MATA KULIAH : SISTEM MANAJEMEN MUTU

PEMBIMBING : WIDARTI.,S.si,APT,M.M.Kes

Prosedur Kalibrasi Alat Labolatorium Bentuk Uraian

Disusun oleh

Fitriana
PO714203171013

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLTEKKES KEMENKES MAKASSAR
TEKNOLOGI LABOLATORIUM MEDIS
DIPLOMA IV
2020
PENDAHULUAN

Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi dari
spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap
untuk diamati atau dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk

1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari

bentuk dan struktur jaringan tubuh tertentu yang normal.
2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan
percobaan yang mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari
pertumbuhan dan perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu.
3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang
pasien

Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus dapat
memberikan gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel dan
sitoplasma; badan inklusi (glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya); susunan serat
jaringan ikat; otot dan lain sebagainya sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut
dalam kondisi hidup.

Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur histologi

jaringan tubuh sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup.

Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar shahih
(valid/akurat) yang sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan
yang timbul. Di samping itu sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk
menunjang diagnosa penyakit yang diderita oleh pasien.

SUMBER JARINGAN ATAU ORGAN

1. Manusia
Jaringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur
histologi yang harus dipelajari oleh mahasiswa adalah struktur histologi
manusia. Jaringan tubuh ini dapat di ambil dari cadaver (jenazah) dengan syarat
jaringan atau organ tersebut di ambil kurang dari 3 jam setelah kematian,
sebab bila lebih lama sudah terjadi pembusukan atau autolisis. Sayangnya
syarat tersebut pada masa kini hampir mustahil dapat dipenuhi. Cara lain
adalah mengambil jaringan atau organ tersebut dari kamar operasi.

2
 2. Hewan
Jaringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternatif.
Beberapa hewan yang sering dipakai adalah
a. Kera, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama-sama
tergolong mahluk primata
b. Kambing, terutama untuk melihat serat Purkinje di jantung
c. Babi untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri Hulsen pada limpa.
d. Kucing dan anjing
e. Tikus putih (mice) dan rat
f. Kelinci
Jaringan dapat diambil dari hewan yang difiksasi dalam keadaan hidup (fiksasi
supra/
intravital) atau hewan yang telah mati (fiksasi emersi/rendam).

Histoteknik ini dapat dilakukan oleh staf pengajar, peneliti atau teknisi
laboratorium. Setiap staf pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik pembuatan
sajian histologi dengan baik, karena setiap staf pengajar bagian biomedik dituntut
untuk dapat melakukan riset yang sering kali melibatkan teknik pembuatan sediaan
histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat sajian histologi sendiri, karena dengan
melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui kesulitan-kesulitan yang terjadi
sekaligus cara untuk mengatasinya. Disamping peneliti juga dapat mengamati hal-hal
yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian.

3
MATERI I
(PENGAMBILAN ) JARINGAN TUBUH

A. Persiapan
Sebelum jaringan tubuh diambil beberapa pesiapan perlu dilakukan yang
terdiri atas
1. Persiapan alat dan bahan/cairan

Perangkat peralatan yang harus dipersiapkan untuk melakukan isolasi

atau pengambilan jaringan tubuh terdiri atas peralatan bedah minor
(gunting, pinset, scalpel, klem, pemegang jaringan, kassa, dll), meja
operasi, lampu, peralatan anestesi (disposible syringe, sungkup/masker
anestesi) dan obat anestesi (eter, ketalar, phenobarbital dll) serta
perangkat pengawetan jaringan (fiksasi jaringan) seperti wadah untuk
fiksasi emersi, cairan fiksasi (Formol salin, Muller, Bouin, Zenker dll),
peristaltik pump/syringe pump untuk fiksasi supravital dan lain-lain

2. Persiapan sampel

Untuk jaringan yang diambil dari kadaver atau manusia, jaringan

segera diambil dan dimasukkan kedalam caian fiksasi. Untuk sampel yang
diambil dari hewan, maka hewan perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Hewan
yang dipilih haruslah sehat, galurnya harus baik dan jelas, mempunyai
status gizi yang baik dan dipelihara sesuai dengan syaratsyarat
pemeliharaan hewan coba. Hewan yang digunakan dipilih sesuai dengan
tujuan penelitian dan pengajaran. Kera merupakan hewan yang
mempunyai struktur tubuh yang mirip dengan manusia. Untuk
mempelajari serat purkinje pada jantung dengan lebih jelas dapat
digunakan jantung kambing, untuk mempelajari lobulus hati klasik
degan lebih baik digunakan hati babi, untuk mempelajari arteri Hulsen pada
limpa lebih baik digunakan limpa yang berasal dari babi dan sebagainya.

