PCR: Teknik dan Aplikasi

Oleh
Shabarni Gaffar
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
“Perbanyakan potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida”

Segmen/fragmen DNA target

 Komponen PCR:

• DNA templat (DNA untai ganda)

• Sepasang primer
• Campuran dNTP (dATP, dGTP, dTTP dan dCTP)
• Enzim DNA polimerase termostabil
• Buffer
• Mg+2

3’ 5’
5’ 3’ DNA templat
primer 3’ 5’

5’ 3’

Primer: oligonukleotida untai pendek yang urutannya komplemen

dengan salah satu rantai, dan arahnya berlawanan dengan
primer pasangannya
ALAT PCR
 Tahap Reaksi
Setelah siklus pertama selesai,
DNA untai ganda hasil PCR
didenaturasi dan dimulai
Templat DNA siklus amplifikasi berikutnya
untai ganda
mengalami Denaturasi
disosiasi Siklus berikutnya
dengan
pemanasan
pada 95oC

Penempelan Primer

Perpanjangan
/ polimerisasi

Temperatur diturunkan ke Polimerisasi pada suhu optimum enzim (68-

suhu optimum hibridisasi 74oC), dimulai dari ujung 3’ primer. Waktu
sehingga primer polimerisasi bervariasi tergantung panjang
menempel ke urutan produk. Aktivitas enzim ± 1Kb per min.
komplemen
 Siklus PCR

siklus 1 siklus 2 siklus 3

T 94 oC 94 oC 94 oC
(suhu) 72 oC 72 oC 72 oC

55 oC 55 oC 55 oC

Waktu (detik)

Tahapan PCR:
1. Denaturasi DNA (92-95oC)
2. Penempelan oligonukleotida primer (45-60oC) 25-40 siklus
3. Perpanjangan primer (68-72oC)
Waktu  panjang fragmen
Perbanyakan DNA : secara
eksponensial

16

220
 Profil Reaksi

log[DNA]

Cycle number
Hasil akhir tergantung:
Komposisi dan konsentrasi templat, templat ‘GC rich’ lebih sulit di PCR karena
terbentuknya struktur sekunder pada temperatur annealing shg membutuhkan
prosedur tambahan untuk mempertahankan struktur terbuka. Misalnya
penambahan DMSO.
 Templat
• Hasil isolasi DNA (genom, plasmid, mtDNA)
• Hasil lisis
• Produk PCR (untuk re-PCR atau dengan pengenceran)
• RNA (untuk RT-PCR dan atau real time PCR)

Perhatikan keberadaan inhibitor

 Tipe of Templat
Genomic DNA may be extracted from
individuals (e.g. patient samples,
Genomic DNA bacteria, viruses, plants etc.), cell lines,
somatic cell hybrids, radiation hybrids.

Cloned DNA can be extracted from large

insert genomic clones such as YACs,
Cloned DNA BACs, PACs, cosmid, phage, or, small
insert clones such as plasmids.

RNA templates are usually converted to

RNA/ cDNA cDNA templates prior to PCR. Such
templates can be used in real-time PCR
experiments to quantitate relative
expression of mRNA compared with
control transcripts, or in reverse-
transcription studies coupled to gene
specific PCR for investigation of mRNA
structure and coding potential.
 Kualitas templat

• Fragmentasi
• Sumber
– DNA dari plasma, darah, jaringan,
tumbuhan, tanah, makanan, forensik dll

Untuk target PCR yang pendek, DNA yang mengalami fragmentasi parsial masih
bisa digunakan. Karena kemungkinan masih ada sejumlah mulekul DNA yang
masih utuh antara dua primer. Kemampuan ini yang menyebabkan PCR cocok
digunakan untuk analisis forensik atau analisis mutasi gen dari spesimen
patologi.
 Konsentrasi templat

• Mempengaruhi jumlah kopi

PCR cukup sensitif untuk amplifikasi dari sejumlah kecil DNA.

