1

ANALISAHASILTRANSFORMASI DENGANMENGGUNAKANPCRKOLONIDANRESTRIKSI
PENDAHULUAN PolimeraseChainReaction(PCR) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler.PanjangtargetDNAberkisarantarapuluhansampairibuannukleotidayangposisinya diapitsepasangprimer.Primeryangberadasebelumtargetdisebutprimerforwarddanprimeryang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalamteknikPCR,diperlukanjugadNTPsyangmencakupdATP(nukleotidaberbasaAdenine),dCTP (nukleotidaberbasaCytosine)dandTTP(nukleotidaberbasaThymine)(Muladno,2002). PCRadalahsuatumetodeyangmenggunakankomponenkomponenreplikasiDNAuntukmereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan diamplifikasi. Primer menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari setiap strand dari double strand DNA molekul.PrimermenetapkanlimitdaerahyangakandiamplifikasidanDNApolymerasemereplikasi DNA diantara primer menggunakan empat deoksiribonukelotida (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) yang disediakan di dalam tabung reaksi dengan penambahan dNTPs. Di dalam sebuah siklus amplifikasi (=replikasi),DNAtemplatedidenaturasipadatemperaturetinggi,annealingprimerdilakukandengan menurunkan temperature dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan siklusdenaturasi,annealingprimer,dansintesisDNAmenghasilkanDNAmelaluiamplifikasisecara eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya digunakan di dalam thermalcycler, yaitu sebuahinstrumenyangsecaraotomatismengontroltemperaturedanwaktu.SuatuDNApolymerase khusus Taq polymerase, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di hot spring yang stabil pada temperature tinggi digunakan untuk mendenaturasi DNA template. Produk yang dihasilkan dari PCR dianalisa menggunakan elektroforesis gel agarose (Barnum,2005). BeberapakomponenyangpentingyangdibutuhkandalamreaksiPCRadalah:DNAtarget, primer, enzim Taq DNA polymerase, deoksinukleoside triphosphat dan larutan penyangga (buffer). MolekulDNAyangtargetnyaakandilipatgandakanjumlahnyadapatberupauntaitunggalatauuntai

2 ganda.Jumlahyangdigunakandalam prosesPCRtidakterlaluberpengaruhterhadapkualitashasil PCR,tetapijumlahdalamukuranpikogramsudahcukup.DAlammenentukanjumlahini,dapatpula dilakukan ujicoba dengan berbagai ukuran, misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga diperoleh kualitas PCR yang paling baik. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genom, sebaiknya DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim Sal I atau Not I yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genom. Primer atau oligonukleotida sebaiknya berukuranpalingpendek16basadanbiasanyaberkisarantara1824basa(Muladno,2002). Restriksi Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik.Sepertidiketahui,didalamBioteknologiterdapatduakategorienzimyangberperandalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan(dimanaduamolekulDNAdikombinasikan).DNAspesifikataugendiisolasi/diambildari DNA dengan memotong sugarphosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpaadanyaduajenisenzim,yaitu:enzimrestriksiendonukleaseyangberperansebagaigunting untuk memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar phosphat backbone DNA pada kedua utasnya. Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di dalammolekulDNA.Urutanyangspesifiktersebutpadaumumnyaterdiridari46pasangbasadan bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5 3 (Suharsono dan Widyastuti,2006). Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempattempat tertentudariurutanbasatersebut.EnzimrestriksimemotongDNAdoublestrandsdenganmemutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotidayangberbatasandengannya.Terdapatduatipehasilpemotongan,ujungrata (bluntend)danujungkohesif(stickyend).Ujungrata(bluntend)dihasilkanketikaduautasmolekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan.Ujungkohesif(stickyend)dihasilkanketikasetiapmolekulDNAdipotongpadaposisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa

