Histoteknikdasar 2009

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI
All images in this document is removed due to copyright restriction

HISTOTEKNIK DASAR
Ahmad Aulia Jusu
!agian Histologi
"a#ultas Kedo#teran $niversitas Indonesia
%&&'
(ENDAH$)$AN
Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen
tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau
dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk
1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk dan struktur
jaringan tubuh tertentu yang normal.
2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan percobaan yang
mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan perkembangan jaringan
atau organ tubuh tertentu.
. !embantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien
"ntuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus dapat memberikan
gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel# inti sel dan sitoplasma# badan inklusi
$glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya%# susunan serat jaringan ikat# otot dan lain sebagainya
sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup.
Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur histologi jaringan tubuh
sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup.
Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar&benar shahih $'alid/akurat% yang
sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan yang timbul. (i samping itu
sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita
oleh pasien.
S$*!ER JARIN+AN ATA$ OR+AN
,- *anusia
)aringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur histologi
yang harus dipelajari oleh mahasiswa adalah struktur histologi manusia. )aringan tubuh
ini dapat di ambil dari cada'er $jena*ah% dengan syarat jaringan atau organ tersebut di
Histoteknik Dasar/Magister Biomedik/ Oktober 2!
1
ambil kurang dari jam setelah kematian, sebab bila lebih lama sudah terjadi
pembusukan atau autolisis. Sayangnya syarat tersebut pada masa kini hampir mustahil
dapat dipenuhi. +ara lain adalah mengambil jaringan atau organ tersebut dari kamar
operasi.
%- He.an
)aringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternati,. Beberapa hewan yang
sering dipakai adalah
a. -era, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama&sama tergolong
mahluk primata
b. -ambing, terutama untuk melihat serat .urkinje di jantung
c. Babi untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri Hulsen pada limpa.
d. -ucing dan anjing
e. /ikus putih $mice% dan rat
,. -elinci
)aringan dapat diambil dari hewan yang di,iksasi dalam keadaan hidup $,iksasi supra/
intra'ital% atau hewan yang telah mati $,iksasi emersi/rendam%.
Histoteknik ini dapat dilakukan oleh sta, pengajar, peneliti atau teknisi laboratorium.
Setiap sta, pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik pembuatan sajian histologi dengan
baik, karena setiap sta, pengajar bagian biomedik dituntut untuk dapat melakukan riset yang
sering kali melibatkan teknik pembuatan sediaan histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat
sajian histologi sendiri, karena dengan melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui
kesulitan&kesulitan yang terjadi sekaligus cara untuk mengatasinya. (isamping peneliti juga dapat
mengamati hal&hal yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian.
.embuatan sajian histologi yang bersi,at massal dan banyak biasanya dilakukan oleh
teknisi laboratorium tetapi harus dikontrol oleh sta, pengajar sehingga kualitas sajian histologi
yang dihasilkan akan dapat senantiasa dikontrol.
Setelah jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari
sumbernya, jaringan tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian histologi.
Rangkaian proses pembuatan sajian histologi $0b&1% terdiri atas
1. 1iksasi $1i2ation%
2. (ehidrasi $(ehydration%
. .embeningan $+learing%
3. .embenaman $4mpregnasi/5mbedding%
6. .engecoran $Blocking%
2
7. .emotongan jaringan $Sectioning%
8. .ewarnaan $Staining%
9. .erekatan $!ounting%
:. .elabelan $;abelling%
"raian selanjutnya akan membahas tahapan pembuatan sajian histologi ini secara lebih rinci.
0ambar&1 Rangkaian .roses dalam Histoteknik
ISO)ASI /(EN+A*!I)AN 0 JARIN+AN T$!$H
A- (ersiapan
Sebelum jaringan tubuh diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan yang terdiri atas
1. .ersiapan alat dan bahan/cairan
.erangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi atau
pengambilan jaringan tubuh terdiri atas peralatan bedah minor $gunting, pinset,
scalpel, klem, pemegang jaringan, kassa, dll%, meja operasi, lampu, peralatan
anestesi $disposible syringe, sungkup/masker anestesi% dan obat anestesi $eter,
ketalar, phenobarbital dll% serta perangkat pengawetan jaringan $,iksasi jaringan%
seperti wadah untuk ,iksasi emersi, cairan ,iksasi $1ormol salin, !uller, Bouin,
<enker dll%, peristaltik pump/syringe pump untuk ,iksasi supra'ital dan lain&lain
2. .ersiapan sampel
"ntuk jaringan yang diambil dari kada'er atau manusia, jaringan segera diambil
dan dimasukkan kedalam caian ,iksasi. "ntuk sampel yang diambil dari hewan,
maka hewan perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Hewan yang dipilih haruslah
sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai status gi*i yang baik dan
dipelihara sesuai dengan syarat&syarat pemeliharaan hewan coba. Hewan yang
digunakan dipilih sesuai dengan tujuan penelitian dan pengajaran. -era
merupakan hewan yang mempunyai struktur tubuh yang mirip dengan manusia.
"ntuk mempelajari serat purkinje pada jantung dengan lebih jelas dapat
digunakan jantung kambing, untuk mempelajari lobulus hati klasik degan lebih

baik digunakan hati babi, untuk mempelajari arteri Hulsen pada limpa lebih baik
digunakan limpa yang berasal dari babi dan sebagainya.
B. .elaksanaan
"ntuk jaringan yang berasal dari kada'er dan dari jaringan operasi, jaringan yang
telah diambil langsung dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan ,iksasi. Sedangkan
untuk jaringan yang berasal dari hewan tahapan pengambilan jaringan adalah sebagai
berikut
1. .embiusan
"ntuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat dilakukan
dengan 2 cara yaitu
a. .embiusan inhalasi dengan menggunakan eter dan sungkup muka
b. .embiusan dengan menyuntikkan *at anestesi seperti chloralhydrate,
ketalar, phenobarbital, dan sebagainya.
c. +ampuran yaitu pembiusan inhalasi yang diikuti dengan pembiusan lewat
suntikan
2. .embedahan dan isolasi jaringan tubuh
Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah melakukan operasi
dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan. )aringan tubuh lalu dipotong&
potong didalam cairan ,isiologis $=a+l >.:?% untuk mendapatkan ukuran yang
lebih kecil. Hal ini perlu dilakukan agar cairan ,iksasi dapat masuk kedalam
jaringan dengan mudah dan baik. .otongan jaringan kemudian dimasukkan
kedalam wadah&wadah kecil yang telah diberikan label/keterangan. @adah berisi
cairan ,iksasi dan jaringan kemudian disimpan ditempat yang sesuai hingga saat
pemerosesan jaringan selanjutnya.
. 1iksasi supra'ital/intra 'ital
-husus untuk jaringan tubuh yang di,iksasi secara supra'ital atau intra'ital,
segera setelah hewan terbius sempurna, hewan dibaringkan di atas meja operasi
dan diikat agar posisinya stabil. Setelah itu dinding perut dibuka dengan sayatan
pada garis tengah dilanjutkan ke samping kiri dan kanan pada sisi atas dan bawah.
