TEKNIK-TEKNIK SITOGENETIK

1. Tahapan-tahapan utama untuk mempelajari kromosom adalah :

1. Pengumpulan bahan untuk mengoptimalkan jumlah sel-sel mitosis
atau meiosis.
2. Perlakuan awal untuk menghambat perubahan-perubahan yang
tidak diiinginkan.
3. Fiksasi untuk menstabilkan struktur seluler.
4. Pewarnaan untuk mengkondisikan agar diantara struktur-struktur
sel terjadi penampakan yang kontras.
5. Persiapan preparat agar dapat diamati dengan optimal.
6. Pengumpulan data dan pengukuran (micrometry).
Tujuan dari pengembangan teknik sitologi adalah untuk mendapatkan informasi pada
jumlah, struktur dan perilaku kromosom selama pembelahan sel.
Prinsip-prinsip dasar sama pada semua spesies.
Beberapa modifikasi prosedur --------- u/ sp yang berbeda
-melihat gambaran ttt dari kromosom.

Ada beberapa metoda u/

Sel-sel hewan & tumbuhan
u/ interpretasi yang baik persiapan yang baik, perlu perhatian perhatian detail pada
setiap tahapan, dimulai dari pengumpulan bahan .
A.

PENGUMPULAN BAHAN
Pengamatan kromosom selama pembelahan sel
Sel-sel somatik mitosis
Sel-sel germinal mitosis
Gametogenesis - meiosis
Pada bbrp sp (thn berbunga) gamet-gamet haploid melanjutkan mitosis.
1. Mitosis jaringan yang sehat dengan sel-sel yang aktif membelah
a. hewan kulit, ss tl, sdp, sirip,insang, mukosa usus, ujung ekor
b. tumbuhan pucuk, kambium, ujung akar
kalus dapat juga digunakan problem---variasi
tabung polen juga dapat digunakan agak sulit
Contoh : teknik pengumpulan sampel ujung akar

Akar tumbuh aktif dr kecambah atau th sehat --- (teknik pengenyamahan)

Yang terbaik 1-2 cm
Mitotic Index (MI) tinggi
MI adalah jumlah sel yang aktif membelah
Jumlah sel pada sampel
Perhatikan waktu pengambilan.
2. Meiosis
Morfologi kromosom tidak jelas, ttp fase-fase ttt dapat digunakan utk
menetapkan jumlah kromosom.
a. Meiosis pada sel-sel hewan
Sel telur ist pada diplotene dapat digunakan
Spermatosit lebih banyak
b. Meiosis pada sel-sel tumbuhan
PMC umum digunakan
B.

PERLAKUAN AWAL PADA BAHAN

-

menghentikan pembentukan spindle

meningkatkan jumlah sel-sel metafase dengan menahan kromosom pada
bidang metafase
- pemampatan lengan kromosom agar mudah dihitung dan menonjolkan
konstriksi primer
- meningkatkan viskositas dalam sitoplasma
- memudahkan penetrasi fiksatif dengan menyingkirkan barier-barier spt
dinding sel.
Secara umum, perlakuan awal akan menyebabkan terjadinya perubahan dalam
sitoplasma dan inti untuk membantu penampakan morfologi kromosom.
Terdapat perlakuan awal yang khusus untuk tujuan khusus dan untuk spesies
yang berbeda.
1. Perlakuan awal scr fisik
- Air es ------------- Graminae
12 24 dalam refrigerator
Air es akan menahan kebanyakan sel pada metafase
dan menonjolkan wilayah yang menyerap warna lebih
banyak atau heterokromatin pada wilayah sentromer
dan telomer
Kromosom cenderung bergerombol dan lengket sukar utk dihitung.
2. Perlakuan awal scr kimia
Seluruh perlakuan dengan zat kimia akan memberikan akibat yang hampir
sama.
-

Colchicine (Kolkhisin)
alkaloid, digunakan 0,2 0,5 % selama 1-2 jam temp.ruang.

