Teknik dan Analisis Biologi

Sel dan Molekuler

Miftahul Huda Fendiyanto dan Rizky Dwi Satrio

Plant Physiology and Molecular Biology Laboratory

Bogor Agricultural University
ELISA
(Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay)
Analisis kuantitatif protein
1. Ekstrak kasar (protein total)
-> Antigen
2. + antibodi1 spesifik target
3. + antibodi2 spesifik antibodi1
tertaut enzim
4. + substrat enzim
5. Amati perubahan reaksi
susbtrat menjadi produk
- dengan teknik
spektrofotometri dapat
dilakukan analisis kuantitatif
Modifikasi teknik ELISA

Enzim konjugat/tertaut antibodi:

- Alkalin fosfatase
- Horseradish peroxidase
- Β-Galaktosidase
PCR (Polymerase Chan Reaction)

• PCR amplifies DNA

• Makes lots and lots of copies of a few copies of
DNA
• Can copy different lengths of DNA, doesn’t have
to copy the whole length of a DNA molecule
• One gene
• Several genes
• Lots of genes
• Artificial process which imitates natural DNA
replication
How PCR Works
• Reagents Needed
• DNA sample which you want to amplify
• DNA polymerase
• Taq DNA polymerase – Works at high temps (explained in a
minute)
• Nucleotides
• Called dNTPs
• Pair of primers
• One primer binds to the 5’ end of one of the DNA strands
• The other primer binds to the 3’ end of the anti-parallel DNA
strand
• Delineate the region of DNA you want amplified
• Water
• Buffer
How PCR Works
• Temperature Protocol
• Initial Melt: 94ºC for 2 minutes
• Melt: 94ºC for 30 seconds
• Anneal: 55ºC for 30 seconds
• Extend: 72ºC for 1 minute 30-35
• Final Extension: 72ºC for 6 minutes cycles
• Hold: 4ºC
Elektroforesis
• Memisahkan DNA/RNA/Protein berdasarkan berat
molekul, ukuran, muatan
• Media pemisah:
Agarosa - DNA/RNA
Poliakrilamide - DNA, protein
Pati/starch - isoenzim
 Modifikasi Elektroforesis
• Single-strand conformation polymorphism (SSCP)
• Denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE)

aplikasi: METAGENOMIK
1. Isolasi DNA komunitas mikroba
(tanah, tumbuhan, saluran pencernaan)

2. PCR (primer universal)

3. Pemisahan (DGGE/SSCP)

4. PCR & sekuensing
Elektroforesis Protein
RT-PCR & qPCR (analisis ekspresi gen)
Modifikasi dari teknik PCR, digunakan untuk analisis
ekspresi gen
Metode
Isolasi RNA Total
Normal RT-PCR (semikuantitatif)

Sintesis cDNA
Reverse Transkriptase
primer oligo-dT

PCR gen target

Primer gen target
RT-qPCR (kuantitatif): mesin qPCR
Sekuensing DNA (metode Sanger)
Bagaimana urutan nukleotidanya?

CTACGATTAG
Hibridisasi
Metode Hibridisasi Blot/Template Probe
Southern Blotting DNA DNA atau RNA
Northern Blotting RNA DNA atau RNA
Western Blotting Protein Antibodi

1. Isolasi DNA/RNA/Protein total

2. Pemisahan (elektroforesis)
3. Pemindahan ke kertas nitroselulosa
4. Hibridisasi dengan probe yang sesuai
5. Interpretasi dan analisis data
 Elektroforesis Probing Interpretasi data
Aplikasi
• Analisis keragaman ?
• Analisis jumlah salinan gen ?
• Analisis ekspresi gen ?
Teknologi DNA Rekombinan
Vektor Kloning
• Mampu bereplikasi
• Punya penanda genetik
• Punya situs spesifik untuk memasukkan sisipan
Tipe Vektor Jenis Inang Kapasitas sisipan
Plasmid E. Coli 0.1 – 10 kb
Fage lambda E. Coli 10-20 kb
Cosmid E. Coli 35 – 45 kb
BAC (Bacterial E. coli 50 – 300 kb
Artificial
Chromosome)
YAC (Yeast Artificial Yeast (khamir) 100 – 2000 kb
Chromosome)
 Vektor Kloning

• Replikasi = ori
• Penanda genetik = ampR, lacZ (seleksi biru-putih)
• Situs spesifik untuk memasukkan sisipan (MCS)
• Situs penempelan untuk primer sekuensing (SP6, T7)
Vektor Ekspresi
• Mampu bereplikasi (2 jenis ori = shuttle vector)
• Punya penanda genetik (gen resisten antibiotik, dll.)
• Punya situs spesifik untuk memasukkan sisipan
(multi-cloning site)
• Punya daerah Promotor spesifik sel inang
• Punya daerah Terminator
• Punya Ribosome Binding Site (RBS)
• Jika pada tumbuhan: punya sekuen berulang
terbalik untuk rekombinasi situs khusus, mis. Left
Border (LB) & Right Border (RB)
Vektor ekspresi untuk
tumbuhan
 Transformasi: Seleksi biru-putih
• LacZ: penyandi β-galaktosidase
• X-Gal + β-galaktosidase = warna biru
STUDI MARKER MOLEKULAR
Analisis SNP dari 3 gen digunakan untuk menentukan ayah dari
seorang bayi yang terlibat dalam sengketa kepemilikian anak. Berikut
adalah hasil analisis SNP dari

Berdasarkan hasil tersebut, pria manakah yang merupakan ayah sang bayi?
A. Pria 1
B. Pria 2
C. Pria 3
D. Pria 2 atau 3
E. Pria 1 atau 3