(ia,ragma lalu dibuka. /ulang iga dipotong pada costosterno junction. /ulang
3
sternum lalu ditarik ke atas dan di,iksasi. Setelah tulang sternum diangkat ke atas
akan terlihat jantung. Aurikula atrium kanan dan 'entrikel kiri lalu diidenti,ikasi.
.erikardium lalu dibuka. (inding aurikula atrium kanan digunting dan darah
dibiarkan mengalir. Setelah darah mengalir keluar, jarum yang disambung ke
slang in,us ditusukkan kedalam 'entrikel kiri. .eristaltik pump lalu dinyalakan
dan cairan in,us akan mengalir masuk kedalam 'entrikel kiri menggantikan darah
yang hilang lewat atrium kanan. +airan in,us yang pertama mengalir adalah
cairan =a+l >.:? untuk membilas darah dari jaringan tubuh sehingga jaringan
tubuh yang akan diambil bebas dari kontaminasi darah. Selanjutnya akan
mengalir cairan ,iksasi yang akan mem,iksasi seluruh jaringan tubuh. +airan
,iksasi dibiarkan mengalir hingga seluruh jaringan ter,iksasi sempurna yang
ditandai oleh adanya leher dan ekor yang kaku. Selama cairan ,iksasi mengalir
akan terlihat kedutan pada seluruh otot. Setelah seluruh jaringan ter,iksasi
sempurna, sisa bekuan darah dibersihkan dari tubuh hewan dengan mencuci
dengan air kran. )aringan tubuh yang diinginkan kemudian diisolasi, dipotong&
potong dan dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan ,iksasi yang sama
dengan cairan ,iksasi yang diin,uskan. @adah yang berisi cairan ,iksasi dan
jaringan kemudian dilabel dan disimpan hingga saat proses pengolahan jaringan
selanjutnya.
"IKSASI /"I1ATION0
(asar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan ,iksasi yang benar.
-esalahan yang dilakukan pada tahap ,iksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada
tahapan selanjutnya. )adi hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara
melakukan ,iksasi dengan baik.
Tu2uan dari i#sasi adalah untu#
1. !engawetkan jaringan.
1iksasi bertujuan untuk mempertahankan susunan jaringan agar mendekati kondisi
seperti sewaktu hidup.
2. !engeraskan jaringan
6
1iksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak agar memudahkan
pembuatan irisan tipis.
Ee# i#sasi terhadap 2aringan yang diproses adalah
,- *engham3at proses pem3usu#an dan autolisis
1iksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman&kuman
pembusuk yang berasal dari luar tubuh. @aktu pembusukan untuk setiap jaringan atau
organ berbeda&beda tergantung kepada konsistensi dan kandungan unsur&unsur penyusun
jaringan tersebut. )aringan usus dan otak sangat rentan terhadap proses pembusukan
dibandingkan jaringan tubuh lainnya. .embusukan seringkali disertai oleh pembentukan
gas yang berbau.
Autolisis adalah proses perusakan jaringan tubuh yang disebabkan oleh ensim&ensim
proteolitik yang terdapat pada jaringan tersebut. .roses proteolitik ini akan lebih cepat
terjadi pada suhu tropik $23&7+%. .roses proteolitik lebih mudah terjadi di )akarta
dibandingkan dengan negeri&negeri dingin.
"ntuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan
kedalam cairan ,iksasi segera setelah kematian atau segera setelah diambil dari tubuh.
Bila keadaan ini tidak memungkinkan jaringan dapat disimpan sementara di dalam
ruangan dengan temperatur yang sangat dingin $1ree*er%.
%- (enga.etan
Sel&sel dan jaringan diawetkan mendekati kondisinya seperti sewaktu hidup.
4- (engerasan
5,ek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak
5- (emadatan #oloid
1iksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair $Sol% menjadi lebih padat $0el%
6- Dierensiasi opti#
1iksasi akan mengubah indeks re,raksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga unsur&
unsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah dibandingkan dengan
jaringan yang belum di,iksasi.
7- (engaruh terhadap pe.arnaan
Sebagian besar cairan ,iksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat
bagian reakti, jaringan.
Hal8hal yang harus diperhati#an dalam pem3uatan 2aringan histologis adalahB
7
,- Tebal irisan jaringan 3-5mm sehingga cairan ,iksasi dapat dengan cepat medm,iksasi
seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal maka permukaan luarnya saja yang di,iksasi
dengan cukup baik, sedangkan bagian tengah jaringan sudah keburu membusuk sebelum
cairan ,iksasi sempat merembes ke sana.
%- Volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya harus 15-20x volume jaringan yang akan
difiksasi. Besarnya 'olume jaringan menentukan 'olume ,iksasi yang diperlukan
sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan ,iksasi. .anjang dan lebar jaringan
umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan digunakan.
4- enis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan yang akan
didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan. "ntuk keperluan
praktis cairan ,iksasi dapat dibedakan menjadi kelompok yaitu
A- *icro8anatomical i9ation
1iksasi ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan
dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. !airan
fiksasi yang "ergolong kelom#ok ini adalah cairan formalin a"au
modifikasinya$ cairan ace"ic alkohol formalin$ cairan %eidenhain &usa$ cairan
'enker$ cairan (ouin
!- :ytological i9atives
1iksasi ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak
dipertahankan dan di ekspresikan. "ntuk mencapai tujuan ini sering di capai
dengan mengurbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan
dengan mikrotom dan hilangnya struktur sel lainnya. 1iksasi ini dapat dibagi
menjadi 2 kelompok yaitu ,iksasi inti $nuklear% dan ,iksasi sitoplasma. !airan
fiksasi yang "ergolong dalam kelom#ok ini adalah fiksasi in"i )laru"an !arnov*
dan fiksasi si"o#lasma )laru"an +uller$ formol saline$ formol calcium$ 'enker
formol*.
:- Histochemical i9atives
1iksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan
histokimia +airan ,iksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau
sedapatnya mengubah seminim mungkin unsur&unsur yang akan
didemonstrasikan. 1iksasi histokimia yang baik harus memenuhi syarat&syarat
sebagai berikutB
1. !engawetkan unsur yang akan didemonstrasikan
8
2. !engikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus, tanpa
mempengaruhi gugus reakti, yang digunakan pada 'isualisasi.
. /idak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses 'isualisasi,
misalnya ,iksati, glutaraldehida mem,iksasi protein jaringan sedemikian
rupa dengan suatu coating terdiri atas gugus aldehida reakti, sehingga
menghasilkan reaksi .AS atau Schi,, positi,.