suatu microtubule inhibitor arrest at mtph

cuci cepat ???

cocok utk analisis pada sbgn besar org. Tk tinggi

8- hydoxy quinoline
suatu anti oxidant
efektif untuk tumbuhan dengan kromosom yang besar - kons. prim&sek
jelas NOR
digunakan 0.002 M
memperpendek kromosom dan membantu penyebaran kromosom melalui
penginaktifan spindle fiber
Mono-bromonapthalene
mempunyai efek yang sama dengan kolkhisin
menghentikan pertumbuhan sel (krn pemb. spindle terhambat,
pemendekan dan straightening kromosom)
water soluble, jadi larutan jenuh digunakan untuk perlakuan awal selama
2 4 jam pada temp ruang.
Kromosom setelah perlakuan awal tidak berespon pada kebanyakan
fiksatif karena kromosom tetap melakukan perubahan-perubahan kimia ttt
sehingga fiksatif ttt tidak dapat berpenetrasi. Fiksatif yang cocok adalah
Farmers (95%alkohol gaa dalam perbandingan 3 : 1).
Paradichlorobenzene
cocok untuk tumbuhan yang mempunyai kromosom yang kecil.
Digunakan dalam bentuk larutan jenuh selama 2 21/2 jam pada suhu
ruangan.

ATTENTION : Sifat dari senyawa yang digunakan dalam perlakuan awal ini
dapat menyebabkan pembelahan sel pada jaringan hidup akan terganggu, jadi
hindari kontak, gunakan sarung tangan serta jangan sampai menghirup
maupun mencium larutan tsb.
C.

FIKSASI

Mematikan dan mengawetkan adalah dua proses yang berbeda, tetapi biasanya
dilakukan dengan menggunakan satu macam senyawa kimia
Mematikan adalah menghentikan seluruh proses sel atau jaringan dari organisme..
Fiksasi adalah
pengawetan seluruh elemen seluler dan struktural dengan
mempertahankan kondisis alaminya sedapat mungkin.. Peran fiksatif adalah untuk
menghentikan sel pada fase tertentu dalam pembelahan sel tanpa menyebabkan
penyimpangan, penggumpalan, pengerutan kromosom.
Faktor-faktor yang mempengaruhi fiksasi antara lain adalah:
- temperatur
- pH
- osmolaritas
- kecepatan penetrasi

kecepatan perubahan fisika dan kimia

lama fiksasi

Beberapa hal yang harus diperhatikan:

- pilih dengan baik fiksatif yang akan digunakan
- organisme yang kecil dapat difiksasi keseluruhannya sedangkan yang
besar harus dipotong potong menjadi kecil agar penetrasi fiksatif dapat
cepat dan merata
- volume fiksatif + 10 12 x jaringan yang difiksasi
- beberapa jaringan memerlukan perlakuan khusus agar fiksatif dapat masuk
dengan sempurna ---------- lilin, cutin, suberin, lapisan kutikula yang
hidrofobik, permukaan yang berbulu
Beberapa fiksatif
Perlakuan fisika:
Pendinginan dengan liquid nitrogen efektif dalam mempertahankan struktur sel
dengan difusi yang sangat kecil dan hampir tanpa ada perubahan enzimatis. Namun
jika terbentuk kristal-kristal, maka sel dapat rusak.
Perlakuan kimia:
Kunci dari fiksatif kimia adalah keseimbangan antara senyawa yang digunakan.
Misalnya : asam menyebabkan penggumpalan
Alkohol mengkerutkan struktur strruktur sel
Campuran keduanya dalam keadaan seimbang dapat mempertahankan struktur sel
seperti dalam keadaan alaminya.
1. Larutan Carnoys aag : et-oh (95-100%) = 1 : 3
Disiapkan segar u/ akar dan anther --- 24 jam temp. Ruang
------- simpan dalam dingin
2. Larutan Carnoys II aag, choloroform, et-oh = 1 : 3 :6 ----- PMC
Memperjelas ----- > minyak & lemak yang meghalangi
3. Larutan asam propionat alkohol --- p.a, et-oh (95-100%) = 1 : 3
u/ fiksasi material-material meiosis
baik u/ tumbuhan yang kromosomnya kecil-kecil.
Penjernihan & Maserasi (hidrolisis)
Ujung akar hidrolisis panas dengan 1 N HCl (600C) 5 15 menit.
ujung akar tetap putih
lainnya menjadi transparan
D.

