutan. Isopropanol sering digunakan untuk presipitasi,
DNA karena efisiensi pengendapannya lebih tinggi daripada etanol dan membuat
pellet atau endapan tidak terlalu melekat pada bagian bawah microtube atau tabung
sampel. Hal ini juga memudahkan dapat melihat DNA yang menggumpal dengan
mata telanjang (16). Berdasarkan referensi juga diperoleh bahwa isopropanol kurang
volatil, sehingga dilakukan penambahan isopropanol dan etanol untuk mendapatkan
pellet atau endapan DNA dengan kemurnian tinggi (17).

13. Sadur dan resumekanlah sebuah protokol isolasi DNA yang berasal dari kit komersial
yang tersedia.
Jawab:
a. Protokol Mini Kit I DNA Plasmid EZNA® - Protokol Spin
Semua sentrifugasi harus dilakukan pada suhu kamar kecuali ada catatan
lain. Protokol ini dirancang untuk mengisolasi DNA plasmid E.coli yang ditanam
dalam kultur LB 1-5 mL semalam.
b. Bahan dan peralatan yang disediakan oleh pengguna:

• 100% etanol
• 100% isopropanol
• Microcentrifuge berkapasitas setidaknya 13.000 G
• Tabung mikrosentrifus 1,5 mL atau 2 mL bebas nuklease
• Tabung biakan
• Opsional: air deionisasi steril
• Opsional: penangas air atau inkubator bersuhu 70°C
• Opsional: larutan NaOH 3M
c. Sebelum memulai:
• Panaskan Buffer Elusi hingga 70°C jika DNA plasmid >10 kb
• Siapkan DNA Wash Buffer, HBC Buffer, dan Larutan I
d. Langkah-langkah:
1. Isolasi koloni tunggal dari lempeng selektif yang baru digores, dan
inokulasikan media LB 1-5 mL yang mengandung antibiotik selektif yang
sesuai. Inkubasi selama ~12-16 jam pada suhu 37°C dengan pengocokan kuat
(~300 rpm). Gunakan tabung biakan 10-20 mLatau labu dengan volume
minimal 4 kali volume biakan. Sangat disarankan bahwa strain negatif endA
dariE.colidigunakan untuk isolasi plasmid rutin. Contoh strain tersebut
termasuk DH5α® dan JM109®.
2. Centrifuge pada 10.000G selama 1 menit pada suhu kamar.
3. Tuang atau aspirasi dan buang media kultur.
4. Tambahkan 250 µL Solution I/RNase A. Vortex atau pipet ke atas dan ke
bawah hingga tercampur rata. Resuspensi lengkap pelet sel sangat penting
untuk mendapatkan hasil yang baik.
Catatan: RNase A harus ditambahkan ke Solusi I sebelum digunakan.
Silakan lihat petunjuk di bagian “Mempersiapkan Reagen” di Halaman 6.
5. Pindahkan suspensi ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL yang baru (tidak
disediakan).
6. Tambahkan 250 µL Larutan II. Balikkan dan putar perlahan tabung beberapa
kali untuk mendapatkan lisat yang jernih. Inkubasi 2-3 menit mungkin
diperlukan.
Catatan: Hindari pencampuran yang kuat karena ini akan memotong DNA
kromosom dan menurunkan kemurnian plasmid. Jangan biarkan reaksi lisis
berlangsung lebih dari 5 menit. Store Solution II tertutup rapat saat tidak
digunakan untuk menghindari pengasaman dari CO2 di udara.
Tambahkan 350 µL Larutan III. Segera balikkan beberapa kali hingga
terbentuk endapan putih flokulan.
Catatan: Sangat penting bahwa larutan dicampur secara menyeluruh dan
segera setelah penambahan Larutan III untuk menghindari presipitasi lokal.
7. Centrifuge dengan kecepatan maksimum (≥13.000G) selama 10 menit.
Sebuah pelet putih kompak akan terbentuk. Segera lanjutkan ke langkah
berikutnya.
8. Masukkan HiBind® DNA Mini Column ke dalam Collection Tube 2 mL.
9. Protokol Opsional untuk Ekuilibrasi Kolom:
 Tambahkan 100 µL 3M NaOH ke HiBind® DNA Mini Column.
  Centrifuge dengan kecepatan maksimal selama 30-60 detik.
 Buang filtrat dan gunakan kembali tabung pengumpul.
10. Pindahkan supernatan yang telah dibersihkan dari Langkah 8 dengan aspirasi
secara hati-hati ke dalam HiBind® DNA Mini Column. Berhati-hatilah untuk
tidak mengganggu pelet dan agar tidak ada serpihan seluler yang dipindahkan
ke HiBind® DNA Mini Column.
11. Centrifuge dengan kecepatan maksimum selama 1 menit.
12. Buang filtrat dan gunakan kembali tabung pengumpul.
13. Tambahkan 500 µL HBC Buffer.
Catatan: HBC Buffer harus diencerkan dengan isopropanol 100% sebelum
digunakan. Silakan lihat Halaman 6 untuk instruksi.
14. Centrifuge dengan kecepatan maksimum selama 1 menit.