A- )AR$TAN "OR*A)IN
;arutan ,ormalin merupakan cairan ,iksasi yang paling umum digunakan. ,aur"an formalin
yang digunakan adalah formalin 10-. 1ormula yang digunakan adalah
1ormalin $3>? 1ormaldehida% ........................................................ 1> ml
Air .................................................................................................. :> ml
"ormaldehida 5&; adalah gas yang larut dalam air dengan volume 5&; dari total 3erat
larutan- )arutan 2enuh ini secara #omersial diperdagang#an se3agai "ormalin atau 5&;
"ormaldehida- Telah disepa#ati 3ah.a yang dima#sud dengan ormaldehida 5&; <
larutan 2enuh gas ormaldehida-
1ormalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari ,ormaldehida. Bentuk ini tak dapat
digunakan untuk ,iksasi. .ang da#a" digunakan adalah ben"uk monomernya. "ntuk
menghasilkan ,ormalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila #% laru"an ne"ral
a"au sediki" alkalis$ karena kece#a"an de#olarisasi "ergan"ung #ada #%- )adi jangan sekali&kali
menggunakan ,ormalin 1>? yang baru dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum
ter,iksasi dengan baik. Selain itu ,ormalin bersi,at asam karena mengandung asam ,ormiat akibat
oksidasi ,ormaldehida. Cleh sebab itu larutan ,ormalin 1>? harus dibuat netral atau sedikit
alkalis dengan menggunakan larutan bu,,er phosphate dengan pH 8.2 sebagai pelarut, atau
dengan menambahkan kalsium asetat. Dang paling mudah dan murah adalah /ormol &aline
dengan ,ormulanya
1ormalin $,ormaldehida 3>?% .............................................................. 1>>ml
Sodium klorida $=a+l% .............................................................. :gram
Air kran ............................................................ :>>ml
;arutan ,ormalin 1>? dengan phosphate bu,,er yang sering digunakan adalah
,- "ormol :alcium /)illie ,'760
1ormalin $3>? ,ormaldehida% ....................................................... 1> ml
-alsium asetat ................................................................................. 2 gr
Akuades ................................................................................... ad 1>> ml
9
%- "ormol :alcium /!a#er= ,'550
1ormalin ............................................................................................. 1> ml
+alcium chlorida .................................................................................. 2 gr
Akuades ....................................... ................................................ad 1>> ml
4- !uer ormalin
1ormalin ............................................................................................ 1> ml
Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... >.3> gr
Anhydrous disodium phosphate ........................................................ >.76 gr
Akuades ...........................................................................................ad 1>> ml
5- !uered ormalin su#rosa /Holt dan Hic#s= ,'7,0
1ormalin ............................................................................................. 1> ml
Sukrosa ................................................................................................ 8.6 gr
!/16 .hosphate bu,,er $pH 8.3% .......................................................ad 1>> ml
+airan ,iksati, ,ormalin akan mengawetkan struktur halus $,ine structure% dengan sangat baik,
phospholipid dan beberapa ensim. +airan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian
gabungan secara sitokimia dan mikroskop elektron. "ntuk mendapatkan hasil yang terbaik
jaringan harus di dinginkan sampai 3 derajat +elsius dalam re,rigerator.
Kele3ihan larutan i#sati ormalin adalah
a. merupakan cairan ,iksati, umum
b. pH mendekati netral
c. .igmen ,ormalin $acid ,ormaldehyde haematin% tidak terbentuk karena pembentukannya baru
terjadi bila ada interaksi antara larutan ,ormalin pada pH asam dengan hemoglobin atau
produknya $sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hepar, lien,
sumsum tulang dan sebagainya%. Bila pigmen ini terbentuk dapat dihilangkan dengan
perlakuan pikrat&alkohol atau larutan alkohol 1? dalam sodium hidroksida $=aCH%
d. .otongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan ,ormol salin untuk jangka waktu lama
$dapat sampai 1 tahun% tanpa ada perubahan yang berarti
e. Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan ,iksati, ini dapat di ambil dan
dimasukkan ke dalam cairan ,iksati, lainnya bila diperlukan
Ke#urangan larutan i#sati ormalin adalah
)aringan yang di,iksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 23 jam baru
dapat diproses.
:
!- )AR$TAN *$))ER
+airan ,iksasi ini merupakan ,iksati, sitologi yang dapat digunakan untuk mem,iksasi inti
dan sitoplasma sel. 0o"assium dikroma" yang "erda#a" di dalam laru"an +uller akan
memfiksasi #ro"ein "an#a mem#resi#i"asikannya. (iduga hal ini terjadi karena ion krom
membentuk kompleks&kompleks dengan air yang mengikat bagian reakti, rantai protein di
dekatnya. -alium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga
,iksati, yang mengandung ion krom tidak dapat di pakai untuk histokimia. -alium dikromat dapat
digunakan untuk reaksi kroma,,in.
Setelah ,iksasi dengan larutan !uller jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir
selama 23 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi, karena memindahkan jaringan secara
langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat
disingkirkan lagi dari jaringan.
Kele3ihan dari larutan *uller adalah
1. !empunyai daya penetrasi yang cepat dan baik. )aringan biasanya akan ter,iksasi
baik dalam waktu 23 jam.
2. !em,iksasi inti dan sitoplasma sel dengan baik
Ke#urangan dari larutan *uller adalah
1. )aringan yang di,iksasi dengan larutan !uller harus segera dilakukan proses
dehidrasi setelah 23 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama $E23 jam% dapat
menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong
dengan mikrotom secara baik.
2. /idak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metoda histokimia
. Harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan dilakukan proses
dehidrasi, karena dehidrasi langsung dengan menggunakan alkohol dapat
menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkan dari jaringan.
"ormula larutan *uller adalah se3agai 3eri#ut
.otassium dikromat .................................................................. 12.6 gram
Sodium sul,ate ............................................................................ 6 gram
Akuades ..................................................................................ad 6>> ml
1>
:- )AR$TAN !O$IN
;arutan ,iksati, ini mengandung larutan asam pi#rat 2enuh. Asam pikrat merupakan *at
berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit dan mudah meledak dalam keadaan kering,
sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara
melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh $terdapat endapan serbuk pikrat di dasar
larutan.
1sam #ikra" mem#resi#i"asikan #ro"ein dengan cara memben"uk ika"an #ikra"-#ro"ein.
Asam pikrat menyebabkan sel darah merah menjadi rusak, seringkali menghilangkan 1eF,
terutama bila berada dalam jumlah sedikit dan dapat melindungi R=A dari proses perusakan oleh
ensim ribonuklease.
Kele3ihan dari larutan !ouin adalah
1. !empunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan
terjadinya sedikit pengerutan. "ntuk mengatasi hal ini ke dalam larutan Bouin
biasanya di tambahkan asam asetat glasial sesaat sebelum dipakai. @aktu ,iksasi
cepat yaitu 23 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang dari 2& mm dapat
selesai di ,iksasi dalam 2& jam.
Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk ,iksasi meskipun rendah.
Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama&sama dengan larutan ,iksati, lain
dan ber,ungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya.
=ukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada *at wara
hematoksilin agar inti tampak jelas dan tajam.
2. !emberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome.
. Sangat baik untuk memperlihatkan inti sel seperti pada sel benih di testis dan o'um.
Ke#urangan dari larutan !ouin adalah
1. )aringan yang di,iksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi
setelah 23 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama $E23 jam% dapat menyebabkan
kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom
secara baik.
2. @arna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. "ntuk menghilangkan warna
kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran
semalam. Cleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan
harus segera dipindahkan ke dalam alkohol
11
"ormula larutan i#sati !ouin adalah
;arutan asam pikrat jenuh ......................................................................... 12.6 gram
1ormalin 1>? $3>? ,ormaldehida% ............................................................ 1>> ml
Bila akan digunakan baru tambahkan G asam asetat glasialH ..................... 6 ml
D- )AR$TAN >ENKER "OR*O) /:AIRAN HE))?0
;arutan ,iksati, <enker mengandung +erkuri klorida yang berfungsi un"uk
mem#resi#i"asi #ro"ein. +erkuri klorida akan mengika" gugus asam #ro"ein dan gugus asam
fosfa" nukleo#ro"ein$ dan juga bereaksi secara khusus dengan gugus "hiol )&%*.