Normalnya untuk 50 ul reaksi diperlukan 50 ng DNA genom,
atau ~1.5 x 104 kopi DNA target dan akan dapat dideteksi
dengan agaros setelah 30 siklus. Protokol modifikasi melalui
pre-amplifikasi dengan random primer dapat digunakan,
digabung dengan PCR target kedua.
 Karateristik templat
Kandungan GC, urutan yang komplemen,
• Kandungan G+C dapat mengurangi efisiensi PCR. Jika templat
dapat membentuk struktur sekunder atau
• Halangan struktur tersier pada suhu annealing dan extension,
maka enzim tidak bisa bekerja. Masalah ini
dapat diatasi dengan penambahan reagen
yang dapat menghambat pembentukan folding
DNA untai tunggal
 Oligonukleotida primer

• 20-30 nt
• Kandungan G+C sekitar 40- 60%
• Hindari adanya polipurin dan polipirimidin
• Hindari adanya struktur sekunder dan komplentari antara primer serta primer
dimer
• Melting temperatur: suhu dimana setengah dari DNA untai ganda
terdenaturasi
• Tm primer : Tm >55 oC
[Tm = (jumlah A+T) x 2 oC + (jumlah C+G) x 4 oC ] (untuk panjang primer ±30
nt
Jika panjang primer >30 nt, perhitungannnya tidak sederhana.
Software: DNAstar, Perlprimer, oligoexplorer dan FastPCR.
• Stok primer harus diencerkan menjadi 20 μM, di-aliquot, dan disimpan di –20
oC.

• Konsentrasi akhir 0,4-1 mM

 Penempelan Primer

• Suhu dan lamanya waktu penempelan primer bergantung

pada komposisi, panjang, dan konsentrasi primer.
• Temperatur penempelan yang biasa dipakai adalah 5 oC
dibawah Tm.
• Menaikkan suhu annealing akan menghindari annealing
primer yang kurang spesifik (mispriming) dan mereduksi
mis-extension dari nukleotida yang tidak diinginkan di ujung
3’ dari primer (mengurangi terbentuknya produk yang tidak
spesifik)
• Menurunkan suhu annealing akan memperbesar terjadinya
mispriming sehingga menghasilkan produk non-spesifik
Primer dimer

Primer dimer
 Mispriming

Annealing
dinaikkan
 Bagaimana mendisain primer?

• Manual
• Software (beli, gratisan, online)
– Fast PCR
– DNASTAR
– PearlPrimer
– Oligo explorer
– NCBI → primer design (online)
– dll
 Disain Primer
• Yang harus diperhatikan:
– Tm
• Komposisi primer dan panjang primer
– Kompatibilitas primer
• Homologi internal, primer dimer
– Homologi Primer dengan urutan lain pada genom
• Analisis BLAST

Struktur sekunder internal pada primer atau pembentukan dimer antara

primer dapat mengurangi konsentrasi primer dalam campuran reaksi
dan dapat berkompetisi dengan dupleks templat-primer.
 Enzim
• Awalnya PCR dilakukan menggunakan enzim
DNA polimerase I fragmen Klenow
– Problematic
Fragmen Klenow DNA polymerase I dari E. coli bukan enzim termostabil.
Reaksi PCR dilakukan pada suhu polimerisasi optimum 37oC, dan enzim
ditambahkan setiap setelah denaturasi. Volume reaksi akan berubah setiap siklus
PCR. Kesulitan lain adalah harus disediakan tiga water bath dengan suhu yang
berbeda sehingga resiko kontaminasi tinggi (tabung sering dibuka), dan
memerlukan waktu yang lama.
 Enzim
• Thermus aquaticus (Taq) DNA polimerase (termostabil)
• Fidelitas tinggi
• Konsentrasi enzim biasanya 0.01-0.02 unit/ml

Keuntungan penggunaan enzim termostabil:

1. Mengurangi kontaminasi
2. Pengembangan mesin dengan “dry block” untuk mengontrol temperatur
pada masing-masing siklus.
3. Penggunaan kombinasi enzim untuk meningkatkan fidelitas melalui
mekanisme proof-reading.
 Konsentrasi enzim

