Metode Analisis Molekuler:

Polymerase Chain Reaction

(PCR)

apt. Nur Herlina Nasir, S.Farm., M.Pharm.Sci.

Ingat Kembali Materi Terkait DNA
Ingat Kembali Materi Terkait
Replikasi
Reaksi Polimerase Berantai
 Reaksi Polimerase Berantai
• Reaksi Polimerase Berantai ~ Polymerase
Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode
amplifikasi (perbanyakan) fragmen DNA
secara invitro berdasarkan prinsip replikasi
DNA

• Metode ini dikembangkan oleh ilmuan

biokimia bernama Kary Mullis (1983)
• Berkat penemuannya ini Kary Mullis
memenangkan hadiah Nobel dibidang Kimia
pada tahun 1993
 Replikasi vs PCR
No Replikasi DNA
1 Enzim Helikase
2 Origin of Replication
3 Enzim Primase
4 Enzim DNA Polimerase
5 Proses Elongasi
6 Satu siklus = 1 pembelahan
sel bakteri
PCR
Pemanasan suhu 90 – 95 oC
Sepasang Primer spesifik
komplemen dengan basa
template
Penurunan suhu menjadi 50 –
60 oC
Enzim DNA Polimerase
termostabil
Suhu dipertahankan 70 – 80 oC
Jumlah siklus 20 – 40 x
Komponen Reaksi PCR
 Fragmen DNA/Cetakan DNA
Target DNA (template) yang akan diamplifikasi /
perbanyak

• Sumber DNA bisa dari mana saja:

 DNA sel prokariotik  DNA virus
 DNA sel eukariotik  DNA rekombinan/kloning
 DNA mitokondria
• Sebelum dijadikan template, DNA dari sel ataupun
sampel lainnya harus diisolasi/diekstraksi terlebih
dahulu
• Proses/metode isolasi disesuaikan dengan karakteristik
sel dan sampelnya
 Sepasang Primer
Oligonukleotida DNA rantai tunggal pendek yang
berkomplemen dengan urutan basa target DNA yang
akan diamplifikasi

• Primer menentukan spesifisitas reaksi dari metode PCR

• Hasil dari PCR (amplikon) besarannya ditentukan dari
jarak antar pasangan primer
• Primer dapat dirancang sesuai dengan keinginan
• Sebelum digunakan, primer sebaiknya dioptimasi untuk
mendapatkan hasil yang optimal
 Kriteria Primer
• Panjang primer
18 – 22 pasang basa
• Melting temperature (Tm) / suhu peleburan
52 – 60 oC
• Kandungan Guanin (G) dan Sitosin (C)
40 – 60 %
• Hindari struktur sekunder
– Hair-pin Loop
– Self-Dimer
– Cross-Dimer
https://youtu.be/OcN6mML3
DGI
Enzim DNA Polimerase Termostabil
Enzim termostabil yang berperan dalam sintesis
DNA

• Bersifat termostabil agar tahan terhadap tahapan

reaksi bersuhu tinggi
• Berfungsi mensistesis rantai DNA baru dari
cetakan DNA yang digunakan
• Jenis yang umum digunakan adalah enzim Tag
Polimerase yang berasal dari mikroorganisme
Thermophillus aquaticus
Beberapa Contoh Enzim
Polimerase
 Deoksinukleotida Trifosfat (dNTP)
dNTP merupakan nukleotida penyusun rantai
DNA baru

• Merupakan material building blocks/penyusun

dari sintesis DNA
• Memiliki 2 tambahan gugus fosfat dari bentuk
nukelotida pada umumnya
• N ~ Nukeolutida secara umum, mewakili A, C,
T, dan G
Struktur dNTP
 Larutan Penyangga/Buffer
Mempertahankan kondisi lingkungan yang optimal
untuk reaksi PCR

• Diperlukan untuk menciptakan kondisi lingkungan yang

optimal dikarenakan proses sistesis DNA terjadi secara
invitro
• Beberapa komponen dalam buffer PCR:
– 100 mM Tris-HCl (pH 8,8) mempertahankan kondisi pH
antara 8-9
– 50 mM KCl  memfasilitasi penempelan primer saat PCR
– 15 mM MgCl2  co-faktor bagi enzim polimerase
Tahapan Utama Metode PCR
 Tahap Denaturasi
Pemisahan untai ganda DNA menjadi untai
tunggal

• Tahapan pertama dari metode PCR

dimana terjadinya pemutusan ikatan
hidrogen antar basa nitrogen pada DNA
yang menyebabkan untai ganda DNA
menjadi untai tunggal
• Suhu reaksi: 90 – 98 oC selama 20-30
detik
 Tahap Penempelan/Annealing
Penempelan primer pada fragmen
spesifik DNA target

