Materi kuliah untuk sitohistoteknologi praktikum

1. pengambilan jaringan tubuh

2. pembuatan preparat oles (Hapusan)
3. Pembuatan preparat metode rentang
4. Fiksasi (fixation)
5. dehidrasi
6. pembeningan (Clearing)
7. pembenaman (embedding / impregnasi)
8. pengecoran atau Blocking
9. pemotongan (mounting)
10. pewarnaan (staining)
11. Gambar preparat hasil pewarnaan HE

PENDAHULUAN
Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi
dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang
siap untuk diamati atau dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk
1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk dan
struktur jaringan tubuh tertentu yang normal.
2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan percobaan
yang mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan
perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu.
3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien.

Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus
dapat memberikan gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel
dan sitoplasma; badan inklusi (glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya); susunan
serat jaringan ikat; otot dan lain sebagainya sesuai dengan gambaran jaringan tubuh
tersebut dalam kondisi hidup. Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa
memahami struktur histologi jaringan tubuh sesuai dengan kondisi yang sebenarnya
pada waktu hidup. Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar
shahih (valid/akurat) yang sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab
permasalahan yang timbul. Di samping itu sajian yang baik juga diperlukan oleh
klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita oleh pasien.

SUMBER JARINGAN ATAU ORGAN

1. Manusia
Jaringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur
histologi yang harus dipelajari oleh mahasiswa adalah struktur histologi manusia.
Jaringan tubuh ini dapat di ambil dari cadaver (jenazah) dengan syarat jaringan
atau organ tersebut di ambil kurang dari 3 jam setelah kematian, sebab bila lebih
lama sudah terjadi pembusukan atau autolisis. Sayangnya syarat tersebut pada
masa kini hampir mustahil dapat dipenuhi. Cara lain adalah mengambil jaringan atau
organ tersebut dari kamar operasi
2. Hewan
Jaringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternatif. Beberapa hewan
yang sering dipakai adalah
a. Kera, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama-sama tergolong
mahluk primata
b. Kambing, terutama untuk melihat serat Purkinje di jantung
c. Babi untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri Hulsen pada limpa.
d. Kucing dan anjing
e. Tikus putih (mice) dan rat
f. Kelinci
Jaringan dapat diambil dari hewan yang difiksasi dalam keadaan hidup
(fiksasi supra/ intravital) atau hewan yang telah mati (fiksasi
emersi/rendam).Histoteknik ini dapat dilakukan oleh staf pengajar, peneliti atau
teknisi laboratorium. Setiap staf pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik
pembuatan sajian histologi dengan baik, karena setiap staf pengajar bagian
biomedik dituntut untuk dapat melakukan riset yang sering kali melibatkan teknik
pembuatan sediaan histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat sajian histologi
sendiri, karena dengan melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui
kesulitan-kesulitan yang terjadi sekaligus cara untuk mengatasinya. Disamping
peneliti juga
dapat mengamati hal-hal yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian
 MATERI I
(PENGAMBILAN ) JARINGAN TUBUH

A. Persiapan
Sebelum jaringan tubuh diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan yang terdiri atas

1. Persiapan alat dan bahan/cairan

Perangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi atau
pengambilan jaringan tubuh terdiri atas peralatan bedah minor (gunting, pinset,
scalpel, klem, pemegang jaringan, kassa, dll), meja operasi, lampu, peralatan
anestesi (disposible syringe, sungkup/masker anestesi) dan obat anestesi (eter,
ketalar, phenobarbital dll) serta perangkat pengawetan jaringan (fiksasi
jaringan) seperti wadah untuk fiksasi emersi, cairan fiksasi (Formol salin,
Muller, Bouin, Zenker dll), peristaltik pump/syringe pump untuk fiksasi
supravital dan lain-lain

2. Persiapan sampel
Untuk jaringan yang diambil dari kadaver atau manusia, jaringan segera
diambil dan dimasukkan kedalam caian fiksasi. Untuk sampel yang diambil dari
hewan, maka hewan perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Hewan yang dipilih
haruslah sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai status gizi yang baik
dan dipelihara sesuai dengan syarat-syarat pemeliharaan hewan coba. Hewan
yang digunakan dipilih sesuai dengan tujuan penelitian dan pengajaran. Kera
merupakan hewan yang mempunyai struktur tubuh yang mirip dengan manusia.
Untuk mempelajari serat purkinje pada jantung dengan lebih jelas dapat
digunakan jantung kambing, untuk mempelajari lobulus hati klasik degan lebih
baik digunakan hati babi, untuk mempelajari arteri Hulsen pada limpa lebih baik
digunakan limpa yang berasal dari babi dan sebagainya.