• Konsentrasi enzim yang disarankan berbeda untuk setiap

suplier.
• Bila konsentrasi enzim terlalu banyak, akan terdapat non
spesifik background, sementara kalau terlalu kecil, akan
menyebabkan produk yang tidak diinginkan tidak terjadi.
• Untuk mengoptimasi PCR, konsentrasi enzim yang disarankan
berkisar antara 0,5 sampai 5 unit/100 ml
• Konsentrasi yang disarankan untuk Taq DNA Polymerase
(Perkin-Elmer Cetus, Innis) adalah antara 1 dan 2.5 unit untuk
100 ml reaksi, kalau parameter yang lain sudah optimal.
 Buffer

• Garam: K/ Mg
– Biasanya hanya Mg yang dibutuhkan untuk aktivitas
enzim dan product yield
• free Mg for enzyme activity
• excess Mg causes in non-specific amplification
• Detergen
– essential for enzyme activity
• Modifiers
– DMSO untuk mengurangi struktur sekunder
– Analog dNTP
 Mg+2
• Konsentrasi Mg dapat dioptimasi.
• Taq DNA polymerase memerlukan magnesium untuk
berikatan dengan DNA templat, primer dan dNTP.
• Konsentrasi Mg dapat mempengaruhi primer annealing,
spesifisitas produk dan aktivitas enzim.
• Konsentrasi Mg pada PCR dapat divariasi antara 0,5 sampai
2,5 mM.
• Keberadaan EDTA atau chelator yang lain pada primer akan
mengganggu fungsi magnesium secara optimum.
• Meningkatkan kelarutan dNTP
• Meningkatkan Tm primer & DNA templat
• Meningkatkan sensitifitas / yield
 Deoksinukleotida Trifosfat (dNTP)

• Stok dNTP harus berada dalam keadaan netral pada

pH 7.
• Konsentrasi antara 20 sampai 200 mM dapat
memberikan hasil yang optimal.
• Keempat dNTP harus berada dalam jumlah yang
ekivalen untuk meminimalkan error yang terjadi.
 Produk

• Ukuran produk
– Pada umumnya enzim termostabil dapat
menghasilkan fragmen ± 3 Kb.
• Komposisi urutan DNA
– Kandungan G+C >> dapat menghalangi ekstensi

Sejumlah kit dengan enzim termostabil yang mempunyai

aktivitas proof reading, dan reagen yang didisain untuk
menghasilkan produk yang panjang sudah tersedia. Kit ini
dapat mengamplifikasi fragmen DNA ± 50Kb dari templat
yang kompleks.
 Program
• Denaturasi awal pada 94-95oC (3-5min)
• Denaturasi (15-60det)
– templat
• Annealling (30-60det) Final extension pada 72oC akan
menjamin bahwa semua produk
– Tm dupleks PCR mempunyai panjang yang
sama. Hold umumnya pada 4oC.
• Extension (dari 30det) Produk PCR kemudian disimpan
– Panjang produk (15 basa/det) dalam lemari es atau freezer
sebelum dianalisis.
– Templat
• Final Extension dan hold
 -
P
C Polimerisasi DNA
Template
BASA’ BASA’
BASA BASA
dNTP
3’
Primer 3’  C5’ OH
5’ C P 
P -

M2+ C M2+ 
P
A B -
D882
-
C
DNA polimerase C
D705
 Mekanisme PCR ( animasi )
Mg2+
5‘ 3‘ 3‘
5‘