PEWARNAAN KROMOSOM

Tujuan dari pewarnaan adalah kromosom atau struktur sel lainnya dapat dilihat
melalui mikroskop. Untuk struktur yang spesifik ada pewarna ynag spesifik pula.

agar objek dapat diamati karena tampak kontras, dengan demikian kromosom- 1.
Pewarna aceto carmin
1 g bubuk carmine ditambah hingga 100 ml aag, panaskan. Setelah
didinginkan, saring dan simpan dalam botol gelap. Warna laurutannya
adalah merah tua.
Carmine dapat diganti dengan orcein untuk membuat aceto orcein.
Pewarna ini efektif untuk kromosom-kromosom somatik. Pindahkan akar ke
pewarna setelah perlakuan awal. Pewarna ini bekerja sebagai fiksatif juga.
2. Pewarna Feulgen
1 g basic fuchin dilarutkan dalam 200 ml air mendidih dan campuran diaduk,
dinginkan dan saring. Tambahkan 300 ml 1 N HCl, 3 g potassium
metabisulphite. Simpan ditempat gelap dalam botol tertutup rapat dan
dibungkus dengan aluminium foil hingga keluar warna merah muda.
Pewarna ini spesifik untuk DNA dalam kromosom.
Ujung akar harus dihidrolisa dalam 1N HCl (600C) sebelum diwarna.
Setelah ujung akar dihidrolisis, cuci dalam air destilasi dan pindakan ke
pewarna Feulgen selama 1 2 jam dalam suhu kamar. Wilayah yang telah
diwarna akan berwarna merah muda dan dapat dipotong dan tempatkan pada
kaca objek. Tambahkan 1 % aceto carmin, tutup dengan kaca penutup.
3. Pewarna Giemsa
Pewarna yang sangat umum digunakan. Dengan konsentrasi 3% dalam
larutan buffer phosphat selama 3 15 menit akan dihasilkan kromosom yang
terwarna dengan baik.
E.

PEMBUATAN PREPARAT

Bahan yang telah diwarna tersebar pada kaca objek. Tutup dengan kaca penutup dan
panaskan sebentar dan tekan jangan ada pergeseran scr lateral.
Untuk preparat temporer tutup dengan kutex / lilin parafin
Untuk preparat permanen - tempatkan slide pada block dry ice
- angkat kaca penutup
- kandungan air pada slide ganti dengan medium penempel yang bersifat
resin, misalnya canada balsam.
Selain teknik squash apusan dan air drying
F.

PENCATATAN DATA DAN PENGUKURAN

Dapat dilakukan dengan menggunakan Camera Lucida. Kombinasi antara cermin dan
prisma yang digunakan akan memberikan gambaran kebidang yang sama untuk
digambar. Penggunaan kamera Lucida labih baik dibanding dengan photo kamera
karena kita dapat memfokuskan melalui spesimen dan menyatakan kromosom mana
yang di atas sehingga apa yang diamati dapat lebih representatif. Photograf terbatas
pada kedalaman dari fokus dan membutukkan persiapan yang lebih baik.
Pengukuran dapat dilakukan dengan menggunakan skala Vernier atau dengan
menggunakan mikrometer