Kele3ihan dari larutan i#sati >en#er adalah
1. (aya ,iksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah
meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi
ketebalan 6 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras $rapuh%, o'er,i2ed di
bagian peri,er dan lunak serta unde,i2ed di bagian tengah. "ntuk mengatasi hal
tersebut larutan ,iksati, ini biasanya dikombinasi dengan asam asetat, ,ormalin,
potassium dikromat dan sebagainya. @aktu ,iksasi umunya 7&23 jam
2. 1iksati, ini sangat baik untuk ,iksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang
banyak mengandung darah seperti jantung dan otot
. @arna sitoplasma jaringan yang di,iksasi dengan larutan ,iksati, ini akan lebih
cemerlang.
Ke#urangan dari larutan i#sati >en#er adalah
1. .emaparan jaringan di dalam larutan ,iksati, ini yang melebihi waktu yang
ditentukan akan mengakibatkan jaringan menjadi rapuh $keras%, o'er,i2ed dibagian
peri,er dan under,i2ed ditengahnya. )aringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan
mikrotom. -arenanya larutan ini jarang digunakan tersendiri, umumnya
dikombinasikan dengan asam asetat, ,ormalin, potassium bikromat dan sebagainya.
"ormula larutan >en#er se3agai 3eri#ut
!erkuri klorida .......................................................................................... 6 gram
.otassium dikromat .................................................................................... 2.6 gram
Sodium sul,at ............................................................................................. 1 gram
Akuadest .................................................................................................. ad 1>> ml
12
/ambahkan ,ormalin segera sebelum pemakaian ...................................... 6 ml
E- )AR$TAN ETH?) A)KOHO)
1iksasi ini biasanya digunakan untuk sajian hapus dan tidak digunakan untuk ,iksasi
jaringan, sebab larutan ,iksati, ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan
cenderung untuk mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan
,iksasi ini. ;arutan ini mem,iksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan
mempresipitasi glikogen. Apabila ,iksati, ini dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan
+arnoy, ,iksasi berlangsung cepat.

D- )AR$TAN ASA* ASETAT8A)KOHO)8"OR*A)IN /TE))?ESNI:>K?0
1iksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. ;arutan ini akan mencegah
karbohidrat menjadi larut sebelum unsur protein selesai di,iksasi. -arena ,ormalin dan alkohol
merupakan *at dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan ,iksati, yang kerjanya cepat.
)aringan dengan ketebalan 6 mm selesai di,iksasi dalam 3 jam.
Asam asetat , umumnya disebut asam asetat glasial karena padat pada suhu di bawah 18
derajat +elsius. Asam asetat tidak pernah digunakan sendirian karena e,ek pembengkakan pada
serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh reagen
lainnya. =ukleoprotein $dalam inti sel% dipresipitasikan oleh acetic acid dan karenanya sering
ditambahkan pada *at warna hematoksilin agar inti tampak lebih jelas dan tajam, mitokondria dan
aparatus 0olgi dihancurkannya atau menjadi rusak
"ormula larutan i#sati ini adalah
1ormalin .................................................................................................... 6 ml
Asam asetat glasial .................................................................................... 6 ml
Alkohol 8>? .............................................................................................. :> ml
E- )AR$TAN HEIDENHEIN@S S$SA
;arutan ini merupakan larutan ,iksati, karbohidrat yang sangat baik. ;arutan ,iksati, ini
mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata serta memberikan hasil pulasan yang sangat
cemerlang dengan rincian sitologi yang sangat baik. )aringan dengan ketebalan kurang dari 9mm
selesai di,iksasi setelah 12&23 jam. Bila jaringan di,iksasi lebih dari 23 jam, jaringan akan
menjadi keras dan rapuh
"ormula larutan i#sati ini adalah
1
!erkuri klorida ........................................................................................... 3.6 gr
Sodium klorida ............................................................................................. >.6 gr
/richloracetic acid ........................................................................................ 2 gr
Acetic acid ................................................................................................... 3 ml
1ormalin ....................................................................................................... 2> ml
Akuadest ...................................................................................................... 1>> ml
"- )AR$TAN :ARNO?
;arutan ini merupakan larutan ,iksati, inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat.
(i samping itu larutan ,iksati, ini juga akan mengawetkan substansia =issl dan glikogen.
-euntungan dari larutan +arnoy adalah sangat cepat . 1iksasi ini sering digunakan
apabila suatu diagnostik perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya pada bagian bedah untuk
diagnostik sel kanker. 1iksasi umumnya selesai setelah 1&2jam,sedangkan potongan kecil selesai
di,iksasi dalam 16 menit.
-ekurangan ,iksasi ini adalah e,ek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian
besar unsur sitoplasma lainnya. 5,ek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan ,iksasi pada
suhu nol derajat +elsius selama 19 jam
"ormula larutan i#sati :arnoy adalah
Alcohol absolut ......................................................................................... 7> ml
+hloro,orm ................................................................................................ > ml
0lacial acetic acid ..................................................................................... 1> ml
TEHNIK )ENDR$*
/ehnik ;endrum digunakan untuk melunakkan jaringan kulit setelah di,iksasi. Hal ini
terjadi karena kulit merupakan jaringan yang keras. Setelah potongan kulit dikeluarkan dari
larutan ,iksati,, kulit dicuci sebentar dengan air kran mengalir atau dengan alkohol :>?,
kemudian direndam dalam larutan phenol 3? dalam akwades selama 1& hari. (engan perlakuan
khusus ini diharapkan kulit menjadi mudah diiris dengan pisau mikrotom tajam tanpa merobek .
Sebelum memotong pisau mikrotom sebaiknya direndam dalam es sehingga memudahkan
pemotongan. Setelah dibuat blok, blok preparat sebaiknya disimpan dalam air es.
DEHIDRASI
13
(ehidrasi merupakan langkah ke dua dalam pemerosesan jaringan. .roses ini $0b&2%
bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang telah di,iksasi
sehingga jaringan nantinya dapat diisi dengan para,in atau *at lainnya yang dipakai untuk
membuat blok preparat. Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur dengan cairan
para,in atau *at lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.
0ambar&2 .roses (ehidrasi
Ada beberapa macam cairan yang dapat dipakai untuk proses dehidrasi yaitu
1. Alkohol
2. sukrosa 2>?