5‘
DNA
3‘ 3‘ 5‘

94oC (Denaturasi)
5‘ 3‘

3‘ 5‘
5‘ 3‘
Mg2+

Mg2+ Mg2+

5‘ 3‘

3‘ 5‘

3‘ 5‘
3‘
5‘

65oC (Annealing) 3‘ 5‘

Mg2+ Mg2+

3‘
5‘
5‘ 3‘

3‘ 5‘
3‘ 5‘
Primer 5‘
3‘
Primer
5‘
Prod. 3‘ 5‘

5‘ 3‘
3‘ = (2n-2n)x 5‘

3‘ 5‘
3‘
5‘

72oC (extension) 3‘ 5‘
 Optimasi Suhu Annealing
5‘ 3‘

3‘ 5‘
Primer Primer 3‘ 5‘
5‘
Primer
Primer Tidak ada Produk
5‘

3‘ 5‘

Annealing >> Tm
3
5‘

5‘ 3‘ 3‘ 5

3‘
Annealing 3‘ 5‘ 5‘
Primer
Tm-5OC Primer 3‘ 5‘
5‘
3‘
5‘
3‘ 5‘
3‘ 5‘
3‘
5‘

Annealing << Tm 3‘ 5‘

5‘ 3‘

3‘ 5‘
5‘ 3‘
3‘
5‘
3‘ 5‘ 3‘ 5‘
3‘ 5‘ Produk
Primer Primer 5‘ 3‘ non spesifik
Primer Primer 3‘ 5‘
5‘ 5‘ 3‘
5‘

3‘ 5‘ 5‘
3‘
 Peranan ion Mg2+ - animasi -
2+ 2+ 2+
dNTP kelarutan besar 2+ 2+ 2+ 2+
2+
2+ 2+ 2+
2+
2+ 2+ 2+
2+

2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+
Mg2+
(mengikat ion Mg2+)
2+ 2+
2+ 2+ 2+
Mg2+2+ 2+
5 3 2+ 2+

2+ 2+ ‘ 5 3
‘ Mg2+
2+
3 5 2+ 2+
‘ ‘
2+ ‘2+ 2+
‘
2+
32+ 2+
2+ 2+ 5
2+
2+
2+ 2+
2+ 2+ ‘ 2+ 2+
+ ‘
2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+ 2
2+
2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+
2+ 2+
2+ 2+
2+
3
2+
‘
5 3 2+ 2+
2+ 2+2+
2+ 2+ 2+
2+ ‘ 2+ Mg2+‘ 2+2+ 2+
5
2+ 2+
2+ 3
2+ 5 2+
2+ 2+
2+ 2+ 2+ ‘ 2+
2+
2+ 2+
2+ 2+
2+ 2+
‘ 2+
2+
2+ ‘ 2+ 2+
3
2+
2+
2+
2+ 5
2+2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+
2+
2+ 2+ 2+ ‘ Mg2+ 2+ 2+ Mg2+‘
2+ 2+2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+
2+ 2+ 2+
2+
2+ 2+
2+ 2+
2+ 2+ 2+
2+
2+

dNTP kelarutan kecil (tanpa ion Mg2+)

 Analisis Hasil PCR:
Elektroforesis gel agarosa

• Pergerakan DNA dalam

medan listrik:
Elektroforesis
– Ke kutub positif
– Kecepatan tergantung:
1.5
• Ukuran DNA

log panjang DNA

• Konformasi DNA 1
• Konsentrasi agarosa
• Pewarnaan dengan etidium 0.5
bromida 0
• Ukuran DNA yang dapat 0 10 20
-0.5
dipisahkan:
Jarak migrasi
– agarosa 0,6 %: 1 - 20 kb
– agarosa 0,9 %: 0,5 - 7 kb
– agarosa 1,5 %: 0,2 - 3 kb
– agarosa 2,0 %: 0,1 - 2 kb
Elektroforesis Agarose
 Contoh Foto Hasil Elektroforesis Agarose

1400 pbs

PCR 500 pbs

product
 Kontrol ekspreimen

• Kontrol positif (sampel yang sudah diketahui

memberikan hasil +)
• Kontrol negatif (semua pereaksi, untuk
menguji ada/tidaknya kontaminasi)
 Troubleshooting guide

• Bila tidak ada produk PCR !!!

