POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Laboratorium Genetika Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia 2011

DETEKSI MATERI GENETIK

Isolasi DNA

PCR

Elektroforesis

Sekuensing

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pertama kali ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1983. PCR merupakan teknik biologi molekuler yang berguna untuk memperbanyak (amplifikasi) sekuen DNA spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan kopi.

Prinsip Kerja PCR

Memperbanyak kopian DNA spesifik dari primer inisiator oleh enzim DNA polymerase dengan cara menghubungkan dNTP-dNTP dalam suatu reaksi termal.

Tujuh Komponen Reaksi PCR

No. Komponen PCR Keterangan

1.

DNA template

cetakan yang akan diperbanyak sekuens spesifiknya.

menjaga kestabilan pH dalam reaksi PCR mengkatalisis reaksi dengan berperan sebagai kofaktor enzim

2. 3.

PCR buffer Kation divalen

4.

Nuclease free water

berfungsi sebagai pelarut

Tujuh Komponen Reaksi PCR

No.
5.

Komponen PCR
dNTP

Keterangan
membentuk basa komplementer pada hasil cetakan DNA Terdiri atas 4 macam: o deoksiadenosin trifosfat (dATP) o deoksitimidin trifosfat (dTTP) o deoksitidin trifosfat (dCTP) o deoksiguanosin trifosfat (dGTP)

6.

Enzim DNA polymerase

menghasilkan produk pemanjangan cetakan DNA dengan menghubungkan dNTP-dNTP Taq DNA polymerase bakteri Thermus aquaticus (hidup di daerah panas sehingga mempunyai enzim yang termostabil

Tujuh Komponen Reaksi PCR

No.
7.

Komponen PCR
Primer

Keterangan
mengapit daerah spesifik pada DNA template dan menginisiasi replikasi produk cetakan didesain secara khusus untuk fragmen yang ingin diperbanyak Primer universal: primer yang dapat digunakan pada berbagai template yang bebeda karena adanya sekuens-sekuens yang saling homolog

Primer yang digunakan dalam satu set reaksi PCR: Primer Forward Primer Reverse

Primer yang digunakan dalam satu set reaksi PCR terdiri atas dua macam:

Kenapa tidak?

SIKLUS PCR
Denaturasi (94oC)
Reaksi enzimatikberhenti Ikatan hidrogen rusak
Untai ganda DNA terpisah untai tunggal

Annealing/Pelekatan (54oC)
Primer melekat pada situs yang tepat DNA polymerase melekat pada untai DNA

Setelah beberapa basa terbentuk, ikatan hidrogen antara primer dan template akan menjadi sangat kuat sehingga keduanya tidak terpisah selama tahap selanjutnya

Polimerisasi/Elongasi (72oC)
DNA polymerase melakukan pemanjangan primer dari arah 5 ke 3 dengan menghubungkan dNTP-dNTP.

Kondisi Siklus PCR

Dirancang dan dioptimasi secara khusus

Suhu dan waktu setiap tahap dalam siklus reaksi PCR dapat dipengaruhi oleh:
Panjang fragmen yang hendak diperbanyak Panjang sekuen primer Suhu optimal enzim Jumlah/volume template Kandungan basa pada template dan primer

Penentuan suhu annealing primer

Keberhasilan pelekatan antara primer dan template ditentukan oleh melting temperature (Tm). Perhitungan Tm(oC) metode Wallace:
Tm = 2(A+T)+ 4(G+C)

Suhu annealing yang optimal berkisar 5oC dari suhu Tm.

Kelebihan dan Kekurangan PCR

Kelebihan
Reaksi sangat spesifik dan akurat Mudah dilakukan secara otomatis Waktu relatif cepat

Kekurangan

Biaya relatif mahal Rentan terhadap kontaminasi Tidak dapat mengekspresikan mutasi

Aplikasi PCR & Deteksi Materi Genetik

Deteksi penyakit akibat infeksi bakteri atau virus Paternity testing Studi forensik (DNA fingerprinting) Diagnosis penyakit genetik Analisis Filogenetik Studi Paleontologi Pengklonaan & Terapi gen Mutagenesis artifisial Proyek pemetaan genom

Alat

Tips Tabung PCR 0,2 ml Thermal cycler Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600

Mikropipet

Thermal Cycler
Merupakan mesin yang dapat diprogram untuk menaikkan dan menurunkan suhu sesuai dengan urutan dan waktu yang diinginkan.

Reaction mixture (1 x reaksi)

Bahan Volume sampel isolasi darah
2,5 l 4 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,04 l

Volume sampel isolasi tanaman

1,5 l 0,9 l 0,3 l 0,75 l 0,75 l 0,12 l

10XPCR buffer 25 mM MgCl2 10 mM dNTP 20 M primer forward 20 M primer reverse Taq DNA Polymerase (5 U/l)

ddH20 steril
DNA template TOTAL

11,96 l
5 l 25 l

9,68 l
5 l 20 l

Primer
Sampel Isolasi tanaman:
Primer Par1 OPG 16 Primer Par2 OPG 16

Sampel Isolasi darah:

Primer Fy3F1 (forward), Tm = 64,5 C Primer Fy3R1 (reverse), Tm = 62 C

Kondisi Siklus Reaksi

Hasil Isolasi Tanaman

95oC
3

94oC 1 72oC 72oC 5

36oC
1

15oC 40 siklus

Kondisi Siklus Reaksi

Hasil Isolasi Darah

94oC
3

94oC 30 72oC 72oC 5

62oC
30

35

4oC 40 siklus

Cara Kerja
Reaction mix dimasukkan ke dalam tabung PCR

1l DNA template dimasukkan ke dalam tabung PCR

Tabung PCR dimasukkan ke dalam thermal cycler

Program PCR dijalankan

Suhu, waktu setiap proses PCR, dan jumlah siklus diatur pada mesin PCR

SELAMAT BEKERJA DAN TERIMA KASIH