Teknik

Pewarnaan
DIII Teknologi Laboratorium Medis
Pewarnaan dalam Mikroteknik
Pewarnaan histologi adalah sebuah teknik yang digunakan
untuk memberikan warna pada organel sel sehingga lebih
mudah diamati di bawah mikroskop.

Tujuan pewarnaan:
Agar unsur-unsur jaringan tampak jelas & dapat dibedakan
bagian-bagiannya di bawah mikroskop
Macam-macam zat warna histologi

1 Berdasarkan asalnya

2 Berdasarkan sifatnya

3 Berdasarkan kemampuan

4 Berdasarkan pengaruh zat warna terhadap objek

 Berdasarkan asalnya

Alamiah Sintetis

Berasal dari tumbuhan atau hewan. Dibuat oleh pabrik.

Contoh: Hematoxylin dari H.- Contoh: Crystal violet, malachite
campechienum L., Carmin dari green, safranin, dll
Caceuscacti (insecta pada cactus)
 Berdasarkan sifatnya

Asam Basa

Garam-garam dari asam pem- Garam-garam dari basa pem-

bawa warna dan radikal basa tak bawa warna dan radikal asam
berwarna. tak berwarna.
Contoh: Asam fuchsin, Eosin Contoh: Basic fuchsin hema-
toxylin
Berdasarkan kemampuan

Substantif Ajektif

Mampu langsung mewarnai Berfungsi dengan baik apabila

jaringan. dibantu oleh zat lain.
Contoh: Eosin, Safranin, Fast Contoh: Hematoxylin
green, Janus green
Berdasarkan pengaruh zat warna
terhadap obyek

Efektif Difus

Hanya mewarnai satu atau be- Mewarnai seluruh jaringan

berapa jaringan saja. hanya daya serapnya tidak
Contoh: Toluidin blue untuk sama.
jaringan mesenterium yang jelas Contoh: Eosin
hanya granula
 Macam zat warna dan fungsinya
Zat Warna Jaringan
Hematoxylin, Fast green, Anilin blue, Asam fuchsin Dinding sel berselulosa
Safranin, Crystal violet Dinding sel berlignin
Safranin, Crystal violet, erythrosin Dinding sel berkutin
Besi hematoxylin rhutenium red Lumela tengah
Iron hematoxylin, Safranin, Crystal violet, Orcein Kromosom
Iron hematoxylin Mitokondria
Eosin, erythrosine fast green, orange G (gold orange) Sitoplasma
Iron hematoxylin, Safranin, Fast green Filamen fungi pada jaringan
Metil green syronin DNA dan RNA
Anilin methyviolet Epidermis hewan dan manusia
 Cara Penggunaan Zat Warna

1. Pewarnaan Simultan
2 atau lebih zat warna dipakai bersama-sama
Contoh: Larutan malory (anilin blue dan orange G)

2. Pewarnaan Suksedan
2 atau lebih zat warna diberikan secara bergantian dis-
elingi dengan pencucian
Contoh: Safranin-Fast green-Hematoxylin-Eosin
Dalam teknik pewarnaan histokimia sering
digunakan beberapa pewarna berikut ini:
Pewarnaan pada preparat dibedakan menjadi dua jenis,
1) pewarnaan umum
Pewarnaan umum menggunakan Hematoxylin – eosin (HE) yang berfungsi untuk
memberi gambaran umum suatu jaringan.

2) pewarnaan khusus
Pewarnaan khusus adalah pewarnaan yang digunakan untuk melihat satu macam
jenis organel atau untuk membedakan jaringan tertentu.

Beberapa metode yang digunakan dalam pewarnaa khusus adalah :

- Alcian blue (AB)  mendeteksi karbohidrat asam  warna biru,
- Periodic acid schiff (PAS)  mendeteksi karbohidrat netral  warna magenta,
- Pewarnaan Lektin  mendeteksi residu gula dan zat kompleks lain dalam
jaringan
 1. Hematoxylin Eosin (HE)
Merupakan pewarnaan rutin, yang paling banyak digunakan.
Prinsip: inti yang bersifat asam akan menarik zat/ larutan yang bersifat basa sehingga
akan berwarna biru. Sitoplasma bersifat basa akan menarik zat /larutan yang bersifat
asam sehingga berwarna merah.
Menggunakan 2 macam zat warna
yaitu:
 Hematoksilin : memulas inti sel
dan memberikan warna biru
(basofilik)
 Eosin : yang merupakan counterstaining
hematoksilin, memulas sitoplasma sel
dan jaringan penyambung dan
memberikan warna merah muda dengan
nuansa yang berbeda