3 pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif (Suharsono dan Widyastuti, 2006). ALATDANBAHAN Alat MesinPCR,Elektroforesis,Geldock Bahan Bakteri rekombinan hasil transformasi, Xgal, IPTG, primer forward, primer reverse dan enzimrestriksi METODE PolimeraseChainReaction SatukoloniputihyangtumbuhpadamediaLA,ampicilin,Xgal,IPTGdisuspensikankedalam tabung PCR yang telah berisi 8,5 l ddH2O kemudian di kocok. Tusuk gigi yang digunakan untuk memindahkanbakterikedalamtabungPCRkemudiandigoreskankembalipadamediabarusebagai stok.TabungPCRkemudiandiisidengancampuranPCRyangterdiridari1uldNTPrimer2M,0,5ul PrimerF10M,0,5ulPrimerR10M,0,4ulDMSO,1ul10xBufferTag,0,1ulTagDNApolsehingga total larutan yang diperoleh adalah 3,5 ul. Lakukan PCR dengan kondisi Pra PCR pada suhu 94oC selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 menit, annealing (penempelan) pada suhu 56oCselama30detik,pemanjangan72oCselama1,5menit,pascaPCR72oCselama5menit,semua proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus selama 2,5 jam. Hasil PCR kemudian di elektroforesis selama30menit. Restriksi Restriksidilakukandenganmenggunakan2ulplasmid(50g/ml),2ul10xbufferEcoRI,0,5 ulenzimEcoRI10U/uldan15,5ulddH2O,sehinggalarutansampelyangdiperolehadalah20uldi dalammasingmasingtabung.Kemudian,larutandiinkubasipadasuhu37oCselama2jam,kemudian dielektroforesisselama30menit.

HASILDANPEMBAHASAN Hasil Dari hasil elektroforesis dapat diperoleh foto gel agarose seperti pada gambar 1. Dari

penampakan yang terlihat pada foto diketahui bahwa hasil restriksi dengan menggunakan enzim

4 restriksi Eco RI terbentuk dua pita pada gel, sedangkan dengan menggunakan PCR koloni tidak terbentukpita.

Pembahasan Enzim restriksi Eco RI berfungsi untuk memotong plasmid pada dua titik sehingga plasmid terbagi menjadi dua bagian DNA. Dua bagian tersebut adalah vektor yang berada paling dekat dengansumuryangpasanganbasanyalebihbesardangeninsertyangjauhdarisumurdanpasangan basanyalebihkecil.Makadenganterbentuknyaduapitapadagelelektroforesisdapatdisimpulkan bahwaprosesrekombinasiberhasilkarenabakteriyangditransformasikan(dalamkasusinihampir semuabakteriberwarnaputihyangdiambil)mengandunggeninsert(Gdarikedelai)didalamnya sehinggabakteristokdapatdigunakansebagaibakterirekombinanyangdapatmengekspresikangen Gdarikedelai. TidakterbentuknyapitapadagelagarosehasilelektroforesiskoloniPCRmenandakanbahwa Gambar1.Gelagarosehasilelektroforesispadapemeriksaangeninsertdenganmenggunakan metodePCRkolonidanenzimrestriksi.

kolonibakteriyangdiambiltidakmengandunggeninsert.Padahal,padaprinsipnya,tujuandariPCR koloni adalah untuk mengamplifikasi gen insert yang berada pada plasmid dari bakteri dengan menggunakanprimeryangspesifikdarigenGdarikedelaisehinggageninsertteramplifikasidan ketikadilakukanelektroforesisakanmembentukpitapadagelagarose.Pitayangterbentukhanya

5 satukarenaamplifikasihanyadilakukanpadageninsert.Tidakterbentuknyapitadapatdiakibatkan primer yang digunakan tidak menempel pada Ori sehingga DNA polymerase tidak melakukan replikasi sehingga gen insert tidak teramplifikasi mungkin primer yang digunakan sudah tidak lagi berfungsisebagaimanamestinyakarenapengaruhlamanyapenyimpanan. KESIMPULAN DalamkondisiyangbertentanganmakadapatdisimpulkanbahwaprosesDNArekombinasi

berhasil apabila dilihat dari hasil elektroforesis dengan menggunakan metode restriksi dimana denganmenggunakankoloniPCR,prosesDNArekombinasitidakberhasil. DAFTARPUSTAKA

Barnum,SusanR.2005.BiotechnologyanIntroduction,2ndedition.ThomsonBrooks/Cole, USA.323pages. Muladno.2002.SeputarTeknologiRekayasaGenetika.PustakaWirausahaMudadanUSESE Foundation,Bogor.123halaman. Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan PemberdayaanMasyarakatIPBdenganDIKTIDIKNAS,Bogor.