15. Buang filtrat dan gunakan kembali tabung pengumpul.
16. Tambahkan 700 µL DNA Wash Buffer.
Catatan: DNA Wash Buffer harus diencerkan dengan etanol 100% sebelum
digunakan. Silakan lihat Halaman 6 untuk instruksi.
17. Centrifuge dengan kecepatan maksimum selama 1 menit.
18. Buang filtrat dan gunakan kembali tabung pengumpul.
Opsional: Ulangi Langkah 16-18 untuk Langkah Penyangga Pencucian
DNA kedua.
19. Sentrifuge HiBind® DNA Mini Column yang kosong selama 2 menit dengan
kecepatan maksimum untuk mengeringkan matriks kolom.
Catatan: Penting untuk mengeringkan matriks HiBind® DNA Mini Column
sebelum elusi. Residu etanol dapat mengganggu aplikasi hilir.
20. Pindahkan Kolom Mini DNA HiBind® ke tabung mikrosentrifus 1,5 mL
yang bersih.
21. Tambahkan 30-100 μL Elusi Buffer atau air deionisasi steril langsung ke
tengah membran kolom.
Catatan: Efisiensi elusi DNA dari HiBind® DNA Mini Column tergantung
pada pH. Jika menggunakan air deionisasi steril, pastikan pH sekitar 8,5.
22. Diamkan pada suhu kamar selama 1 menit.
23. Centrifuge dengan kecepatan maksimum selama 1 menit.
 Catatan: Ini mewakili sekitar 70% dari DNA terikat. Elusi kedua opsional
akan menghasilkan sisa DNA, meskipun pada konsentrasi yang lebih rendah.
24. Simpan DNA pada -20°C.
14. Apa parameter yang dapat digunakan untuk menganalisis kualitas DNA ynag diisolasi
dan bagaimana cara menentukannya?
Jawab :
Tentu saja parameter yang digunakan untuk menganalisi kualitas DNA yang
diisolasi yaitu kemurnian dan konsentrasi DNA. DNA berkualitas baik apabila
memiliki kemurnian antara 1,8-2,0 dan konsentrasi diatas 100 ng/ μ l berdasarkan
pengukuran dengan spektrofotometer. Nilai rasio 260/230 digunakan sebagai
parameter sekunder kemurnian isolasi DNA. Apabila DNA terkontaminasi protein
dan polisakarida maka nilai absorbansinya kurang dari 1,8 dan apabila DNA
terkontaminasi RNA maka nilai absorbansinya lebih dari 2,0 (18).
Selain itu prinsip dasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk
memisahkan DNA dari komponen-komponen lainnya yang harus dilakukan dengan
baik dan bebas dari kontaminasi sehingga diperoleh DNA hasil isolasi dengan kualitas
yang baik. Salah satu metode yang umum digunakan dalam isolasi berbagai bakteri
salah satunya seperti M. tuberculosis adalah metode Boom. Prinsip dari metode Boom
yaitu didasarkan pada melisiskan dan menonaktifkan nuklease dari agen chaotropic
guanidinium tiosianat bersama dengan sifat ikatan asam nukleat pada partikel silika
atau diatom dengan adanya agen ini ensi DNA yang digunakan. Proses isolasi DNA
dengan menggunakan metode Boom dilakukan dengan menggunakan larutan buffer
lisis L6 yang terdiri dari Tris-HCl, GuSCN (Guanidine tiosianat), EDTA dan Triton-
X-100. Buffer lisis L6 mengandung GuSCN sebagai chaotropic agent yang melisis sel
pada sampel sehingga akan mengeluarkan DNA. GuSCN dalam konsentrasi tinggi
mengakibatkan DNA akan terikat pada diatom (fosil dari dinding sel alga uniseluler)
yang akan diendapkan dengan proses sentrifugasi. EDTA (Ethylenediamine
Tetraacetic Acid) akan membentuk kompleks 2+ (chelate) dengan ion logam seperti
Mg yang merupakan kofaktor DNAase (19).
Selain BOOM dan beberapa parameter lainnya, analisis kualitas DNA dapat
dilihat dari pita elektroforegram DNA hasil PCR kedua metode dengan mengamati
ketebalan dan ketajaman pitanya. Selain itu, kualitas DNA juga ditentukan dengan
analisis kemurnian DNA hasil isolasi pada kedua metode yang dilakukan
menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis dengan melihat rasio Absorbansi
 λ260/Absorbansi λ280. Berdasarkan hasil elektroforegram dalam gambar dibawah
menunjukkan bahwa pita DNA produk PCR menggunakan metode Boom modifikasi
menghasilkan pita yang relatif lebih tebal dan tajam dibandingkan dengan pita DNA
produk PCR menggunakan metode Boom original. Hal ini menandakan bahwa
kualitas DNA yang dihasilkan oleh metode Boom modifikasi relatif lebih baik
dibandingkan dengan DNA yang dihasilkan oleh metode Boom original (19).