. metil alkohol atau spiritus
Setelah jaringan selesai di,iksasi jaringan dipindahkan ke dalam alkohol dan diproses
sebagai berikut
1. alkohol 8>? ................................................................................................... 1 hari
2. alkohol 8>? .................................................................................................... 1 hari
. alkohol 8>? .................................................................................................... 1 hari
3. alkohol :6? ................................................................................................... 1 hari
6. alkohol :6? ................................................................................................... 1 hari
7. alkohol :6? ................................................................................................... 1 hari
8. alkohol 1>>? ................................................................................................. 1 hari
9. alkohol 1>>? ................................................................................................. 1 hari
:. alkohol 1>>? .................................................................................................. 1 hari
(i samping cara di atas cara lain yang juga sering di pakai adalah dehidrasi bertahap dengan
menggunakan alkohol dengan konsentrasi yang makin meningkat secara lebih perlahan yaitu
1. alkohol 8>? ................................................................................................... 1 hari
2. alkohol 9>? .................................................................................................... 1 hari
. alkohol :>? ...................................................................................................... 1 hari
3. alkohol :6? ...................................................................................................... 1 hari
6. alkohol :6? ....................................................................................................... 1 hari
7. alkohol 1>>? ...................................................................................................... 1 hari
8. alkohol 1>>? ..................................................................................................... 1 hari
16
Alkohol yang sudah dipakai dapat dimurnikan denga cara memasukkan cuprisul,at $+uSC3%
kedalamnya. +uprisul,at yang bewarna putih $tak mengandung air% akan berubah menjadi biru
$mengandung air%. 0anti cuprisul,at beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah
disimpan beberapa hari. +uprisul,at yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di
hilangkan airnya dengan cara memanaskan.
!etil alkohol dapat digunakan menggantikan alkohol absolut. !etil alkohol ini terlebih
dahulu diberi cuprisul,at hingga warnanya tetap putih, setelah itu siap untuk digunakan. Bila
menggunakan spiritus harus ditest dulu dengan alkohol absolut murni sebagai kontrol.
"ntuk jaringan yang akan dipotong menggunakan cryostat dan blok preparat dibuat
menggunakan tissue tech jaringan di dehidrasi menggunakan sukrosa 2>? selama 2 hari. +airan
pekat sukrosa 2>? ini dibuat dengan cara sebagai beikut
Sukrosa $gula pasir% ...................................................... 2> gram
Air suling .....................................................................ad 1>> ml
(E*!ENIN+AN /:)EARIN+0

.embeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan
menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan para,in. )aringan tidak dapat
langsung dimasukkan ke dalam para,in karena alkohol dan para,in tidak bisa saling melarutkan.
.roses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam jaringan masih
tertinggal sedikit alkohol maka para,in tidak bisa masuk kedalam jaringan sehingga jaringan
menjadi G matang diluar, mentah di dalamH dan akan menyebabkan jaringan menjadi sulit untuk
dipotong dengan mikrotom.
Bahan atau reagen pembening yang paling sering dipakai adalah sebagai berikut
1. chloro,orm
2. ben*ene/ben*ol
. 2ylene/2ylol
3. cedar wood oil
6. ben*il ben*oat
7. methyl ben*oat
17
:hloroorm
+hloro,orm merupakan clearing agent yang paling sering dipakai, karena si,atnya
yang GtoleranH artinya jaringan tidak menjadi keras dan rapuh. Si,at ini tak dipunyai oleh
ben*ene dan 2ylene. )aringan biasanya dibeningkan dalam waktu semalam
-ekurangan chloro,orm adalah titik akhirnya yaitu saat jaringan telah menjadi bening
dan transparan yang tak dapat terlihat dengan jelas oleh mata. "ntuk mengatasi hal ini
jaringan sebaiknya direndam dalam chloro,orm untuk jangka waktu yang lebih panjang
dari yang sebenarnya, sehingga seluruh alkohol diyakini telah keluar dari jaringan dan
jaringan telah sempurna diresapi oleh chloro,orm. -ekurangan lainnya adalah chloro,orm
harganya ebih mahal dari 2ylene dan ben*ene tetapi lebih murah dari cedarwood oil
!enAeneB!enAol dan 1ylene
Ben*ene dan 2ylene merupakan clearing agent yang cukup cepat. !asa kerja
ben*ene lebih sedikit lambat dari 2ylene, tetapi tidak membuat jaringan menjadi serapuh
bila menggunakan 2ylene. .otongan kecil dapat dibuat menjadi bening dalam waktu I &
1 jam, sedangkan yang lebih tebal $6mm% telah menjadi bening dalam waktu 2&3 jam.
Ben*ene saat ini sudah jarang dipakai karena si,at karsinogeniknya.
Bila 2ylene atau 2ylol yang dipakai sebagai *at pembening, metodanya adalah
sebagai berikutB
1. Setelah jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi $alkohol% jaringan dimasukkan
kedalam 2ylol 4 selama 1 jam.
2. .erhatikan jaringan akan menjadi bening
. untuk menyakinkan bahwa seluruih cairan alkohol telah keluar, jaringan
kemudian dipindahkanke cairan 2ylol 44. ;ama inkubasi dalam 2ylol tergantung
pada besarnya jaringan, tetapi biasanya berkisar antara I & 1 jam.
3. )aringan kemudian direndam dalam para,in cair di dalam o'en selama kira&kira I
jam. Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok para,in.
!enAyl 3enAoat
Ben*yl ben*oat merupakan clearing agent yang lambat penetrasinya sehingga
dibutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama !etoda pembeningan adalah sebagai berikut
18
1. Ben*yl ben*oat 4
)aringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi dan direndam dalam ben*yl ben*oat
selama semalam $23 jam% sampai seluruh jaringan tenggelam. Ben*yl ben*oat
mempunyai penetrasi yang lambat sehingga tidak perlu kuatir jaringan menjadi
terlalu keras dan rapuh.. Setelah inkubasi selama semalam, jaringan akan tampak
menjadi bening dan transparan.
2. Ben*yl ben*oat 44
)aringan lalu dipindahkan ke dalam ben*yl ben*oat 44 selama kira&kira 2& jam.
. Ben*ol para,in
)aringan lalu dipindahkan ke dalam campuran ben*ol dan para,in cair dengan
perbandingan yang sama, misalnya ben*ol/ben*ene sebanyak 26 ml di campur
dengan para,in cair sebanyak 26 ml juga. )aringan direndam dalam ben*ol para,in
selama I&1 jam.
3. .ara,in cair
)aringan kemudian dimasukkan ke dalam para,in cair selam kira&kira I jam.
Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok para,in.
6. Bisa juga setelah dari ben*yl ben*oat 44 jaringan direndam dalam 2ylol/2ylene
selama I&1jam, baru kemudian dimasukkan kedalam para,in cair di o'en selama
I jam.
:edar.ood oil
+edarwood oil merupakan *at pembening termahal dari semua clearing agent tetapi
merupakan clearing agent terbaik, karena si,atnya yang tidak mengeraskan jaringan,
sehingga nantinya jaringan sangat mudah untuk diiris tipis dengan mikrotom. )aringan
dapat direndam dalam clearing agent ini untuk waktu yang lama bahkan hingga berbulan&
bulan tanpa menjadi keras dan rusak. .embeningan oleh cedarwood oil ini sangat baik
tidak hanya untuk jaringan yang halus tetapi juga untuk jaringan yang keras seperti kulit
dan jaringan ikat padat.
*ethyl 3enAoate
19
!ethyl ben*oat merupakan clearing agent yang mempunyai dayapenetrasi lebih
cepat dari ben*yl ben*oat. -ekurangan dari *at clearing ini adalah mudah menjadi
rapuh/keras sehingga menyulitkan pengirisan dengan mikrotom. .rosedur
pembeningannya adalah sebagai berikut
1. !ethyl ben*oat 4
Setelah dikeluarkan dari cairan dehidrasi jaringan dimasukkan kedalam larutan
methylben*oat sampai tenggelam, dengan waktu kira&kira 2& jam.