Komposisi hematoksilin
- Kristal haematoxylin…. 1 gr
- Akuades……………... 1000 ml
- Sodium iodate………... 0,2 gr
- Ammonium/potassium alum...50 gr
- Citric acid…………...... 1 gr
- Chloralhydrate………... 50 gr
Komposisi Eosin (Eosin-alkohol Stock
1%)
- Eosin ……………... 1 gr
- aquades……………… 20 ml
- Larutkan dan tambahkan alkohol
95% ….. 80 ml
Cara pembuatan Hematoksilin
- Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam
aquades.
- Tambahkan Haematoxylin dan campurkan se-
cara baik.
- Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid, dan
Chloralhydrate.
- Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur
dengan baik.
- Biarkan semalam dan saring dengan kertas sar-
ing besoknya.
Cara pembuatan Eosin
- Eosin-alkohol stock 1 bagian
- Alkohol 80% 3 bagian
- Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tam-
bahkan Asam Asetat glasial 0,5 ml untuk setiap
100 ml larutan dan aduk dengan baik.
Pewarnaan Hematoksilin & Eosin
- Xylol 1 dan 2 masing masing 2 menit, Alkohol 100% 2 menit (2x), Alkohol 95% 2 menit (2x)

1. masukkan ke dalam larutan hematoksilin selama 10-15 menit

2. cuci dengan air mengalir sampai tidak luntur
3. celupkan dalam HCL 0,4 % 2x celup untuk decolorisasi
4. cuci dengan air mengalir
5. Masukkan ke Lithium karbonat 5% selama 3X celup
6. Cuci dengan air mengalir
7. masukkan ke dalam larutan eosin 1% 2 menit
8. Masukkan ke dalam larutan Etanol 1 3x celup
9. Masukkan ke dalam larutan Etanol 2 3x celup
10. Masukkan ke dalam larutan Etanol 3 3x celup
11. Masukkan ke dalam larutan Xylol 1 5menit
12. Masukkan ke dalam larutan Xylol 2 5menit
13. Masukkan ke dalam larutan Xylol 3 5menit
14. Di mounting dan diberi label
Interpretasi hasil :
 Inti sel bewarna biru
 Sitoplasma bewarna
kemerahan dengan
adanya beberapa variasi
warna pada komponen
tertentu
 2. Alcian Blue
• Alcian blue digunakan pada sampel dengan pH 2,5 dan mampu mendeteksi
mukopolisakarida asam dan biasanya memberikan warna biru.
• Pewarna tunggal alcian blue  sel mast warna biru langit hingga hijau,
• pewarna alcian blue-safranin  variasi warna yaitu biru, merah dan campuran
kedua warna tersebut.
• Sel mast akan teramati cukup jelas pada pewarnaan toluidine blue dibandingkan
dengan pewarnaan alcian blue.
• Namun, pada pewarnaan alcian blue terutama alcian blue-safranin, jumlah sel
mast jaringan ikat yang teramati lebih banyak dibandingkan pewarnaan toluidine
blue.
 Tahapan Pewarnaan Alcian Blue (AB)
1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan xylol dan alcohol bertingkat
masing-masing selama 3-5 menit, kemudian dilanjutkan dengan pencucian
dalam air mengalir selama 10 menit
2. Penuruan pH dengan 3% asam asetat selama 5 menit dalam suhu ruang
3. Perendaman dalam AB pH 2,5 selama 30 menit
4. Pencucian dengan 3% asam asetat selama 5 menit sebanyak 3 kali dalam
suhu ruang
5. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 3 kali
6. Counterstain (nuclear fast red) cek dengan mikroskop
7. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 3 kali
8. Pencucian dengan air mengalir selama 10-60 menit
9. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 2 kali
10. Dehidrasi dan penjernihan dalam larutan xylol dan penutupan sediaan dengan
cover glass
A

Pengamatan histopatologi
terhadap sel mast jaringan ikat pada
kulit kaki tikus dengan pewarnaan
alcian blue (a) dan alcian blue dilanjutkan
safranin (b). Perbesaran
yang digunakan adalah 400x.
Pengamatan histopatologi
terhadap sel mast jaringan ikat pada
kulit kaki tikus dengan pewarnaan
toluidine blue.
Perbesaran yang
digunakan adalah 400x.
 3. Periodic Acid Schiff (PAS)

Metode pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) untuk menunjukkan sebaran

karbohidrat netral. Reaksi positif terhadap pewarnaan Periodic Acid Schiff
(PAS) ditunjukkan dengan adanya warna magenta pada jaringan.