Gambar 4. Parameter analisis DNA

15. Analisis suatu sampel DNA menghasilkan data sebagai berikut. Apa kesimpulan anda
terkait kemurnian/ kualitas DNA yang diisolasi, jelaskan jawaban anda.

a.

Gambar 5. Data Sampel DNA 1

b.
Jawab :
a. Berdasarkan gambar pada poin a diketahui bahwa kualitas DNA dilihat dari nilai
absorbansi yang diukur pada panjang gelombang 280 dan 260 terdapat pada 1,82.
Kemudian untuk nilai absorbansi pada angka 230 dan 260 diperoleh nilai 2,21.
Hal ini mengartikan nilai kemurnian DNA berada diatas normal. Hal ini juga
menandakan hasil kemurnian DNA yang diuji tidak terkontaminasi protein karena
nilai rasio 260/280 berada diatas 1,8 dan hal ini tidak menunjukkan adanya
senyawa organik yang tidak diinginkan seperti senyawa organik Guanidine HCL,
Guanidine Tiosianat, fenol, atau Trizol karena memiliki nilai rasio 260/230 yang
berada diatas 2 ng/ μ L. Diketahui juga nilai konsentrasi DNA sebesar 304,9 ng/
μ L. Hal ini menunjukkan konsentrasi DNA berada pada batas normal (100 ng/ μ L
) dan dikategorikan baik. Dari 2 parameter yang sudah dijelaskan tersebut maka
disimpulkan tidak terdapat kontaminan dari hasil kemurnian DNA yang diisolasi
tersebut (18).
b. Berdasarkan gambar pada poin b diketahui bahwa kualitas DNA dilihat dari nilai
absorbansi yang diukur pada panjang gelombang 280 dan 260 terdapat pada 1,64.
Kemudian untuk nilai absorbansi pada angka 230 dan 260 diperoleh nilai 0,70.
Hal ini mengartikan nilai kemurnian DNA berada dibawah normal. Hal ini juga
menandakan hasil kemurnian DNA yang diuji telah terkontaminasi protein karena
nilai rasio 260/280 berada dibawah 1,8 dan hal ini menunjukkan adanya senyawa
organik yang tidak diinginkan seperti Guanidine HCL, Guanidine Tiosianat, fenol,
atau Trizol karena memiliki nilai rasio 260/230 yang berada dibawah 2 ng/ μ L.
Diketahui juga nilai konsentrasi DNA sebesar 257,1 ng/ μ L. Hal ini menunjukkan
konsentrasi DNA berada pada batas normal (100 ng/ μ L) dan dikategorikan baik.
Dari 2 parameter yang sudah dijelaskan tersebut maka disimpulkan terdapat
kontaminan dari hasil kemurnian DNA yang diisolasi tersebut (18).
 Berdasarkan hasil pengamatan terhadap kedua gambar tersebut diketahui
bahwa hasil kemurnian DNA yang diuji dengan spektrofotometer UV-Vis
terkontaminasi protein karena berada dibawah 1,8. Sedangkan untuk kemurnian
DNA yang diuji dengan spektrofotometer Nanodrop dapat dikatakan murni dan
tidak terkontaminasi (diatas normal) karena berada pada range1,8-2,0. Rata-rata
kemurnian DNA dengan spektrofotometer UV-Vis berada pada angka 1,583 dan
pada spektrofotometer nandodrop 1,835. Dalam hal ini, nilai kemurnian DNA
pada spektrofotometer UV-Vis di bawah normal dan pada spektrofotometer
nanodrop DNA dikatakan murni.