TEKNIK-TEKNIK SITOGENETIK
Konsep:
1. Variasi lokal pada kromatin yang sedang mengalami coiling dan variasi
pada kepadatan kromatin akan memberikan pola pewarnaan yang
berbeda-beda sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi
masing-masing kromosom
2. Kromosom politen akan memungkinkan pemitaan dengan resolusi
yang sangat baik.
3. Banding C menggambarkan konstitusi heterokromatin. Pola banding
G pada kromosom mitosis mirip dengan pola kromomere kromosomkromosom bivalen meiosis pada pachyte.
4. Individual lokus pada kromosom dapat diperlihatkan dengan
fluorescen in situ hybridizatin (FISH).
5. FISH memungkinkan chromosome painting dengan menggunakan
probe yang spesifik.
6. FISH membuktikan bahwa kromosom tidaklah secara random tersebar
pada inti yang sedang dalam interfase, melainkan masing-masing
kromosom mempunyai teritorinya sendiri.
PEMITAAN KROMOSOM
Pewarnaan Giemsa.
Penemuan teknik-teknik yang menghasilkan pola-pola pemitaan pada kromosom
merupakan salah satu perkembangan yang nyata dalam sitogenetik yang secara
bertahap telah memungkinkan untuk membedakan kromosom-kromosom pada spesies
yang berbeda-beda. Meyafase mitosis adalah stadium yang paling baik untuk
mempelajari morfologi kromosom.
Pewarna Giemsa spesifik untuk heterokromatin konstitutif yang berbatasan dengan
sentromer dan telomer.
Pita/ larik/band didefinisikan sebagai bagian dari kromosom yang dengan jelas dapat
dibedakan dari segmen yang berdekatan dengan munculnya daerah yang lebih terang
aatau lebih gelap.
Teknik Pemitaan Giemsa-C telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi
individual kromosom pada kebanyakan spesies melalui penampakan posisi
heterokromatin konstitutif.
Catatan beberapa istilah :
- Kromatin ---- DNA/protein complex yang membangun kromosom.
- Heterokromatin ------- kromatin yang cenderung nyak menyerap zat
warna sehingga menjadi lebih gelap. Heterokromatin cenderung lebih
mampat.
- Eukromatin------- kromatin yang cenderung sedikit menyerap zat warna
sehingga terwarna lebih terang.

Heterokromatin konstitutif ------- kromatin yang tetap terkondensasi

selama interfase pada semua jaringan. Biasa sering ditemukan dekat
sentromer, telomer dan nucleolarr organizing regions (NORs).
Heterokromatin fakultatif ------- kromatin yang dapat terkondensasi
atau merenggang selama interfase, tergantung pada tahapan perkembangan
atau jaringan.