4
B. Pelaksanaan

Untuk jaringan yang berasal dari kadaver dan dari jaringan operasi, jaringan
yang telah diambil langsung dimasukkan kedalam wadah yang berisi
cairan fiksasi. Sedangkan untuk jaringan yang berasal dari hewan tahapan
pengambilan jaringan adalah sebagai berikut

1. Pembiusan

Untuk membius hewan yang akan diambil jaringan tubuhnya dapat

dilakukan dengan 2 cara yaitu

a. Pembiusan inhalasi dengan menggunakan eter dan sungkup muka

b. Pembiusan dengan menyuntikkan zat anestesi seperti
chloralhydrate, ketalar, phenobarbital, dan sebagainya.
c. Campuran yaitu pembiusan inhalasi yang diikuti dengan
pembiusan lewat suntikan
2. Pembedahan dan isolasi jaringan tubuh

Setelah hewan terbius sempurna, proses selanjutnya adalah

melakukan operasi dan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan.
Jaringan tubuh lalu dipotong-potong didalam cairan fisiologis (NaCl
0.9%) untuk mendapatkan ukuran yang lebih kecil. Hal ini perlu
dilakukan agar cairan fiksasi dapat masuk kedalam jaringan dengan
mudah dan baik. Potongan jaringan kemudian dimasukkan kedalam
wadah-wadah kecil yang telah diberikan label/keterangan. Wadah berisi
cairan fiksasi dan jaringan kemudian disimpan ditempat yang sesuai
hingga saat pemerosesan jaringan selanjutnya.

3. Fiksasi supravital/intra vital

Khusus untuk jaringan tubuh yang difiksasi secara supravital atau

intravital, segera setelah hewan terbius sempurna, hewan dibaringkan di
atas meja operasi dan diikat agar posisinya stabil. Setelah itu dinding
perut dibuka dengan sayatan pada garis tengah dilanjutkan ke
samping kiri dan kanan pada sisi atas dan bawah. Diafragma lalu dibuka.
Tulang iga dipotong pada costosterno junction. Tulang sternum lalu
ditarik ke atas dan difiksasi. Setelah tulang sternum diangkat ke atas akan

5
terlihat jantung. Aurikula atrium kanan dan ventrikel kiri lalu
diidentifikasi. Perikardium lalu dibuka. Dinding aurikula atrium kanan
digunting dan darah dibiarkan mengalir. Setelah darah mengalir
keluar, jarum yang disambung ke slang infus ditusukkan kedalam
ventrikel kiri. Peristaltik pump lalu dinyalakan dan cairan infus akan
mengalir masuk kedalam ventrikel kiri menggantikan darah yang
hilang lewat atrium kanan. Cairan infus yang pertama mengalir
adalah cairan NaCl 0.9% untuk membilas darah dari jaringan tubuh
sehingga jaringan tubuh yang akan diambil bebas dari kontaminasi
darah. Selanjutnya akan mengalir cairan fiksasi yang akan
memfiksasi seluruh jaringan tubuh. Cairan fiksasi dibiarkan mengalir
hingga seluruh jaringan terfiksasi sempurna yang ditandai oleh
adanya leher dan ekor yang kaku. Selama cairan fiksasi mengalir akan
terlihat kedutan pada seluruh otot. Setelah seluruh jaringan terfiksasi
sempurna, sisa bekuan darah dibersihkan dari tubuh hewan dengan
mencuci dengan air kran. Jaringan tubuh yang diinginkan kemudian
diisolasi, dipotong-potong dan dimasukkan kedalam wadah yang berisi
cairan fiksasi yang sama dengan cairan fiksasi yang diinfuskan.
Wadah yang berisi cairan fiksasi dan jaringan kemudian dilabel dan
disimpan hingga saat proses pengolahan jaringan selanjutnya.