B. Pelaksanaan
Untuk jaringan yang berasal dari kadaver dan dari jaringan operasi, jaringan
yang telah diambil langsung dimasukkan kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi.
Sedangkan untuk jaringan yang berasal dari hewan tahapan pengambilan jaringan
adalah sebagai berikut
1. pembiusan
Untuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat dilakukan
dengan 2
cara yaitu :
a. Pembiusan inhalasi dengan menggunakan eter dan sungkup muka
b. Pembiusan dengan menyuntikkan zat anestesi seperti chloralhydrate, ketalar,
phenobarbital, dan sebagainya.
c. Campuran yaitu pembiusan inhalasi yang diikuti dengan pembiusan lewat suntikan

2. Pembedahan dan isolasi jaringan tubuh

Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah melakukan
operasi dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan. Jaringan tubuh lalu
dipotong-potong didalam cairan fisiologis (NaCl 0.9%) untuk mendapatkan ukuran
yang lebih kecil. Hal ini perlu dilakukan agar cairan fiksasi dapat masuk kedalam
jaringan dengan mudah dan baik. Potongan jaringan kemudian dimasukkan kedalam
wadah-wadah kecil yang telah diberikan label/keterangan. Wadah berisi cairan
fiksasi dan jaringan kemudian disimpan ditempat yang sesuai hingga saat
pemerosesan jaringan selanjutnya.

3. Fiksasi supravital/intra vital

Khusus untuk jaringan tubuh yang difiksasi secara supravital atau intravital,
segera setelah hewan terbius sempurna, hewan dibaringkan di atas meja operasi dan
diikat agar posisinya stabil. Setelah itu dinding perut dibuka dengan sayatan pada
garis tengah dilanjutkan ke samping kiri dan kanan pada sisi atas dan bawah.
Diafragma lalu dibuka. Tulang iga dipotong pada costosterno junction. Tulang
sternum lalu ditarik ke atas dan difiksasi. Setelah tulang sternum diangkat ke atas
akan terlihat jantung. Aurikula atrium kanan dan ventrikel kiri lalu diidentifikasi.
Perikardium lalu dibuka. Dinding aurikula atrium kanan digunting dan darah dibiarkan
mengalir. Setelah darah mengalir keluar, jarum yang disambung ke slang infus
ditusukkan kedalam ventrikel kiri. Peristaltik pump lalu dinyalakan dan cairan infus
akan mengalir masuk kedalam ventrikel kiri menggantikan darah yang hilang lewat
atrium kanan. Cairan infus yang pertama mengalir adalah cairan NaCl 0.9% untuk
membilas darah dari jaringan tubuh sehingga jaringan tubuh yang akan diambil
bebas dari kontaminasi darah. Selanjutnya akan mengalir cairan fiksasi yang akan
memfiksasi seluruh jaringan tubuh. Cairan fiksasi dibiarkan mengalir hingga seluruh
jaringan terfiksasi sempurna yang ditandai oleh adanya leher dan ekor yang kaku.
Selama cairan fiksasi mengalir akan terlihat kedutan pada seluruh otot. Setelah
seluruh jaringan terfiksasi sempurna, sisa bekuan darah.