 Campuran reaksi tidak sesuai (selalu gunakan kontrol +)
 Siklus tidak cukup
 Temperatur annealing terlalu tinggi
 Jumlah templat tidak memadai
 Suhu denaturasi tidak optimum dan kurang lama
 Waktu ekstensi kurang (terutama untuk long-distance PCR)
 Cek konsentrasi komponen reaksi (Mg2+, dNTP, primer)
 Cek disain primer (kandungan GC, panjang, Tm,
komplementari)
 Troubleshooting guide

• Banyak produk tidak spesifik

 Terlalu banyak siklus
 Annealing temperatur terlalu rendah

• Produk PCR smear

 Terlalu banyak siklus
 Suhu denaturasi terlalu rendah
 Waktu ekstensi terlalu panjang
 Templat mengalami degradasi
 Terlalu banyak enzim, Mg2+ atau templat
 Pengembangan metoda PCR

• PCR-SSCP
• Multipleks PCR
• PCR-RFLP
• RT-PCR
• Real time PCR
• PCR alel spesifik (PASA)
 PCR-SSCP
• Produk PCR digunakan untuk analisis
SSCP (Single Strand Conformation
Polimorphism)
• Untuk analisis awal adanya SNP (Single
Nucleotide Polimorphism)
• DNA untai tunggal yang berbeda satu
basa akan membentuk konformasi yang
Pita
berbeda dengan mulekul natif.
tambahan
• Mutasi akan menghasilkan struktur
tersier DNA yang berbeda, sehingga
mobilitasnya juga berbeda.
• Adanya mutasi dapat terdeteksi dengan
munculnya pita DNA baru pada gel Elektroforesis gel poliakrilamid
setelah visualisasi. kondisi tidak terdenaturasi
Deteksi: radioaktif, silfer staining,
• Hasil dari PCR-SSCP selanjutnya dapat
atau floresense
dikonfirmasi dengan DNA sekuensing.
 Multipleks PCR
• Primer: lebih dari satu pasang, menghasilkan
lebih dari satu amplikon , ukuran bervariasi.
• Mempersingkat waktu PCR, mempercepat
perolehan informasi.
• Suhu annealing primer harus dioptimasi supaya
dapat bekerja pada satu kondisi yang sama.
• Ukuran amplikon harus cukup berbeda.
• Aplikasi: deteksi patogen, SNP genotyping,
analisis mutasi, analisis delesi gen, forensik dan
lain-lain
 Contoh hasil multipleks PCR

Multiplex amplification of 12 targets (81~1,086 bp) was

carried out for 35 cycles using EzWayTM Multiplex PCR
MasterMix.
Contoh hasil multipleks PCR

Multiplex PCR of 19 targets (99–955 bp)

was carried out for 35 cycles using standard
conditions (Std) for the QIAGEN Multiplex
PCR Kit (QIAGEN) without optimization, or
using the indicated Mg2+ concentrations
with a hot-start enzyme and supplied KCl-
based buffer from Supplier I (Supplier I).
 PCR-RFLP
• Produk PCR digunakan untuk analisis RFLP (Restriction Fragment
Length Polimorphism)
RFLP: Teknik pemotongan fragmen DNA homolog dengan enzim
restriksi menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda-beda
antara satu alel dengan alel lainnya, sehingga akan menggambarkan
polimorfisme pada urutan DNA homolog.
Enzim restriksi: enzim yang mengenali urutan tertentu dari DNA dan
memotong DNA pada tempat yang spesifik.
• Polimorfisme pada DNA ditunjukkan oleh variasi ukuran fragmen
DNA bila dipotong dengan enzim restriksi yang dapat dianalisis
dengan gel elektroforesis
• Aplikasi: analisis SNP, forensik, diagnosis, test keibuan/kebapaan,
genetik diversitas dan evolusi. Juga untuk analisis pendahuluan
sebelum penggunaan teknik sekuensing DNA.
 Prinsip RFLP

GTATTC G AATTC
Fragmen A

Dipotong dengan
enzim EcoR1
G AATTC G AATTC
Fragmen B

A B 5’- NNNGAATTCNNN -3’