6
MATERI II
PEMBUATAN PREPARAT OLES (HAPUSAN)

Sediaan hapus berarti meng”apus”kan (spread) suatu bahan diatas kaca

objek.dalam pemeriksaan hematologi bahan yang diapuskan adalah darah atau sum-sum
tulang.
Pemeriksaan sediaan apus merupakan bagian yang penting dari rangkaian
pemeriksaan hematologi oleh karena sejumlah informasi dapat diperoleh dari pengamatan
sediaan ini,antara lain informasi mengenai morfologi dan distibusi eritrosit,leukosit
dan trombosit.kadangkadang,tanpadi minta oleh dokter klinik,bisa ditemukan adanya
parasit malaria.

Reagensia :

 Giemsa
 Bufer Fosfat
 Aquades

Alat :

 Obyek glass
 Mikroskopis
 Dekglas
 Pipet pasteur
 Jembatan pengecatan

Cara kerja :

a. Pembuatan Sediaan Apusan Darah Tepi

Sebelumnya dibutuhkan pengambilan spesiem yang benar, yaitu dengan

tabung anti koagulan :

 Sebelum pembuatan darah sudah dihomogenkan

Membolak balik darah dalam tabung dan memutar agar homogeny

 Malid dengan ujung rata, lebih sempit dari gelas obyek digunakan.

7
 Meneteskan darah pada obyek glas secukupnya

 Sudut pendorongan bisa dengan sudut 25-45 derajat sesuai kekentalan darah

 Dorong perlahan dengan konstan tidak terputus putus

 Tunggu sampai kering

8
 Secara makroskopis sediaan apusan darah yang sempurna dapat
dilihat dari kepala (bagian awal) dan ekor (bagian akhir) sebagai berikut :

1. Panjang apusan 2/3 panjang gelas obyek.

2. Sebagai gambaran bendera dengan ujung tanpa robekan
3. Hasil pewarnaan bergradasi dengan bagian kepala tebal semakin ke
ekor menipis.

b. Pengecatan
 Sediaan apusan kering difiksasi dengan methanol selama 5 menit (sebaiknya
dalam staining jar) fiksasi lebih lama (10-15 menit) untuk jumlah lekosit
tinggi.
 Cat giemsa diencerkan dengan larutan buffer ph 6,8 dengan perbandingan 1:9

 Genangi preparat dengan cat diamkan selama 10 menit

 Bilas dibuang hati hati keringkan

9
  Pegamatan preparat preparat kemudian siap diamati dengan mikroskop
perbesaran 40X,100X.
Alat penghitung Sel

Perbesaran dengan lensa mikroskop

MATERI III
PEMBUATAN PREPARAT METODE RENTANG

ALAT:
1. Bak Parafin 1 buah
2. Seperangkat alat bedah lengkap

10
 3. Petridis 6 buah
4. Nampan 1 buah
5. Objeck glass 6 buah
6. Deck glass 6 buah
7. Jarum secukupnya
8. Pipet 6 buah
9. Mikroskop 1 buah
10. Alat tulis lengkap

BAHAN:
1. Subkutis(jaringan ikat atau jaringan lemak), mesenterium, pericardium dll dari
mencit (Mus musculus)
2. Methyl alkohol 3% secukupnya
3. Alkohol(Absolut, 96%, 90%, 80%, 70%) secukupnya
4. Eosin secukupnya
5. Toluol secukupnya

CARA KERJA

Adapun cara kerjanya adalah sebagai berikut:

1. Mengambil jaringan segar yang digunakan dengan menggunakan benda tajam

seperti jarum preparat, pisau skalpel atau pisau runcing.
2. Merentangkan sayatan jaringan segar pada objek glass kering(tanpa diberi
apapun, baik garam fisiologik atau fiktatif).
3. Memfiksasi menggunakan methyl alkohol 3% selama 1-3menit.
4. Melanjutkan dengan langkah berikut:

Alkohol absolut…………………. 1-3menit

Alkohol 96%……………………… 1-3menit
Alkohol 90%……………………… 1-3menit
Alkohol 80%……………………… 1-3menit
Alkohol 70%……………………… 1-3menit
Eosin……………………………….. 1-3menit

11
 Alkohol 70%……………………… 1-3menit
Alkohol 80%……………………… 1-3menit
Alkohol 90%……………………… 1-3menit
Alkohol 96%……………………… 1-3menit
Alkohol Absolut…………………. 1-3 menit
Toluol………………………………. 1-3menit
Xylol………………………………… 1-3menit

1. Menutup preparat menggunakan deck glass

2. Mengamati dibawah mikroskop dan memberi kesimpulan

HASIL dan PEMBAHASAN

HASIL:

Gambar 1.

Preparat rentang

Spesies: Mus musculus (mencit)

1. Bagian penggantung testis (mesenterium)

2. Berbentuk jaringan ikat padat tak beraturan

Gambar 2.
Preparat rentang
Spesies: Mus musculus (mencit)

12
Keterangan:
1. Bagian dibawah kulit (sub kutis)
2. Berbentuk jaringan ikat longgar

MATERI IV
FIKSASI (FIXATION)

13
 Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang
benar.
Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada
tahapan selanjutnya. Jadi hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada
cara
melakukan fiksasi dengan baik.
Tujuan dari fiksasi adalah untuk
1. Mengawetkan jaringan.
Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan susunan jaringan agar mendekati
kondisi seperti sewaktu hidup.
2. Mengeraskan jaringan
Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak agar
memudahkan pembuatan irisan tipis.
Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah
1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis
Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman-
kuman pembusuk yang berasal dari luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap
jaringan atau organ berbeda-beda tergantung kepada konsistensi dan
kandungan unsur-unsur penyusun jaringan tersebut. Jaringan usus dan otak
sangat rentan terhadap proses pembusukan dibandingkan jaringan tubuh
lainnya. Pembusukan seringkali disertai oleh pembentukan gas yang berbau.

Autolisis adalah proses perusakan jaringan tubuh yang disebabkan oleh

ensim-ensim proteolitik yang terdapat pada jaringan tersebut. Proses proteolitik
ini akan lebih cepat terjadi pada suhu tropik (24-36C). Proses proteolitik
lebih mudah terjadi di Jakarta dibandingkan dengan negeri-negeri dingin.

Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera

dimasukkan kedalam cairan fiksasi segera setelah kematian atau segera setelah
diambil dari tubuh. Bila keadaan ini tidak memungkinkan jaringan dapat
disimpan sementara di dalam ruangan dengan temperatur yang sangat dingin
(Freezer).

2. Pengawetan

14
 Sel-sel dan jaringan diawetkan mendekati kondisinya seperti sewaktu hidup.

3. Pengerasan
Efek pengerasan akan mempermudah penangan jaringan lunak, misalnya otak

4. Pemadatan koloid
Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (Sol) menjadi
lebih padat (Gel)
5. Differensiasi optik
Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan sehingga
unsurunsur yang belum diwarnai dapat dilihat dengan lebih mudah
dibandingkan dengan jaringan yang belum difiksasi.
6. Pengaruh terhadap pewarnaan
Sebagian besar cairan fiksasi yang ada mempengaruhi reaksi histokimia
karena mengikat bagian reaktif jaringan.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis adalah:

1. Tebal irisan jaringan 3-5mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat
medmfiksasi seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal maka permukaan
luarnya saja yang difiksasi dengan cukup baik, sedangkan bagian tengah
jaringan sudah keburu membusuk sebelum cairan fiksasi sempat merembes ke
sana.
2. Volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya harus 15-20x volume jaringan
yang akan difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi
yang diperlukan sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan fiksasi.
Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan
digunakan.
3. Jenis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan
yang akan didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan.
Untuk keperluan praktis cairan fiksasi dapat dibedakan menjadi 3 kelompok yaitu

A. Micro-anatomical fixation
Fiksasi ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan
dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. Cairan

15
 fiksasi yang tergolong kelompok ini adalah cairan formalin atau modifikasinya, cairan
acetic alkohol formalin, cairan Heidenhain Susa, cairan Zenker, cairan Bouin

B. Cytological fixatives
Fiksasi ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak
dipertahankan
dan di ekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering di capai
denganmengurbankan
penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan dengan mikrotom dan
hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu
fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan fiksasi yang tergolong dalam
kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnov) dan fiksasi sitoplasma (larutan
Muller, formol saline, formol calcium, Zenker formol).