Prinsip: Pewarnaan PAS untuk mendeteksi glikogen dan mukopolisakarida

intraseluler. Reaksi yang terjadi adalah oksidasi glikogen oleh periodic acid
menjadi dialdehida, kemudian dialdehida bereaksi dengan reagen Schiff
membentuk warna merah.
 Tahapan Pewarnaan PAS
1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan xylol dan alcohol bert-
ingkat masing-masing selama 3-5 menit, kemudian dilanjutkan dengan pen-
cucian dalam air mengalir selama 10 menit
2. Dioksidasi dalam asam periodat 1% selama 5-10 menit
3. Pencucian dengan aquades 3 kali masing2 selama 5 menit
4. Pewarnaan dengan larutan Reagent Schiff selama 15-30 menit
5. Pencucian dengan air sulfit yang selalu fresh (dibuat baru) 3x3 menit
6. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 3 kali
7. Counterstain dengan hematoksilin, cek dengan mikroskop
8. Pencucian dengan air mengalir 10-60 menit
9. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 2 kali
10. Dehidrasi dan penjernihan dalam larutan xylol dan penutupan sediaan den-
gan cover glass
 4. Pewarnaan Lektin
Pewarnaan Lektin digunakan untuk mendeteksi adanya kandungan residu
gula dan zat kompleks lain dalam suatu jaringan.
 Tahapan Pewarnaan Lektin
1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan xylol dan alcohol bertingkat
masing-masing selama 3-5 menit, kemudian dilanjutkan dengan pencucian dalam
air mengalir selama 10 menit
2. Sediaan dimasukkan dalam hydrogen peroksida (H2O2) 1% dalam PBS selama 15
menit
3. Pencucian dengan air mengalir selama 10 menit, dilanjutkan dengan larutan PBS
0,01 M selama 5 menit
4. Inkubasi dengan lektin selama 2 jam dalam incubator suhu 37’C
5. Pencucian dengan PBS sebanyak 3 kali, masing2 selama 5 menit
6. Visualisasi dengan 0,05% DAB (diaminobenzidine) dan 0,1% H2O2 pada buffer tris
0,05 M, pH 7,6 selama 10-20 menit di tempat gelap
7. Pencucian dengan PBS selama 5 menit sebanyak 3 kali
8. Pewarnaan kontras dengan hematoksilin, beberapa detik
9. Pencucian dengan air mengalir selama 30 menit
10. Dehidrasi dengan alcohol bertingkat, penjernihan dengan xylol dan penutupan
dengan cover glass
 Teknik Pewarnaan Sitologi
Pewarnaan pada sediaan apus/smear untuk pemeriksaan sitologi
bertujuan untuk identifikasi morfologi sel, inti sel maupun sitoplasma
sel, sehingga bisa memberikan gambaran menyeluruh kondisi
morfologi sel yang diperiksa.
 1. Pewarnaan Papanicolaou
 Pengecatan papanicolaou merupakan metode pengecatan polikromatis yang
merupakan kombinasi pengecatan hematoxilin untuk mewarnai inti sel dan
sitoplasma pada bagian pewarna lainnya.

 Prinsip pengecatan papaniculaou adalah melakukan pewarnaan, hidrasi dan dehidrasi

sel. Pengambilan sediaan yang baik, fiksasi dan pewarnaan sediaan yang baik serta
pengamatan mikroskopik yang cermat, merupakan langkah yang harus ditempuh dalam
menegakkan diagnosa