2. !ethylben*oat 44
)aringan kemudian dimasukkan ke dalam methyl ben*oat 44 selama 1&2 jam,
tergantung pada besar dan jumlah jaringan.
. Ben*ol&.ara,in
)aringan kemudian dipindahkan dan direndam dalam cairan ben*ol&para,in dan
direndam selama 1/2 hingga 1 jam. +airan ben*olJpara,in dibuat dengan
mencampurkan larutan ben*ol dengan para,in dengan perbandingan yang sama.
3. )aringan kemudian dipindahkan kedalam cairan para,in selama beberapa menit
(E*!ENA*AN /E*!EDDIN+BI*(RE+NASI0
.embenaman $impregnasi% adalah proses untuk mengeluarkan cairan pembening
$clearing agent% dari jaringan dan diganti dengan para,in. .ada tahap ini jaringan harus
benar&benar bebas dari cairan pembening karena sisa cairan pembening dapat mengkristal
dan sewaktu dipotong dengan mikrotom akan menyebabkan jaringan menjadi mudah
robek.
<at pembenam $impregnasi agent% yang dipakai adalah
1. .a,in caira panas yang mempunyai temperatur lebur $!elting temperature% kira&
kira 67&6: +
2. .ara,in histotek khusus $/issue mat% dengan suhu 67+
. .araplast yaitu campuran para,in murni dengan beberapa polimer plastik.
1:
0ambar& .embenaman $5mbedding/ 4mpregnasi%
-euntungan memakai para,in dengan titik lebur rendah adalah jaringan tidak mudah
menjadi rapuh/garing. .ara,in dengan titik lebur rendah biasanya dipakai untuk jaringan
embrional
-euntungan memakai paraplast adalah si,at para,innya lebih elastis sehingga tidak
mudah sobek ketika dipotong dengan mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah.
.roses pembenaman sebagai berikut
1. jaringan dbenamkan ke dalam para,in/paraplast 4 selama 2 jam
2. jaringan kemudian dipindahkan kedalam para,in/paraplast 44 selama 1 jam
. akhirnya jaringan dimasukkan kedalam para,in/paraplast 444 selama 2 jam.
3. setelah pembenaman proses dapat dilanjutkan dengan pengecoran/bloking
(EN+E:ORAN /!)O:KIN+0
.engecoran $Blocking% adalah proses pembuatan blok preparat agar dapat
dipotong dengan mikrotom.
"ntuk membuat blok preparat dapat digunakan 2 macam cara
1. +ara lama yaitu dengan menggunakan potongan besi berbentuk ; $;euckhart%
2 buah potongan besi disusun diatas lembaran logam hingga rapat dan
membentuk ruang seperti kubus. /uangkan sedikit para,in cair di bagian pinggir
tempat pertemuan potongan besi agar tak bocor. )aringan kemudian dimasukkan
ke dalam ruangan kubus. Selanjutnya para,in dituangkan kedalam ruangan kubus
tersebut. Hal yang harus dicegah adalah jangan sampai gelembung udara mengisi
kedalam blok para,in tersebut.
2. +ara baru yaitu dengan menggunakan cetakan dari plastik dan piringan logam
(engan cara ini histoplate dari plastik diletakkan di atas piringan logam $seperti
cetakan membuat es batu%. /uangkan sedikit cairan para,in ke dalam cetakan
tersebut. Secepatnya masukkan jaringan dengan menggunakan pinset yang telah
dipanaskan $agar para,in tak beku% dan diatur posisinya di dalam cetakan. .ara,in
cair kemudian dituangkan kembali hingga menutupi seluruh cetakan tersebut.
2>
Selama tindakan ini cetakan $histoplate dari plastik% dan piringan logam harus
diletakkan diatas hot plate.
(E*OTON+AN /*O$NTIN+999990
.emotongan $mounting% adalah proses pemotongan blok preparat dengan
menggunakan mikrotom.
Sebelum melakukan pemotongan serangakaian persiapan yang harus dilakukan
adalah
1. .ersiapan pisau mikrotom
.isau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong
dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. .isau
mikrotom kemudian diletakan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu.
Rekatkan blok para,in pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel.
;etakkan tempat duduk blok para,in beserta blok preparat pada tempatnya pada
mikrotom.
2. .ersiapan -aca Cbjek
-aca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated $disalut% dengan
*at perekat seperti albumin $putih telur%, gelatin atau tespa
. .ersiapan @aterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 8&3>
>
+
3. .ersiapan sengkelit atau kuas
/ehnik pemotongan para,in yang mengandung preparat adalah sebagai berikut
1. Rekatkan blok para,in yang mengandung preparat pada tempat duduknya di
mikrotom. /empat duduk blok para,in beserta blok para,innya kemudian
diletakkan pada pemegangnya $holder% pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.
21
2. ;etak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya
sudut kemiringan berkisar 2>&> derajat.
. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 6&8
mikrometer
3. gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok
preparat secara teratur dan ritmis. Buang pita&pita para,in yang awal tanpa
jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan
6. .ita para,in yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati&hati
menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur
8&3>+ dan biarkan beberapa saat hingga poita para,in tersebut mengembang.
7. Setelah pita para,in terkembang dengan baik, tempelkan pita para,in tersebut pada
kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam
waterbath dan menggerakkannya ke arah pita para,in. (engan menggunakan
sengkelit atau kuas pita para,in ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat
kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati&hati agar pita para,in
tidak melipat.
8. ;etakkan kaca objek yang berisi pita para,in di atas hotplate dengan temperatur
3>&36+, biarkan selama beberapa jam. +ara lainnya adalah dengan melewatkan
kaca objek di atas api sehingga pita para,in melekat erat di atas kaca objek.
9. Setelah air kering dan pita para,in telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek
berisi potongan para,in dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.
(ECARNAAN /STAININ+0
.ewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong
sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati dengan mikroskop.
.roses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang
22
terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang
gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau
lampu mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi
$diserap% atau diteruskan. <at warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar
dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan
adalah sebagai berikut
1. .eralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades
2. /imbang *at warna dengan cermat dan tepat
. ;arutkan *at warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan
pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol
dulu sebelum ditambahkan bahan lain.
3. Aduk *at warna dengan baik agar seluruh partikel *at warna terlarut dengan baik
6. /uangkan larutan *at warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan
dengan menyaringnya menggunakan kertas saring
7. Siapkan juga larutan&larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan
tuangkan dalam wadah yang sesuai
8. Atur urutan larutan&larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan
9. <at warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol
yang akan menyebabkan presipitasi $pengendapan% *at warna
.elarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat
keasaman yang netral $pH 8%. (isamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya
seperti etilalkohol $etanol% dengan derajat konsentrasi yang ber'ariasi. Bila tidak ada
keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsnetrasi
alkohol yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi ::.:?.
(ulasan Hemato#silin8Eosin
.ulasan $pewarna% yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat
digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu
pulasan hematoksilin&eosin $H5%. .ada pulasan H5 digunakan 2 macam *at warna yaitu
2
hematoksilin yang ber,ungsi untuk memulas nti sel dan memberikan warna biru
$baso,ilik% serta eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk
memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda
dengan nuansa yang berbeda.
