PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

KELOMPOK 7
Agung Gilang Rezeki 1704010052
Ita Rosita 1704010056
Sopia Alawiah 1704010057
Hilda Nurosifah 1704010065
Farmasi B 2017
DEFINISI
PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary B Mullis (1985),Nobel (1994).
Polymerase (Enzim yang digunakan dalam PCR)
Chain (Produk dari reaksi pertama menjadi substrat dari reaksi
seanjutnya,dst)
PCR suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.

PCR merupakan suatu teknik yang digunakan untuk mengaplikasi

sejumlah kopi region spesifik dari DNA. Menggunakan suatu enzim yang
dinamakan DNA Polymerase yang akan mengamplifikasi fraksi genom
dalam rangka menghasilkan replikasi DNA yang merupakan salinan
seluruh genom secara tepat dan cukup akurat untuk diperiksa.
TUJUAN & MANFAAT
Tujuan PCR
untuk mempercepat isolaso DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan
pustaka genom.

Manfaat
Kary B mulis yang telah menemukan dan mnegaplikasi PCR pada tahun
1984. saat ini sudah digunakan secara luas untuk berbaga macam
kebutuhan, diantaranya :
• Isolasi gen
• Forensik
• Diagnosa penyakit
KEGUNAAN
Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:
1. Amplifikasi urutan nukleotida.
2. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi.
3. Bidang kedokteran forensik.
4. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan
“fingerprint”.
FUNGSI & PRINSIP KERJA PCR
Fungsi
Untuk membentuk cetakan DNA secara berulang kali dengan menggunakan
prosedur dan waktu yang tertentu. PCR menggunakan teknik amplifikasi
(perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara in vitro
dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan
primer oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan
diamplifikasi. Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu: Denaturasi, Annealing,
Polimerisasi.

Prinsip Kerja
Perbanyakan DNA diawali dengan pengudaran utas DNA ganda menjadi utas
tunggal (denaturasi), penempelan primer forard hingga primer reserve utas
tunggal (annealing), dan sintesis utas DNA baru (Muladno 2002)
KOMPONEN – KOMPONEN PCR
 DNA template  yang digunakan sebagai cetakan untuk PCR yang bebas
nukleus, eksoprotease dan DNA dinding protein.
 DNA Polymerase
- Taq DNA Polimerase (Thermus aquaticus)
- Tth DNA polimerase (thermofilik Thermus thermophilus)
- Pwo DNA polymerase (Pyrococcus woesei)
- Pfu  dan Tli DNA polymerase (Pyrococcus furiosis dan Thermococcus litoralis)
 Oligonukleotida Primer  berfungsi untuk mengawali reaksi replikasi DNA pada
reaksi PCR.
 dNTP (Deoksiribonukleotida trifosfat)  merupakan blok pembangunan molekul
asam nuleat yang terdiri dari :
o dATP (deoxydenosine tryphosphatase)
o dTTP (deoxythymidine triphophatase)
o dCTP (deoxycytosine triphosphate)
o dGTP (deoxyguanosine triphosphate)
 Buffer  reaksi PCR biasanya mengandung Mg2+, kation monovalen dan
kosolven yang membantu mengstabilisasi enzim polimerase DNA, mempengaruhi
ALAT YANG DIGUNAKAN DALAM PCR
Peralatan khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain (Mahmudin,2010) :
o Mighty-small II SE-250 vertical gel eletrophoresis unit (Hoefer).

o Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler.

o Sterile Thin-wall 0,5 ml

o Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific).
 LANJUTAN…
Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in
vitro antara lain (Mahmudin,2010) :
1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik
2. Buffer PCR 5X (250nM KCl, 50nM tris HCl pH 8,3, 7,5nM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP sebesar 2,5mM dengan volume 10mM
4. Taq DNA polymerase
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
7. N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektoforesis)
8. Amonium persulfat
9. TEMED (N, N, N’N Tetramethylethylenediamine
TAHAPAN DALAM PCR
o Denaturasi
Dilakukan pada suhu 90-95°C, sehingga terjadi pemisahan utas
ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan
(template) tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA
polymerase.
o Annaeling
Kemudian, suhu diturunkan untuk penempelan primer oligonukleotida
pada sekuens yang komplementer pada molekul DNA cetakan.
Tahap ini disebut annealing. Suhu campuran diturunkan sesuai
melting temperatur (Tm) dari primer oligonukleotida.
o Ekstensi
Suhunya optimum untuk kerja enzim Taq DNA polymerase
mengkatalis reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang
sesuai dengan utas DNA komplemen yang berada disebelahnya rupa
sehingga dihasilkan amplifikasi sekuens target DNA yang efisien.
LANJUTAN…
CARA KERJA PCR
o Siapkan larutan Mix Solution
o Penyimpanan larutan-larutan Primer, dNTP’s, Buffer, Taq dan
larutan DNA ada yang harus disimpan pada temperature–200C saat
bekerja larutan-larutan ini harus diletakan dalam wadah berisi es
o Selalu gunakan tabung dan tipis yang telah disterilisasi, hindari risiko kontaminasi
seminimal mungkin
o Siapkan 12 tabung PCR (steril) pipetkan sebanyak 22,5μl Mix Solution masukkan
kemasing-masing tabung PCR
o Tambahkan 2,5μl larutan DNA sampel kedalam tabung kemudian vortex
o Tambahkan Mineral Oil sebanyak 50μl
o Tutup rapat tabung dan susun didalam blok alat Thermal Cycler
KELEBIHAN DAN KELEMAHAN PCR
o Kelebihan
o Memiliki spesifisitas tinggi
o Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
o Dapat membedakan varian mikroorganisme
o Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
o Mudah di set up   
o Kelemahan
o Sangat mudah terkontaminasi
o Biaya peralatan dan reagen mahal
o Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi
(misalnya infeksi pasif atau laten)
o Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk
melakukannya.
KESIMPULAN
o PCR merupakan suatu metode enzimatis untuk amplifikasi
DNA dengan cara in vitro
o Komponen utama PCR yaitu :DNA template, oligonukleotida
primer, enzim Taq DNA Polymerase, dNTP, larutan buffer.
o PCR terdiri dari 3 tahap utama yaitu: denaturasi, annealing
(penempelan primer) dan pemanjangan primer (extention).
o PCR yang sudah digunakan secara luas yaitu : isolasi gen,
DNA sequencing, identifikasi forensik dan diagnosa penyakit.