 Permasalahan yang sering terjadi pada pengecatan papanicolauo adalah

nuklear terlalu pucat. Sehingga sampel akan sulit terlihat dalam mikroskop.
Hal ini terjadi karena terkontaminasi hematoxilin yang mengurangi kemampuannya men-
embus nukleus dan cat mengering sebelum difiksasi.
Terdapat lima langkah utama dalam metode pewarnaan Papanicolaou, yaitu :
a. Fiksasi
b. Pewarnaan Inti
c. Pewarnaan sitoplasma
d. Penjernihan ( Clearing )
e. Mounting
 Prosedur pewarnaan Papanicolaou:
1. Sediaan apusan difiksasi dengan Alkohol 95 % 10 celup
alkohol 95 % 15 menit (minimal) Alkohol 95 % 10 celup
2. Alkohol 80 % 10 celup 17. EA 50 3-5 menit
3. Alkohol 70 % 10 celup 18. Alkohol 95 % 10 celup
4. Alkohol 50 % 10 celup Alkohol 95 % 10 celup
5. Aquadest 10 celup Alkohol 95 % 10 celup
6. Harris Haematoxylin 3-5 menit 19. Keringkan di udara
7. Cuci dengan air mengalir 20. Xylol 3 menit
8. HCL 0,25 % 3-4 celup 21. Tutup dengan Entelan
9. Cuci dengan air mengair
10. Lithium 0,5 % 10 celup
11. Cuci dengan air mengalir
12. Alkohol 50 % 10 celup
13. Alkohol 70 % 10 celup
14. Alkohol 80 % 10 celup
15. Alkohol 95 % 10 celup
16. OG 6 3-5 menit
17. Alkohol 95 % 10 celup
Gambaran hasil mikroskopis pengecatan
papanicolaou terhadap preparat sito blok (A)
tidak baik, (B) kurang baik dan (C) baik ter-
hadap preparat apusan sitologi pada cairan
pleura dengan pembesaran 400x.
 2. Pewarnaan Giemsa
 Pewarnaan Giemsa adalah pulasan yang terdiri dari eosin, metilin azur dan
metilen blue yang berguna untuk mewarnai sel darah melalui fiksasi dengan metil
alcohol.

 Prinsip dari pewarnaan Giemsa adalah adanya presipitasi hitam yang

terbentuk dari penambahan larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan di
dalam metanol.

Langkah-langkah dalam pewarnaan Giemsa :

a. Fiksasi
b. Pewarnaan dengan larutan Giemsa
c. Mounting
 Prosedur pewarnaan Giemsa

1. Sediaan apus setelah benar-benar kering fiksasi dengan metanol selama 5 menit,
angkat dan biarkan kering di udara.
2. Masukkan ke dalam larutan Giemsa yang telah diencerkan selama 30 menit,
angkat, cuci dengan air mengalir, keringkan di udara.
3. Masukkan ke dalam Xylol selama 3 menit.
4. Tambahkan 1-2 tetes entelan
5. Tutup dengan cover gelas
6. Bersihkan sisa entelan yang melekat pada kaca objek sehingga siap di beri label.
 3. Pewarnaan diff quick
 Pewarnaan diff quick merupakan Teknik pewarnaan cepat, yang biasa
digunakan dengan menggunakan alcohol dan giemsa.

 Fiksasi yang digunakan adalah fiksasi kering (sediaan dikeringkan di udara

terbuka dan tidak dimasukkan ke dalam cairan fiksasi).

 Prinsip pewarnaan diff quick adalah salah satu Teknik pencelupan rapid untuk
smear sitologi yang dikeringkan di udara, Teknik pencelupan ini digunakan untuk
melihat sel-sel tumor dan untuk mendiagnosis sampel sel-sel tumor dan untuk
mendiagnosis sampel sel.
 Cat utama yang digunakan dalam
pengecatan diff-quick

 Diff-quick I : Cat Solution I

(Pewarna Xanthene, buffer pH, Sodium azide)
 Diff-quick II : Cat Sloution II
(Pewarna tiazine, buffer pH)
 Diff-quick Fix : Fiksatif Solution
(Pewarna triarylmethane, methanol)
 Prosedur Pewarnaan Diff-Quick

1. Celupkan sediaan ke dalam larutan fiksatif selama 5 detik 5 kali celup

masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
2. Celupkan sediaan kedalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing-masing
satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
3. Celupkan sediaan kedalam larutan II selama 5 detik 5 kali celup masing masing
satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
4. Cuci sediaan dengan air destilasi atau air diionisasi.
5. Keringkan dan siap untuk dibaca. 
Contoh pewarnaan diff-quick
 Thank you
Insert the title of your subtitle Here