Hematoksilin merupakan *at warna alami yang pertama kali dipakai tahun 197.
Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan
lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang
dipakai adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. .roses oksidasi senyawaan
hematoksilin ini dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan
menambahkan senyawaan yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida,
hidrogen peroksida, potassium permanganat dan sodium iodat.
Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel
akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. "ntuk
memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan
disimpan dalam ruangan gelap. (alam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan
diganti sekurangnya seminggu sekali. )enis hematoksilin yangsering dipakai adalah
mayer, dela,ied, 5rlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai
adalah eosin, sa,ranin, dan phlo2ine.
Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah
1. Hematoksilin 5rlich
Hematoksilin 5rlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah
berdi,,erensiasi dan warnanya relati, tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan
setelah 1&2 bulan dibuat. @aktu inkubasinya adalah > menit dan counterstainingnya
adalah >.6 &1? larutan eosin dalam air. 1ormulanya adalah sebagai berikut
o Hematoksilin KKKKKKKK.. 7 gram
o Alkohol absolut KKKKKKK. >>ml
o Akwades KKKKKKKKKK.. >>ml
o 0lycerol KKKKKKKKKKK. >> ml
o 0lacial acetic acid KKKKKK. > ml
o .otassium alum KKKKKKK. berlebihan
23
+ara pembuatannya adalah sebagai berikut
1. Hematoksilin dilarutkan dalam alkohol
2. Sambil digerus dalam mortar secara perlahan&lahan tambahkan bahan lainnya
secara berurutan sambil digerus
. Akhirnya tambahkan kristal potassium alum $Aluminium potassium sul,ate%
sambil menggoyang&goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar
botol.
3. Botol berisi larutan hematoksilin 5hrlich kemudian ditutup secara longgar dengan
gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1&2 bulan sehingga
hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. .roses ini dikenal sebagai
pematangan
2. Hematoksilin (ela,ield
;arutan *at warna ini tahan bertahun&tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan
hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan >.6&1? larutan eosin dalam
air, waktu inkubasi 16&2> menit. 1ormula larutan pewarna ini adalah
o Hematoksilin kristal KKKKKKK... 7 gr
o Alkohol absolut KKKKKKKKKK. 6> ml
o Ammonium alum KKKKKKKKK. 66 gr
o Akwades KKKKKKKKKKKKK.. 7>>ml
o 0lycerol KKKKKKKKKKKKKK 16>ml
+ara pembuiatan larutan hematoksilin (ela,ield adalah sebagai berikut
1. ;arutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut
2. ;arutkan ammonium alum dengan akwades hingga jenuh $saturated%
. +ampurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama &6 hari
3. Saring dan tambahkan glycerol
6. Biarkan selama hari dalam botol terpapar cahaya
7. Setelah hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya
26
. Hematoksilin !ayer
;arutan hematoksilin !ayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam
waktu lama $berbulan&bulan%, counterstaining dengan >.6&1? larutan eosin dan waktu
inkubasinya 1>&16 menit. 1ormulanya adalah
o Hematoksilin kristal KKKKKKKKK.. 1gr
o ALuades KKKKKKKKKKKKKKK.. 1>>>ml
o Sodium iodate KKKKKKKKKKKK.. >.2 gr
o Ammonium/potassium alum KKKKK. 6>gr
o +itric acid KKKKKKKKKKKKKKK 1gr
o +hloral hydrate KKKKKKKKKKKK 6>gr
1. ;arutkan ammonium/potassium alum di dalam aLuades
2. /ambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik
. -emudian tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate
3. +ampur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik
6. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya
3. Hematoksilin Harris
;arutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining
dengan >.6&1? larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 16&2> menit. 1ormulanya
adalah sebagai berikut
-ristal hematoksilin KKKKKKKKKKK 6.> gr
Alkohol 1>>? KKKKKKKKKKKKK.. 6> ml
Ammonium/potassium alum KKKKKK.. 1>> gr
(istilled water KKKKKKKKKKKKKK 1>>> ml
!erkuri oksida KKKKKKKKKKKKKK 2.6 gr
1. ;arutkan hematoksilin di dalam alkohol
2. ;arutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan
. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut
27
3. .anaskan dengan cepat sambil di aduk
6. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan&lahan
7. .anaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap
8. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah
berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin
9. ;arutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan
:. /ambahkan 2&3ml asam asetat glasial per 1>>ml ;arutan untuk meningkankan
ketajaman warna inti
1>. Saring sebelum digunakan
;arutan +ounterstaining
Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah
eosin, sa,ranin dan phlo2ine.
1. ;arutan 5osin
;arutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok $Stock solution% dan larutan
kerja $working solution%. Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut
1? Stock Alkohol&5osin
5osin D, water soluble KKKKKKKKK. 1.> gr
(istilled water KKKKKKKKKKKKK.. 2> ml
;arutkan dan tambahkan
Alkohol :6? KKKKKKKKKKKKKK.. 9> ml
@orking 5osin Solution
5osin stock solution KKKKKKKKKKK 1 bagian
Alkohol 9>? KKKKKKKKKKKKKK.. bagian
(ibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat
glasial >.6ml untuk setiap 1>> ml larutan dan aduk dengan baik
2. ;arutan .hlo2ine
;aurtan phlo2ine terdiri atas larutan stock eosin, stock phlo2ine, working solution
dan larutan Sa,ran. ;arutan&larutan tersebut adalah sebagai berikut
Stock 5osin
5osin D water soluble KKKKKKKKKKK 1 gram
28
(istilled water KKKKKKKKKKKKKKK 1>>ml
Stock .hlo2ine
.hlo2ine B KKKKKKKKKKKKKKKKK.. 1.6 gr
(istilled water KKKKKKKKKKKKKKK... 1>>ml
@orking Solution
Stock 5osin KKKKKKKKKKKKKKKKK.. 1>>ml
Stock .hlo2ine KKKKKKKKKKKKKKKK. 1>ml
Alkohol :6? KKKKKKKKKKKKKKKKK. 89>ml
Asam asetat glasial KKKKKKKKKKKKK.. 3ml
2? Alkohol Sa,ran
Sa,ran du 0atinais KKKKKKKKKKKKKK. 2 gram
Alkohol 1>>? KKKKKKKKKKKKKKKK.. 1>>ml
.ulasan rutin yang banyak dipakai adalah
I- (ulasan *ayer hemato#silin8eosin
.ulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan
1. (i,,erensiasi warna sangat jelas
2. !ewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan background yang tidak
bewarna
. Hasil konsisten
3. .rosedurnya sederhana
6. (apat mewarnai preparat yang di,iksasi dengan ,iksasi apapun juga
.rosedur yang dipakai adalah sebagai berikut
a. (epara,inisasi dengan 2ylol $222 min%
b. Hidrasi dengan serial Alkohol 1>>? $222 min% J :6? $2min% J :>? $2 min% J
9>? $2 min% & 8>? $2min% J (istilled water $min%
c. 4nkubasi dalam larutan hematoksilin !ayers selama 16 min
d. +uci dalam air mengalir selama 16&2>menit
e. Cbser'asi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air
mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke
langkah selanjutnya
29
,. +ounterstaining dalam larutan 5osin working solution selama 16 detik hingga
2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan
g. (ehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 8>?