6. PENDALAMAN TOPIK
A. Metode Salting-in dan Salting-out
Metode salting-out merupakan metode yang sederhana dan tidak beracun
untuk esktraksi DNA. Metode ini dilakukan dengan mengisolasi DNA kualitas
tinggi dari suatu sampel. Metode standard dari salting-out adalah menambahkan
protein K dan RNase ke dalam sampel setelah proses lisis pada sel. Garam / NaCl
yang terkonsentrasi tinggi akan membuat protein ter-presipitasi keluar dari solution
tersebut karena ion yang dihasilkan akan meningkatkan muatan listrik di sekitar
protein yang mengakibatkan tertariknya mantel air dari koloid protein sehingga
interaksi hidrofobik di antara sesama molekul protein menurunkan kelarutan
protein. Kemudian sampel akan disentrifugasi dan DNA akan terpisah dengan
membersihkannya menggunakan ethanol. Sedangkan, metode Salting-in terjadi
pada saat konsentrasi garam rendah, ion garam yang dihasilkan akan melindungi
molekul-molekul protein dan mencegah bersatunya molekul-molekul protein
sehingga protein tetap melarut (20), (13).
Pada praktikum ini menggunakan metode salting-out karena terdapat
tahapan dimana praktikan harus memisahkan DNA dari protein dan puing-puing
sel (debris) dengan concentrated salt solution kemudian dilakukan sentrifugasi
dengan micro centrifuge. Hasil dari tahapan tersebut adalah terdapat gumpalan
protein dan puing-puing sel yang turun ke bawah tabung.
B. Metode Komersial Kit Lainnya
 E.Z.N.A.® Plasmid DNA Mini Kit I dirancang untuk mengisolasi hingga 25
µg DNA plasmid berkualitas tinggi dari 1-5 mL biakan bakteri dalam waktu
kurang dari 30 menit. Pemurnian DNA plasmid mengikuti metode lisis basa dan
disederhanakan dengan teknologi HiBind® Mini Column menjadi tiga langkah
cepat: Bind, Wash, dan Elute. DNA plasmid yang dimurnikan segera siap untuk
berbagai macam aplikasi hilir seperti skrining rutin, pencernaan enzim restriksi,
transformasi, PCR, dan pengurutan DNA.
E.Z.N.A.® Plasmid DNA Mini Kit tersedia dalam dua format – Q-spin
(D6942) dan V-spin (D6943). D6942 (Q-spin) menampilkan kolom tanpa penutup
sedangkan D6943 (V-spin) menyertakan kolom yang dilengkapi penutup. Kolom
sebaliknya identik dalam penggunaan dan aplikasi dan dapat digunakan baik
dalam protokol vakum atau sentrifugasi. Alat ini memiliki keunggulan cepat
karena proses pemurnian DNA plasmid dalam waktu kurang dari 30 menit, aman
karena tanpa ekstraksi fenol/kloroform, serbaguna karena tersedia format spin dan
vakum, dan berkualitas tinggi karena DNA cocok untuk berbagai aplikasi hilir.
Untuk spesifikasi yaitu hanya untuk penelitian dan tidak untuk digunakan dalam
prosedur diagnostik.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Octavia D, et al. Isolasi DNA Tumbuhan Hasil Eksplorasi di Nusakambangan dengan