MATERI II
PEMBUATAN PREPARAT OLES (HAPUSAN)

Sediaan hapus berarti meng”apus”kan (spread) suatu bahan diatas kaca

objek.dalam pemeriksaan hematologi bahan yang diapuskan adalah darah atau sum-
sum tulang. Pemeriksaan sediaan apus merupakan bagian yang penting dari rangkaian
pemeriksaan hematologi oleh karena sejumlah informasi dapat diperoleh dari
pengamatan sediaan ini,antara lain informasi mengenai morfologi dan distibusi
eritrosit,leukosit dan trombosit.kadang-kadang,tanpa di minta oleh dokter
klinik,bisa ditemukan adanya parasit malaria.
Reagensia :
 Giemsa
 Bufer Fosfat
 Aquades
Alat :
 Obyek glass
 Mikroskopis
 Dekglas
 Pipet pasteur
 Jembatan pengecatan
Cara kerja :
a. Pembuatan Sediaan Apusan Darah Tepi
Sebelumnya dibutuhkan pengambilan spesiem yang benar, yaitu dengan tabung anti
koagulan :
 Sebelum pembuatan darah sudah dihomogenkan
 Membolak balik darah dalam tabung dan memutar agar homogeny
 Malid dengan ujung rata, lebih sempit dari gelas obyek digunakan.
[: dibersihkan dari tubuh hewan dengan mencuci dengan air kran. Jaringan
tubuh yang diinginkan kemudian diisolasi, dipotong-potong dan dimasukkan
kedalam wadah yang berisi cairan fiksasi yang sama dengan cairan fiksasi yang
diinfuskan. Wadah yang berisi cairan fiksasi dan jaringan kemudian dilabel dan
disimpan hingga saat proses pengolahan jaringan selanjutnya.

MATERI III
PEMBUATAN PREPARAT METODE RENTANG
ALAT:
1. Bak Parafin 1 buah
2. Seperangkat alat bedah lengkap
3. Petridis 6 buah
4. Nampan 1 buah
5. Objeck glass 6 buah
6. Deck glass 6 buah
7. Jarum secukupnya
8. Pipet 6 buah
9. Mikroskop 1 buah
10. Alat tulis lengkap
BAHAN:
1. Subkutis(jaringan ikat atau jaringan lemak), mesenterium, pericardium dll dari
mencit
(Mus musculus)
2. Methyl alkohol 3% secukupnya
3. Alkohol(Absolut, 96%, 90%, 80%, 70%) secukupnya
4. Eosin secukupnya
5. Toluol secukupnya
CARA KERJA
Adapun cara kerjanya adalah sebagai berikut:
1. Mengambil jaringan segar yang digunakan dengan menggunakan benda tajam
seperti jarum preparat, pisau skalpel atau pisau runcing.
 2. Merentangkan sayatan jaringan segar pada objek glass kering(tanpa diberi
apapun, baik garam fisiologik atau fiktatif).
3. Memfiksasi menggunakan methyl alkohol 3% selama 1-3menit.
4. Melanjutkan dengan langkah berikut:
Alkohol absolut…………………. 1-3menit
Alkohol 96%……………………… 1-3menit
Alkohol 90%……………………… 1-3menit
Alkohol 80%……………………… 1-3menit
Alkohol 70%……………………… 1-3menit
Eosin……………………………….. 1-3menit
Alkohol 70%……………………… 1-3menit

MATERI IV
FIKSASI (FIXATION)
Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang
benar. Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat
diperbaiki lagi pada tahapan selanjutnya. Jadi hasil akhir sajian histologi yang baik
sangat tergantung pada cara melakukan fiksasi dengan baik.
Tujuan dari fiksasi adalah untuk
1. Mengawetkan jaringan.
Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan susunan jaringan agar mendekati
kondisi seperti sewaktu hidup.
2. Mengeraskan jaringan
Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak agar
memudahkan pembuatan irisan tipis.

Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah

1. Menghambat proses pembusukan dan autolysis

Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh

kuman-kuman pembusuk yang berasal dari luar tubuh. Waktu pembusukan untuk
setiap jaringan atau organ berbeda-beda tergantung kepada konsistensi dan
kandungan unsur-unsur penyusun jaringan tersebut. Jaringan usus dan otak sangat
rentan terhadap proses pembusukan dibandingkan jaringan tubuh lainnya.
Pembusukan seringkali disertai oleh pembentukan gas yang berbau. Autolisis adalah
proses perusakan jaringan tubuh yang disebabkan oleh ensim-ensim proteolitik yang
terdapat pada jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat terjadi
pada suhu tropik (24-36C). Proses proteolitik lebih mudah terjadi di Jakarta
dibandingkan dengan negeri-negeri dingin. Untuk menghindari proses pembusukan
dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan kedalam cairan fiksasi segera
setelah kematian atau segera setelah diambil dari tubuh. Bila keadaan ini tidak
memungkinkan jaringan dapat disimpan sementara di dalam ruangan dengan
temperatur yang sangat dingin (Freezer).