3’- NNNCTTAAGNNN -5’

EcoRI

BM 5’- NNNG AATTCNNN -3’

3’- NNNCTTAA GNNN -
5’
Contoh Hasil PCR-RFLP
Single nucleotide polymorphisms (SNPs)
can distinguish human populations
 RT-PCR (Reverse Transcriptase – PCR)

• Proses PCR didahului dengan satu siklus tambahan, yaitu

perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA)
menggunakan enzim Reverse Transkriptase (enzim yang dapat
menyintesis molekul DNA secara in vitro menggunakan templat
RNA).
• Sangat sensitif untuk mempelajari ekspresi gen pada tingkat
RNA, dan kuantifikasi mRNA, level infeksi virus RNA. Deteksi
penyakit genetik (deteksi tingkat RNA).
• Templat: RNA virus, mRNA dengan ekor poli A
• Primer : primer spesifik/ oligo dT/ random heksamer.
• RT-PCR juga digunakan pada awal tahapan kloning gen eukariot
yang mengandung intron.
 Aplikasi RT-PCR
• Deteksi retrovirus (metoda: RT-PCR
dilanjutkan dengan direct sequencing)
• Deteksi tingkat infeksi retrovirus (metoda:
realtime RT-PCR)
• Mempelajari level ekspresi gen pada tingkat
RNA
• Deteksi penyakit genetik tingkat RNA
 Mekanisme RT-PCR

Transkripsi

Siklus PCR

Reverse Transkripsi
 Real time PCR (qPCR/kPCR)
• Teknik PCR yang mengamplifikasi target DNA dan menghitung
jumlah kuantitatif amplikon.
• Jumlah kopi DNA yang diperoleh bisa merupakan nilai absolut
atau nilai relatif terhadap fragmen DNA lain.
• Progres fragmen DNA hasil amplifikasi yang terbentuk dapat
diketahui secara real time dengan penambahan pendeteksi
yang memungkinkan visualisasi setiap siklus reaksi
• Sering digabung dengan RT-PCR untuk mengetahui jumlah
mRNA dan non-coding RNA dalam sel atau jaringan.
• Aplikasi: Diagnosa penyakit infeksi, kanker (level infeksi),
jumlah kopi mRNA (tingkat ekspresi).
 Metoda Deteksi Real time PCR
1. Menggunakan senyawa pewarna non spesifik yang ber-
interkelat dengan DNA untai ganda.
Pewarna SYBR Green, berikatan dengan semua DNA untai ganda
dalam tabung PCR, intensitas florescence sebanding dengan jumlah
fragmen DNA. Peningkatan jumlah fragmen DNA selama PCR
sebanding dengan peningkatan intensitas florescence, dan dapat
diketahui untuk setiap siklus, sehingga konsentrasi DNA dapat
dihitung. Kekurangan: SYBR Green akan berikatan dengan semua
fragmen DNA untai ganda, termasuk produk non spesifik seperti
dimer primer, sehingga akan mengganggu keakuratan.

2. Menggunakan DNA probe spesifik yang merupakan

oligonukleotida berlabel florescence, sehingga dapat
dideteksi setelah terjadinya hibridisasi antara probe dengan
untai DNA komplemen.
 Hasil Real time PCR

Jumlah kopi/ jumlah mulekul

 Hasil Real time PCR

Level infeksi:

Urinebased malaria PCR detection kit

 Direct sequencing produk PCR

• Sekuensing DNA : mengetahui urutan nukleotida

atau basa dalam suatu fragmen DNA.
• Sekuensing produk PCR = direct sequencing untuk
membedakan dengan sekuensing DNA hasil
kloning.
• Urutan DNA pada fragmen DNA hasil PCR
diketahui dengan cepat, tanpa harus melalui
proses kloning.
• Aplikasi: deteksi/konfirmasi mutasi (PCR-SSCP,
PCR RFLP), polimorfisme, diversitas gen dan
identifikasi mikroorganisme.
.Sekian dan Terimakasih