Metode Kit di Laboratorium Treub, Kebun Raya Bogor. Pros Biol Achiev Sustain Dev
Goals with Biodivers Confronting Clim Chang. 2021;291–2.
2. National Human Genome Research Institute. About Genomics [Internet]. Talking
Glossary of Genomic and Genetic Terms Chro. 2023. Available from:
https://www.genome.gov/genetic-glossary/Chromosome
3. Hairuddin R. Analisis DNA Pada Tanaman Gandum (Triticumaestivum l.). J Din.
2016;4(2):41–6.
4. Astuti W, Nurdin G, Nur S, et al. Konsep Dasar Biologi. Makassar: Cendekian
Publisher; 2022.
5. Yuliana A, Faturohman M. Teori Dasar dan Implementasi Perkembangan Biologi Sel
dan Molekuler. Surabaya: CV Jakad Media Publishing; 2020.
6. Alberts B, Johnson A, Lewis J. Molecular Biology of the Cell. Struct Funct DNA
[Internet]. 4th ed. 2002; Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26821/%0A
7. National Human Genome Research Institute. About Genomic. :Talking Glossary of
Genomic and Genetic Terms Anti. Available from: https://www.genome.gov/genetics-
glossary/antisense%0A
8. Hermono B, Bintari S, Mustikaningtyas D. Identifikasi Salmonella sp Pada Jajanan Jus
Buah di Kecamatan Gunungpati Semarang dengan PCR. J MIPA. 2017;40(2):68–73.
9. Puspitasari RL, Elfidasari D, Perdana AT. Deteksi Kandungan Babi pada Makanan
Berbahan Dasar Daging di Kampus Universitas Al Azhar Indonesia. J Al-Azhar
Indones Seri Sains dan Teknol. 2019;5(2):66–9.
10. Cahyani A, Wiguna L, Putri R, et al. Aplikasi Teknologi Hurdle Menggunakan Iradiasi
Gamma dan Penyimpanan Beku untuk Meredukasi Bakteri Patogen pada Bahan
Pangan: Review. J Pangan dan Agroindustri. 2015;3(1):73–99.
11. Ngili, Yohanis. Biokimia: Aliran Informasi Genetika. 1st ed. Yogyakarta: Innosain;
2015.
12. Adriany D, Bakri A, Bungalim M. Perbandingan Metode Isolasi DNA Terhadap Nilai
Kemurnian DNA untuk Pengujian White Spot Syndrom Virus (WSSV) pada Lobster
Bambu (Panulirus versicolor). Pros Simp Nas VII Kelaut dan Perikan. 2020;
13. Shokrzadeh M, Mohammadpour A. Evaluation of A Modified Salt-Out Method for
 DNA Extraction from Whole Blood Lymphocytes: A Simple and Economical Method
for Gene Polymorphism. Pharm Biomed Res. 2018;4(2):28–32.
14. Widyanti E, Moehadi B. Proses Pembuatan Etanol Dari Gula Menggunakan
Saccharomyces Cerevisiae Amobil. Metana. 2016;12(2):31–8.
15. Triani N. Isolasi DNA Tanaman Jeruk dengan Menggunakan Metode CTAB (Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide). F Saintek UNIRA Malang. 2020;3(2):221–6.
16. Novianti A, Andjani N, Pambudi S, et all. Pengaruh ekstrak etanol daun murbei
(Morus Alba L.) dengan glibenklamid terhadap ekspresi gen CYP3A4 pada kultur sel
Hepg2. Pharmacon J Farm Indones. 2019;15(1):29–36.
17. Nuralih N, Churiyah C, Pambudi S. Pengaruh ekstrak etanol daun murbei (Morus Alba
L.) dengan glibenklamid terhadap ekspresi gen CYP3A4 pada kultur sel Hepg2.
Pharmacon J Farm Indones. 2019;15(1):29–36.
18. Furqoni A, Yudianto A, Wardhanti P. Pengaruh rendaman Air terhadap kualitas DNA
pada Sperma dengan STR-CODIS D13S317 dan D21S1. J Biosains Pascasarj.
2019;17(1):41–54.
19. Fatmawati D, Wiranata IN, Yowani SC. Perbandingan Kualitas DNA dengan
Menggunakan Metode Boom OrigInal dan Boom Modifikasi pada Isolat
Mycobacterium tuberculosis 151. J Kim. 2015;9(1):41–6.
20. Karso K, Wuryanti W, Sriatun S. Isolasi dan Karakterisasi Kitinase Isolat Jamur
Akuatik Kitinolitik KC3 dari Kecoa (Orthoptera). J Kim Sains dan Apl.
2014;17(2):51–7.