2. Pengawetan
Sel-sel dan jaringan diawetkan mendekati kondisinya seperti sewaktu hidup.
3. Pengerasan
Efek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak
4. Pemadatan koloid
Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (Sol) menjadi lebih
padat (Gel)
5. Differensiasi optik
Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga
unsur- unsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah dibandingkan
dengan jaringan yang belum difiksasi.
6. Pengaruh terhadap pewarnaan
Sebagian besar cairan fiksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia karena
mengikat bagian reaktif jaringan.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis adalah:
1. Tebal irisan jaringan 3-5mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat
medmfiksasi seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal maka permukaan
luarnya saja yang difiksasi dengan cukup baik, sedangkan bagian tengah
jaringan sudah keburu membusuk sebelum cairan fiksasi sempat merembes ke
sana.
2. Volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya harus 15-20x volume jaringan yang
akan difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang
 diperlukan sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan fiksasi. Panjang
dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan
digunakan.
3. Jenis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan
yang akan didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan.
Untuk keperluan praktis cairan fiksasi dapat dibedakan menjadi 3 kelompok
yaitu
2. Formol Calcium (Baker, 1944)
Formalin ............................................................................................. 10 ml
Calcium chlorida .................................................................................. 2 gr
Akuades ....................................... ................................................ad 100 ml
3. Buffer formalin
Formalin ............................................................................................ 10 ml
Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0.40 gr
Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0.65 gr
Akuades .........................................................................................…

: A. Micro-anatomical fixation
Fiksasi ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak
dipertahankan dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok
sel. Cairan fiksasi yang tergolong kelompok ini adalah cairan formalin atau
modifikasinya, cairan acetic alkohol formalin, cairan Heidenhain Susa, cairan
Zenker, cairan Bouin
B. Cytological fixatives
Fiksasi ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak
dipertahankan dan di ekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering di capai dengan
mengurbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan dengan
mikrotom dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi menjadi 2
kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan fiksasi yang
tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnov) dan fiksasi
sitoplasma (larutan Muller, formol saline, formol calcium, Zenker formol).
C. Histochemical fixatives
 Fiksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan
histokimia Cairan fiksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau sedapatnya
mengubah seminim mungkin unsur-unsur yang akan didemonstrasikan. Fiksasi
histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan
2. Mengikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus, tanpa mempengaruhi gugus
reaktif yang digunakan pada visualisasi.
3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi, misalnya
fiksatif glutaraldehida memfiksasi protein jaringan sedemikian rupa dengan
suatu coating terdiri atas gugus aldehida reaktif sehingga menghasilkan reaksi
PAS atau Schiff positif.

LARUTAN FORMALIN
Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Laurtan
formalin
yang digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah
Formalin (40% Formaldehida) ........................................................ 10 ml
Air .................................................................................................. 90 ml

Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari
total berat larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai
Formalin atau 40% Formaldehida. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan
formaldehida 40% =larutan jenuh gas formaldehida.

Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk

ini tak dapat digunakan untuk fiksasi. Yang dapat digunakan adalah bentuk
monomernya. Untuk menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu,
kecuali bila pH larutan netral atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi
tergantung pada pH. Jadi jangan sekali-kali menggunakan formalin 10% yang baru
dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum terfiksasi dengan baik. Selain
itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat oksidasi
formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit
alkalis dengan menggunakan larutan buffer phosphate dengan pH 7.2 sebagai
pelarut, atau dengan menambahkan kalsium asetat. Yang paling mudah dan murah
adalah Formol Saline dengan formulanya
Formalin (formaldehida 40%) .............................................................. 100ml
Sodium klorida (NaCl) .............................................................. 9gram
Air kran ............................................................ 900ml
Larutan formalin 10% dengan phosphate buffer yang sering digunakan adalah
1. Formol Calcium (Lillie 1965)
Formalin (40% formaldehida) ....................................................... 10 ml
Kalsium asetat ................................................................................. 2 gr
Akuades ................................................................................... ad 100 ml

Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat di ambil
dan dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lainnya bila diperlukanKekurangan larutan
fiksatif formalin adalahJaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan
waktu sedikitnya 24 jam baru dapat di proses

MATERI V

DEHIDRASI

Dehidrasi merupakan langkah ke dua dalam pemerosesan jaringan. Proses ini

(Gb-2)

bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan yang
telah difiksasi

sehingga jaringan nantinya dapat diisi dengan parafin atau zat lainnya yang dipakai
untuk

membuat blok preparat. Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur
dengan cairan
parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.

Ada beberapa macam cairan yang dapat dipakai untuk proses dehidrasi yaitu

1. Alkohol
2. sukrosa 20%
3. metil alkohol atau spiritus

Setelah jaringan selesai difiksasi jaringan dipindahkan ke dalam alkohol dan

diproses

sebagai berikut

1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari

2. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari
3. alkohol 70% .................................................................................................... 1 hari
4. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
5. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
6. alkohol 95% ................................................................................................... 1 hari
7. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari
8. alkohol 100% ................................................................................................. 1 hari
9. alkohol 100% .................................................................................................. 1 hari

Di samping cara di atas cara lain yang juga sering di pakai adalah dehidrasi
bertahap dengan

menggunakan alkohol dengan konsentrasi yang makin meningkat secara lebih

perlahan yaitu

1. alkohol 70% ................................................................................................... 1 hari

2. alkohol 80% .................................................................................................... 1 hari
3. alkohol 90% ...................................................................................................... 1 hari
4. alkohol 95% ...................................................................................................... 1 hari
5. alkohol 95% ....................................................................................................... 1 hari
6. alkohol 100% ...................................................................................................... 1
hari
7. alkohol 100% ..................................................................................................... 1 hari
 Alkohol yang sudah dipakai dapat dimurnikan denga cara memasukkan
cuprisulfat

(CuSO4) kedalamnya. Cuprisulfat yang bewarna putih (tak mengandung air) akan
berubah

menjadi biru (mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya
tetap putih

walaupun telah disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena

mengandung air dapat di hilangkan airnya dengan cara memanaskan.

Metil alkohol dapat digunakan menggantikan alkohol absolut. Metil alkohol ini
terlebih

dahulu diberi cuprisulfat hingga warnanya tetap putih, setelah itu siap untuk
digunakan. Bila

menggunakan spiritus harus ditest dulu dengan alkohol absolut murni sebagai
kontrol.

Untuk jaringan yang akan dipotong menggunakan cryostat dan blok preparat dibuat

menggunakan tissue tech jaringan di dehidrasi menggunakan sukrosa 20% selama 2

hari. Cairan

pekat sukrosa 20% ini dibuat dengan cara sebagai beikut

Sukrosa (gula pasir) ...................................................... 20 gram

Air suling .....................................................................ad 100 ml

MATERI VI

PEMBENINGAN (CLEARING)

Pembeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan
menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan parafin. Jaringan
tidak dapat

langsung dimasukkan ke dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling
melarutkan.

Proses mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam
jaringan masih

tertinggal sedikit alkohol maka parafin tidak bisa masuk kedalam jaringan sehingga
jaringan

menjadi “ matang diluar, mentah di dalam” dan akan menyebabkan jaringan menjadi
sulit untuk

dipotong dengan mikrotom.