Kromosom politen:
Pada sel-sel khusus dari beberapa spesies, kromosom melakukan beberapa siklus
replikasi DNA tanpa diikuti oleh mitosis. Hasilnya adalah kromosom politen yang
dapat mengandung ribuan kromosom dan secara tepat bersusun sepanjang lengannya.
Kromosom politen dapat diwarna dan diperlihatkaan pada inti interfase. Yang paling
sering digunakan untuk mempelajarinya adalah dengan menggunakan kromosom
politen pada kelenjar ludah Drosophilla. Karena kromosom interfase lebih panjang
dari pada sel-sel mitosis, maka lokus dapat diidentifikasi pada kromosom politen
dengan resolusi yang sangat baik. ---------- lihat gambar kromosompoliten kelenjar
ludah Drosophila.
FLUORESCENCE IN-SITU HYBRIDIZATION (FISH)
Fish digunakan untuk memperjelas bagian spesifik dari urutan DNA. Prinsipnya ;
urutan DNA di tandai dengan adanya nukleotida nukleotida yang di label secara
flourescen. DNA bertanda ini disebut dengan PROBE. Probe diinkubasi dengan
kromosom pada kaca objek. Pada bagian yang mengandung urutan yang sama
dengan probe, akan terjadi perpasangan basa antara probe dengan kromosom. Sisi
perpasangan dengan basa probe akan tampak berfloresensi melalui UV mikroskop.
In situ hybridizatin mrpk teknik yang dapat digunakan untuk mempelajari distibusi
spesifik dari urutan asam nukleat pada kromosom dan untuk menentukan lokasi dari
urutan DNA yang sangat repetitive. Perubahan pada urutan repetetif yang sangat
tinggi menggambarkan pengemasan secara fisik dalam genom sepanjang masa dalam
evolusi suatu spesies. Teknik ini digunakan dalam studi DNA tumbuhan maupun
hewan. Sejumlah modifikasi dari teknik ini telah dilakukan pada studi diagnosa
genetika manusia.
Sama halnya dengan Giemsa banding, terlebih dahulu harus dilakukan fiksasi pada
kromosom sebelum di denaturasi. Denaturasi pada DNA probe dan kromosom target
perlu dilakukan agar perpasangan dengan komplemennya dapat berlangsung.
Fiksasi: Kromosom difiksasi dalam metanol : aag (3:1). Preparat dibuat dengan
teknik squash dan kemudian cover diangkat supaya sel dapat kering.
Denaturasi : inkubasi pada 720C dalam 50 70% formamide dan 2 X SSC (NaCl)
Penambahan Probe : Molekul probe adalah sepotong DNA yang dipilih untuk urutan
target ttt dari kromosom. Rutan target dapat 1 kbp atau lebih dari 15 kbp.
Probe yang telah didenaturasi dihibridisasi dengan kromosom yang ada pada kaca
objek, tutup dan biarkan semalam pada 370C dalam 50% formamide, 2X SSC dan

10% detran sulfat. Setelah diinkubasi, probe yang tidak berpasangan dicuci dan
preparat dilabel dengan menggunakan penanda immuno fluorescent dan bahan antifading.
FISH digunakan dalam studi pola pola kromosom banding, distribusi kromatin pada
inti interfase, dan abnormalitas kromosom. Karena selama interfase kromosom
terurai(merenggang) dalam bentuk kromatin maka sangatlah mungkin untuk
memperoleh resolusi yang lebih baik sehingga perubahan struktural yang kecilpun
dapat terdeteksi. Jika probenya merupakan gen tunggal maka gene yang diharapkan
sajalah yang akan tampak berpendar dengan teknik FISH ini.

Pembuatan Kariotipe: (Untuk Praktikum)

1.
2.
3.
4.

Gunting foto masing-masing kromosom hasil pemotretan preparat kromosom.

Pasangkan dengan pasangan homolognya.
Susun menurut panjangnya.
Amati tipe kromosom dan karakteristik kromosom yang mungkin ada
(konstriksi sekunder dan satelit ).

Pengukuran dan penghitungan kromosom:

1. Letakkan film negatif hasil pemotretan kromosom pada alat proyeksi
(enlarger) di dalam kamar gelap.
2. Gambarkan hasil proyeksi ke selembar kertas.
3. Ukur lengan panjang dan lengan pendek kromosom hasil gambar proyeksi
dengan kaliper.
4. Hasil pengukuran digunakan untuk menentukan Panjang relatif kromosom
(PRK), Rasio lengan kromosom (RLK) dan Harga numerik posisi sentromer
(HNPS).
PRK

= Panjang suatu kromosom x 100

Panjang total kromosom

RLK

= Panjang lengan panjang suatu kromosom

Panjang lengan pendek suatu kromosom

HNPS = Panjang lengan pendek suatu kromosom x 100

Panjang suatu kromosom

Penentuan kriteria tipe kromosom (Levan et. al., 1964)

HNPS
50,00 37,50
37,49 25,00
24,99 12,50
12,49 0,00

RLK

Tipe kromosom

1,00 1,67
1,68 3,00
3,01 7,00
7,01 -

Metasentrik (M)
Submetasentrik (SM)
Subtelosentrik (ST)
Telosentrik (T)