C. Histochemical fixatives
Fiksasi ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan
histokimia Cairan fiksasi yang digunakan tidak boleh mengubah atau sedapatnya
mengubah seminim mungkin unsur-unsur yang akan didemonstrasikan. Fiksasi
histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
1. Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan
2. Mengikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus, tanpa mempengaruhi gugus
reaktif yang digunakan pada visualisasi.
3. Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi, misalnya
fiksatif glutaraldehida memfiksasi protein jaringan sedemikian rupa dengan suatu
coating terdiri atas gugus aldehida reaktif sehingga menghasilkan reaksi PAS atau
Schiff positif.

LARUTAN FORMALIN

Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan.

Laurtan formalin yang digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan
adalah

Formalin (40% Formaldehida) ........................................................ 10 ml

16
 Air .................................................................................................. 90 ml

Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari
total berat larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai
Formalin atau 40% Formaldehida. Telah disepakati bahwa yang dimaksud
dengan formaldehida 40% = larutan jenuh gas formaldehida.

Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini
tak dapat digunakan untuk fiksasi. Yang dapat digunakan adalah bentuk
monomernya. Untuk menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan
waktu, kecuali bila pH larutan netral atau sedikit alkalis, karena kecepatan
depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekali-kali menggunakan formalin
10% yang baru dibuat karena jaringannya keburu membusuk sebelum terfiksasi
dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat
akibat oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral
atau sedikit alkalis dengan menggunakan larutan buffer phosphate dengan pH
7.2 sebagai pelarut, atau dengan menambahkan kalsium asetat. Yang paling
mudah dan murah adalah Formol Saline dengan formulanya

Formalin (formaldehida 40%) .............................................................. 100ml

Sodium klorida (NaCl) .............................................................. 9gram
Air kran ............................................................ 900ml

Larutan formalin 10% dengan phosphate buffer yang sering digunakan adalah
1. Formol Calcium (Lillie 1965)
Formalin (40% formaldehida) ....................................................... 10 ml
Kalsium asetat ................................................................................. 2 gr
Akuades ................................................................................... ad 100 ml

2. Formol Calcium (Baker, 1944)

Formalin ............................................................................................. 10 ml
Calcium chlorida .................................................................................. 2 gr
Akuades ....................................... ................................................ad 100 ml

17
3. Buffer formalin
Formalin ............................................................................................ 10 ml
Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0.40 gr
Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0.65 gr
Akuades ...........................................................................................ad 100 ml
4. Buffered formalin sukrosa (Holt dan Hicks, 1961)
Formalin ............................................................................................. 10 ml
Sukrosa ................................................................................................ 7.5 gr
M/15 Phosphate buffer (pH 7.4) .......................................................ad 100 ml

Cairan fiksatif formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan
sangat baik, phospholipid dan beberapa ensim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk
dipakai pada penelitian gabungan secara sitokimia dan mikroskop elektron.
Untuk mendapatkan hasil yang terbaik jaringan harus di dinginkan sampai 4 derajat
Celsius dalam refrigerator.

Kelebihan larutan fiksatif formalin adalah

a. merupakan cairan fiksatif umum
b. pH mendekati netral
c. Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk karena
pembentukannya baru terjadi bila ada interaksi antara larutan formalin pada pH
asam dengan hemoglobin atau produknya (sering dijumpai pada organ yang
mengandung banyak darah seperti hepar, lien, sumsum tulang dan sebagainya).
Bila pigmen ini terbentuk dapat dihilangkan dengan perlakuan pikrat-alkohol
atau larutan alkohol 1% dalam sodium hidroksida (NaOH)
d. Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formol salin untuk jangka
waktu lama (dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti
e. Bla diperlukan jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat di
ambil dan dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lainnya bila diperlukan

Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah

Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam
baru dapat diproses.

18