Definisi v

Tujuan v
Tujuan penggunaan v
jenis PCR v (kurang kelebihan dan keurangan)
komponen beserta fungsi v
master mix v
tahapan pcr v
rumus pcr
kekurangan dan kelebihan pcr v
persamaan dan perbedaan pcr dgn replikasi dna tubuh v

PCR (Plymerase Chain Reaction) adalah salah satu cara yang murah dan efisien untuk
menyalin atau mengamplifikasi bagian kecil dari DNA atau RNA yang akan dianalisis. Tujuan dari
metode ini adalah keperluan diagnosis dan mengontrol penyakit dengan menggunakan sampel yang
minim seperti jaringan atau darah. PCR terjadi secara in vitro atau d luar tubuh (di laboratorium).
Meskipun begitu, prinsip kerja PCR berdasarkan proses natural dari replikasi DNA. Reaksi
berlangsung ketika sampel DNA dan DNA polimerase, nukleotida, primer, dan reagan lainnya
dalam satu tabung sampel. Reagan-reagannya memfasilitasi reaksi untuk mengkopi DNA. Contoh
dari penggunaan PCR antara lain:
konseling genetik sebelum mempunyai anak
fingerprint genetik dari sampel darah, semen, atau rambut
mendeteksi dan diagnosis penyakit infeksius
mendeteksi infeksi pada suatu lingkungan
menentukan terapi individual
analisis ekspresi gen suatu organisme
mengidentifikasi fosil manusia dan hewan
Dalam proses PCR, perlu dibuat suatu campuran yang mempunyai komposisi sebagai
berikut:
Komponen Jumlah Fungsi
1. DNA template 0,5 mikroliter Sampel DNA yang mengandung urutan DNA target.
2. Buffer 10x 2,5 mikroliter Menstabilkan pH gel.
3. Primer (p1 & p2) @0,5 mikroliter DNA rantai tunggal pendek yang membatasi DNA
20 mikroliter yang akan diamplifikasi dan memulai amplifikasi.
4. Aquabidest 18,8 mikroliter Sebagai kontrol negatf dengan cara menyerang ion.
5. dNTP 0,5 mikroliter Membuat blok-blok untuk rantai DNA baru.
6. MgCl2 1,5 mikroliter Mg2+ berperan sebagai kofaktor untuk Taq polimerase
sehingga mempengaruhi aktifitas enzim.
7. Taq polimerase 0,2 mikroliter Enzim yang men-sintesis rantai DNA baru.
Semua bahan pada tabel adalah komposisi master mix. Master mix dibuat untuk
menyamaratakan semua volume komposisi yang sama pada setiap tabung PCR (tabung sampel,
tabung kontrol negatif, tabung kontrol positif). Pencampuran komposisi ke dalam master mix
diurutkan berdasarkan volume yang paling banyak, harga komponen yang paling murah, serta risiko
yang kecil apabila tumpah atau tercecer. Pengurutan bertujuan untuk menkan kerugian apabila
terjadi pengulangan membuat master mix. Pembuatan master mix harus dilakukan di atas wadah
yang di dalamnya es.
Jenis-jenis PCR antara lain:
1. RT- PCR: PCR yang melibatkan RNA, dimana RNA diubah menjadi CDNA menggunakan
reverse transcriptase dan menggunakan hasil cDNA sebagai templatenya. Contoh penggunaan RT-
PCR adalah untuk mendeteksi ekspresi TNF-alfa dan MCP-1 mRNA pada anak-anak penderita
penyakit kawasaki di Cina.
2. Quantitative PCR: menghitung DNA spesifik (jumlah awal DNA, cDNA atau RNA). Disebut
juga dengan real time PCR. Contoh penggunaan jenis ini ada pada pendeteksian CMV
(cytomegalovirus) pada pasien terinfeksi HBV.
Tahap-tahap dalam PCR antara lain:
1. Tahap denaturasi
Pada tahap ini, tabung yang berisi campuran PCR dipanaskan pada 94-95oC.
Temperatur tinggi menyebabkan ikatan hidrogen antara basa pada dua untai DNA template
rusak dan berpisah.
Hasilnya adalah dua untai tunggal DNA, yang berperan sebagai DNA template.
Penting untuk mencapai temperatur tersebut agar DNA benar-benar terpisah.
Tahap ini memakan waktu 15-30 detik.
2. Tahap penempelan
Pada tahap ini, reaksi didinginkan sampai 50-65oC. Hal ini memungkinkan primer
menempel pada lokasi spesifik di untai tunggal DNA template.
Primer adalah RNA atau DNA untai tunggal yang punya panjang basa 20-30.
Dua DNA untai tunggal saling mengisi dan bergerak pada arah yang berlawanan, hasilnya
adalah 2 primer (primer forward dan primer reverse).
Biasanya memakan waktu 20-30 detik.
3. Tahap pemanjangan
Pada tahap final ini, temperatur meningkat hingga 72 oC untuk membuat DNA baru oleh Taq
polimerase (suhu optimum).
Taq polimerase menempel pada primer lalu menambahkan basa DNA ke untai tunggal satu
per satu pada arah 5 ke 3.
Hasilnya adalah untai baru DNA dan DNA untai ganda.
Durasi tahap ini bergantung pada panjang urutan DNA yang diamplifikasi, namun biasanya
sekitar satu menit untuk mengkopi 1000 basa DNA (I Kb).
Semua tahapan di atas diluang 20-40 kaliuntuk memproduksi banyak cetakan DNA dengan urutan
yang diinginkan. Hasilnya adalah kopi DNA dalam jumlah banyak dengan urutan yang sama dalam
waktu singkat.
Dalam penggunaannya, PCR memiliki beberapa keuntungan yaitu:
Spesifisitas tinggi.
Sangat cepat, dapat memberi hasil yang sama pada hari yang sama.
Dapat membedakan varian mikroorganisme.
Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup.
Mudah di set up.
Selain keuntungan atau kelebihan, PCR juga memiliki kelemahan yakni:
Sangat mudah terkontaminasi.
Biaya alat dan perawatan mahal.
Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misal
infeksi pasif atau laten).
Membutuhkan kemahiran khusus karena teknik prosedur yang kompleks dan bertahap.
Apabila dibandingkan dengan replikasi DNA dalam tubuh, PCR memiliki kesamaan yaitu
mengkopi DNA, bergerak dari 5 ke 3 menggunakan enzim polimerase, dan membutuhkan primer.
Sedangkan perbedaannya adalah:
Pada tubuh, suhu yang digunakan konstan yaitu 37oC.
Di dalam tubuh, 3 tahap yang ada pada PCR terjadi secara spesifik.
PCR hanya menggunakan enzim Taq polimerase, sedangkan replikasi DNA dalam tubuh
menggunakan banyak enzim.