• Tahapan kedua dari metode PCR

dimana terjadinya penempelan
primer pada fragmen spesifik DNA
target sesuai dengan urutan basa
primernya yang telah dirancang
sebelumnya
• Suhu reaksi: 50 – 65 oC selama 20-
40 detik
 Tahap Ekstensi/Pemanjangan
Pemanjangan primer/sintesis DNA
sesuai dengan urutan fragmen spesifik
DNA target

• Tahapan terakhir dari metode PCR

dimana terjadinya pemanjangan
primer (sintesis DNA) dengan
bantuan enzim DNA polimerase
membentuk komplemen DNA dari
untai tunggal DNA target
• Suhu reaksi: 70 – 80 oC selama 60
detik
Animasi Reaksi PCR
 Instrumentasi PCR & Pendukung

Vortex
Kabinet PCR Minisentrifus
Mikrosentrifus

Drybath

Mesin PCR
Mikropipet Cool Plate
 Titik Kritis Pengerjaan PCR
Mari mengenal titik kritis dari metode PCR

1. Metode Ekstraksi DNA

2. Design Primer
3. Protokol Pengerjaan dan Komposisi Reaksi
PCR
4. Design Laboratorium
 Aplikasi PCR
Mari mengenal beberapa aplikasi dari metode PCR

1. Pendeteksian Cemaran Organisme,

2. Pengidentifikasian Orgenisme,
3. DNA Forensik,
4. Diagnosis Penyakit,
5. Pemetaan Sifat Keturunan,
6. Isolasi Gen,
7. Perubahan/Mutasi Genetik,dsb.
Ilustrasi Aplikasi PCR

https://youtu.be/ThG_02mi
q-4
 Beberapa Tipe PCR
Mari mengenal tipe-tipe PCR berdasarkan prinsip kerjanya:

1. Konvensional PCR (PCR)

PCR generasi pertama
2. Real-time PCR (qPCR)
PCR generasi kedua
3. Digital PCR (qPCR)
PCR generasi ketiga
4. Isotermal PCR (LAMP – Loop Mediated Isothermal
Amplification)
Rapid PCR
 Konvensional PCR
Kualitatif PCR yang membutuhkan instrument tambahan untuk
analisisnya

• Merupakan standar PCR yang menyediakan hasil kualitatif

dan masih memerlukan intrumen tambahan dalam
analisa/visualisasi hasilnya
• Hasil akhirnya berupa visualisasi pita-pita DNA
• Membutuhkan instrument elektroforesis agar (Gel
electrophoresis) dan dokumentasi agar (Gel documentation)
untuk visualisasinya
• Pewarnaan DNA dilakukan setelah proses PCR selesai dan
biasanya menggunakan pewarna Etidium Bromida (EtBr)
Illustrasi Konvensional PCR
 Elektroforesis Agar
Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukurannya

• Di akhir proses PCR terdapat beberapa kemungkinan fragmen DNA

(DNA target, Amplikon, Amplikon tidak spesifik, Primer Dimer, dsb)
yang ukurannya beragam. Fragmen-fragmen ini akan
diseparasi/dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan bantuan
elektroforesis agar
• Migrasi DNA pada agar dapat terjadi dikarenakan DNA memiliki
muatan negatif dikarenakan gugus fosfatnya
• Marker DNA digunakan untuk memudahkan analisis
• DNA yang telah diseparasi kemudian diwarnai dan divisualisasikan
• Selain untuk DNA, elektroforesis agar juga dapat digunakan untuk
separasi RNA dan protein
 Ilustrasi Elektroforesis Agar

Jenis agar yang biasa digunakan adalah Agarosa

Jenis buffer yang biasa digunakan:

• Tris/Acetate/EDTA (Buffer TAE)
• Tris Borate/EDTA (Buffer TBE)
Alir Kerja Elektroforesis Agar
 Dokumentasi Agar
Visualisasi dan dokumentasi fragmen DNA untuk
analisis

• Fragmen DNA yang telah diseparasi kemudian

diwarnai dan divisualisasi untuk analisa lebih lanjut
• Proses dokumentasi biasanya dilakukan untuk
melakukan report hasil PCR dan analisa lanjutan
• Dokumentasi biasanya dilakukan dengan 2 bentuk,
dokumentasi di kondisi terpapar sinar UV ataupun
dengan cahaya lampu biasa
 Etidium Bromida (EtBr)
Pewarnaan DNA dengan penyisipan ke dalamnya
(intercalating agent)

• Pewarnaan menggunakan EtBr merupakan zat warna

yang bersifat intercalating agents
• Pewarnaan DNA dilakukan dikarenakan DNA tidak
memiliki warna, sehingga perlu diwarnai untuk
memudahkan proses analisis
• Pewarnaan menggunakan EtBr merupakan pewarna
fluoresensi yang dapat berpendar di bawah sinar UV
Etidium Bromida (EtBr)
Ilustrasi Dokumentasi Agar
Animasi Elektroforesis Agar

https://youtu.be/saJIWFUG
Ebw
 Hasil dari Reaksi Konvensional
PCR

Pita DNA Hasil dari Analisa Konvensional PCR