Bahan atau reagen pembening yang paling sering dipakai adalah sebagai
berikut

1. chloroform
2. benzene/benzol
3. xylene/xylol
4. cedar wood oil
5. benzil benzoat
6. methyl benzoat

Chloroform

Chloroform merupakan clearing agent yang paling sering dipakai, karena

sifatnya yang

“toleran” artinya jaringan tidak menjadi keras dan rapuh. Sifat ini tak dipunyai oleh
benzene

dan xylene. Jaringan biasanya dibeningkan dalam waktu semalam

Kekurangan chloroform adalah titik akhirnya yaitu saat jaringan telah menjadi
bening dan
transparan yang tak dapat terlihat dengan jelas oleh mata. Untuk mengatasi hal ini
jaringan

sebaiknya direndam dalam chloroform untuk jangka waktu yang lebih panjang dari
yang

sebenarnya, sehingga seluruh alkohol diyakini telah keluar dari jaringan dan jaringan
telah

sempurna diresapi oleh chloroform. Kekurangan lainnya adalah chloroform harganya

ebih

mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedarwood oil

Benzene/Benzol dan Xylene

Benzene dan xylene merupakan clearing agent yang cukup cepat. Masa kerja
benzene

lebih sedikit lambat dari xylene, tetapi tidak membuat jaringan menjadi serapuh
bila

menggunakan xylene. Potongan kecil dapat dibuat menjadi bening dalam waktu ½ - 1
jam,

sedangkan yang lebih tebal (5mm) telah menjadi bening dalam waktu 2-4 jam.

Benzene saat ini sudah jarang dipakai karena sifat karsinogeniknya.

Bila xylene atau xylol yang dipakai sebagai zat pembening, metodanya adalah
sebagai

berikut:

1. Setelah jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi (alkohol) jaringan

dimasukkan
1. kedalam xylol I selama 1 jam.
2. Perhatikan jaringan akan menjadi bening
3. untuk menyakinkan bahwa seluruih cairan alkohol telah keluar, jaringan
kemudian
 4. dipindahkanke cairan xylol II. Lama inkubasi dalam xylol tergantung pada
besarnya
5. jaringan, tetapi biasanya berkisar antara ½ - 1 jam.
4. Jaringan kemudian direndam dalam parafin cair di dalam oven selama kira-
kira ½ jam.
6. Setelah itu jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.

Benzyl benzoat

Benzyl benzoat merupakan clearing agent yang lambat penetrasinya sehingga

dibutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama Metoda pembeningan adalah sebagai
berikut

1. Benzyl benzoat I

Jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi dan direndam dalam benzyl benzoat
selama

semalam (24 jam) sampai seluruh jaringan tenggelam. Benzyl benzoat mempunyai

penetrasi yang lambat sehingga tidak perlu kuatir jaringan menjadi terlalu keras
dan

rapuh.. Setelah inkubasi selama semalam, jaringan akan tampak menjadi bening dan

transparan.

2. Benzyl benzoat II

Jaringan lalu dipindahkan ke dalam benzyl benzoat II selama kira-kira 2-3 jam.

3. Benzol parafin

Jaringan lalu dipindahkan ke dalam campuran benzol dan parafin cair dengan

perbandingan yang sama, misalnya benzol/benzene sebanyak 25 ml di campur dengan

parafin cair sebanyak 25 ml juga. Jaringan direndam dalam benzol parafin selama ½-
1

jam.

4. Parafin cair

Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair selam kira-kira ½ jam.

Setelah itu

jaringan siap untuk dimasukkan kedalam blok parafin.

5. Bisa juga setelah dari benzyl benzoat II jaringan direndam dalam xylol/xylene
selama

½-1jam, baru kemudian dimasukkan kedalam parafin cair di oven selama ½ jam.

Cedarwood oil

Cedarwood oil merupakan zat pembening termahal dari semua clearing agent
tetapi

merupakan clearing agent terbaik, karena sifatnya yang tidak mengeraskan

jaringan, sehingga

nantinya jaringan sangat mudah untuk diiris tipis dengan mikrotom. Jaringan dapat
direndam

dalam clearing agent ini untuk waktu yang lama bahkan hingga berbulan-bulan tanpa
menjadi

keras dan rusak. Pembeningan oleh cedarwood oil ini sangat baik tidak hanya untuk
jaringan

yang halus tetapi juga untuk jaringan yang keras seperti kulit dan jaringan ikat
padat.