hingga 1>>? masing&masing 2 menit.
h. )ernihkan dan dealkoholisasi dalam 2ylol 222min
i. /utup dengan balsem kanada
Hasil/ 4nterpretasi adalah
4nti sel bewarna biru
Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa 'ariasi warna pada
komponen tertentu
II- (e.arnaan Hemato#silin Harris8Eosin
.rotokol pulasan hematoksilin Harris Jeosin adalah sebagai berikut
a. (epara,inisasi dalam 2ylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 1>>?&:6?&
:>?&9>?&8>?
c. 4nkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 16 min
d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat
e. +elup dalam campuran asam&alkohol secara cepat &1> celup cek di,,erensiasi
warna di bawah mikroskop
,. Bilas dalam air mengalir secara singkat
g. +elup sebanyak &6 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga
potongan bewarna biru cerah
h. +uci dalam air mengalir selama 1>&2> menit Bila pencucian tidak maksimal
jaringan sulit terwarna oleh 5osin
i. 4nkubasi dalam eosin selama 16 detik hingga 2 menit
j. (ehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan,
masing&masing selama 2 menit
k. inkubasi dalam 2ylol 222menit
l. /utup dengan kaca penutup
2:
Hasil/4nterpretasi hasil pulasan
4nti sel bewarna biru
Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa 'ariasi warna
pada komponen tertentu
III- (e.arnaan Hemato#silin *ayer8(hlo9yne8Saran
.rosedur pewarnaan adalah sebagai berikut
a. (epara,inisasi dalam 2ylol
b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 1>>?&:6?&
:>?&9>?&8>?
c. 4nkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 6 menit
d. +uci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang
e. 4nkubasi dalam larutan hematoksilin !ayer selama 16 menit
,. Basuh dengan air mengalir selama 2> menit
g. @arnai dalam larutan 1.6? larutan .hylo2ine B selama 2 menit
h. Basuh dengan air selama 6 menit
i. +uci dengan alkohol absolut kali
j. @arnai dalam 2? larutan alkohol Sa,ran selama 6 menit
k. +uci dengan alkohol absolut 2 kali
l. 4nkubasi dalam 2ylol 2 kali masing&masing selama 2 menit
m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam -anada
Hasil/interpretasi
4nti bewarna biru
Sel darah merah bewarna 'ermillion pink
/ulang bewarna kuning
/ulang rawan bewarna hijau kekuningan
Ctot bewarna merah
Serat kolagen bewarna kuning
>
ID- (ulasan +iemsa
.ulasan 0iemsa digunakan untuk
1. .ewarnaan darah
2. .ewarnaan sumsum tulang
. .ewarnaan Riketsia
3. .ewarnaan bakteri Helicobacter pylori
.ulasan ini menggunakan ,iksasi bu,,er ,ormalin, metoda blok para,in dengan ketebalan
potongan 3&8 mikron. ;arutan yang dipakai adalah
Denner stock solution
Denner bubuk KKKKKKKKKK 1 gram
!ethyl alkohol KKKKKKKKK.. 3>>ml
Denner working solution
Denner stok KKKKKKKKKKK 26ml
Air suling KKKKKKKKKKKK. 26 ml
0iemsa solution $Stock Solution%
0iemsa bubuk KKKKKKKKKKK. 1 gram
0lyserin KKKKKKKKKKKKKK.. 77 ml
!ethyl alkohol KKKKKKKKKKK 77 ml
+ampurkan glyserin dengan bubuk 0iemsa, masukkan dalam o'en 7>
+ selama 2 jam
/ambahkan 77 ml methyl alkohol
0iemsa working solution
+ampurkan 0iemsa stok 6> tetes dengan air suling 6>ml
Setiap kali harus dengan larutan segar
;arutan Asam asetat glasial 1?
Asam asetat glasial $cuka% KKKKKKKK 1ml
Air suling KKKKKKKKKKKKKKKKK 1>>ml
1
.rosedur pulasan adalah sebagai berikut
a. (epara,inisasi dengan 2ylol kali selama 2& menit
b. Alkoholisasi dengan larutan alkohol yang konsentrasinya menurun
secara bertahap B Absolut K :6? KK :>? K.. 9>? KK 8>?
c. Hidrasi dengan air suling
d. 4nkubasi dalam methyl alkohol 2 kali masing&masing selama menit
e. 4nkubasi dalam Denner working solution selama 7 menit
,. 4nkubasi dalam 0iemsa working solution selama 36 menit
g. 4nkubasi dalam asetat glasial 1? sampai inti menjadi jelas
h. +uci dengan air suling
i. (ehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara
bertahap 8>?, 9>?, :>?, :6?, absolut
j. (ealkoholisasi dengan 2ylol 22 masing&masing selama 2& menit
k. /utup dengan kaca penutup yang diberi etelan
Hasil/4nterpretasi B Bakteri helicobacter dan Riketsia akan bewarna biru
D- (e.arnaan "ite "araco
1ite 1araco adalah metoda pulasan khusus untuk mendeteksi bakteri tahan asam $B/A%
seperti tuberkulosis dan lepra. 1iksasi yag digunakan adalah bu,,er ,ormalin 1>?, metoda
blok para,in dengan ukuran 3&8 mikron. ;arutan yang digunakan adalah
;arutan +arbol 1uchsin
.henol KKKKKKKKKKK.. 2.6ml
Alkohol absolut KKKKKKK 6 ml
Basic 1uchsin KKKKKKKK >.6 gram
Air suling adKKKKKKKKK 6> ml
;arutan !ethylen Blue
!ethylen blue KKKKKKKK >.6 gram
Asam asetat glasial KKKKK. >.6 ml
Air suling KKKKKKKKKK.. 1>> ml
;arutan alkohol asam 1?
Alkohol 8>? KKKKKKKKKKK ::ml
2
Asam chlorida $H+l% KKKKKKK 1 ml
.rosedur pulasan adalah sebagai berikut
(epara,inisasi dengan +ampuran minyak kacang dan 2ylol $1B2%
dilakukan 2 kali masing&masing selama 12 menit
Alirkan dan hapus sisa minyak
Basuh dibawah air mengalir selama 6 menit
@arnai dengan +arbol 1uchsin 2>&> menit
+uci dengan air mengalir
+uci dengan alkohol asam 1? selama 1 menit hingga jaringan bewarna
merah jambu
+uci dengan air mengalir
@arnai dengan !ethylen Blue hingga jaringan bewarna biru muda
Bilas dengan air kran
-eringkan dengan kertas penghisap dan biarkan hingga kering betul
4nkubasi dalam 2ylol 2 kali selama 1&2 menit
/utup dengan kaca penutup yang diberi -anada balsem/etelan
Hasil/ 4nterpretasi hasil
Bakteri tahan asam $B/A% akan memberikan warna merah

Histoteknikdasar 2009

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Histoteknikdasar 2009

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

All images in this document is removed due to copyright restriction

Ahmad Aulia Jusuf/Histologi FKUI

Anda mungkin juga menyukai