PCR

( Polymerase Chain Reaction)

Ersandhi

Sejarah
Ditemukan oleh Kary Mullis dkk. (1980)
yang bekerja di Cetus Corp., perusahaan
bioteknologi di Calif., USA.
Ide awal: primer oligonukleotida dapat
digunakan
untuk
mengamplifikasi
(=menggandakan/
memperbanyak)
segmen DNA genom maupun cDNA secara
spesifik.
Mendapat hadiah Nobel di bidang kimia
pada tahun 1993.

Kary Mullis

Rapid development of molecular biology

was based on three principles techniques
:
Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA Sequencing
Cloning

Cell

DNA DN
EXTRACTION
A
structure:
Endoplasmic reticulum

Golgi apparatus

nuclear DNA

Ribosome
mitochondrial
DNA (mtDNA)
Mitochondria

Telomere
1p32.2
Short arm
(p)

Centromere

Long arm
(q)

Telomere

Human
Chromosome:
- 22 pair
autosomal
- 1 pair sex

Active (euchromatin) vs inactive

(heterochromatin)

Nucleosome, basic building block of

chromatin

POLYMERASE CHAIN
REACTION

Adalah Prosedur laboratorium untuk amplifikasi

(penggandaan) ensimatik secara cepat pada
suatu segmen DNA
Prinsip: Penggandaan ensimatik secara cepat
pada suatu segmen DNA dilakukan melalui
ulangan siklus amplifikasi
Umumnya dengan 3 macam suhu:
1. Suhu denaturasi untuk pemisahan 2 utas DNA
2. Suhu Annealing untuk melekatkan primer
pada DNA template
3. Suhu Polimerisasi untuk pemanjangan rantai

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
Alat : DNA Thermal Cycler
Diperlukan:
1. DNA polimerase (enzym) Taq, dll.
2. Primer
3. Deoksinukleotida (dNTPs) ATP, CTP, GTP,
TTP
4. DNA template
5. Buffer (mengandung Mg++) sbg aktivator

1. DNA POLYMERASE
Fragmen Klenow (E. coli) DNA Polymerasae I
- inaktivasi pd temperatur denaturasi pada PCR sehingga
setiap siklus perlu di+kan ensim baru
- tidak baik u/ fragmen DNA > 200 b.p
- Hasil produksi: DNA yang heterogen ukurannya (terjadi
mispriming), karena suhu polimerisasi & annealing rendah
Taq DNA Polymerase (Thermus aquaticus) Thermostabil
aquaticus
Tidak in aktivasi suhu 95oC, sehingga tidak perlu
penambahan ensim baru pada setiap siklus
Annealing & pemanjangan pd suhu yg > tinggi sehingga
mispriming produk > homogen
Ensim polymerase DNA thermostabil yang lain: Pfu, tth,
vent dan pwo polymerase

2. Primer
Merupakan urutan nukleotida yg
sudah diketahui
Harus hanya mengenal & hibridisasi
(nempel) dengan DNA target
Paling sedikit 16 nukleotida, idealnya
20-24 nukleotida (terlalu pendek
tidak spesifik)
Hindari primer yg: hibridisasi silang
atau yg saling melipat & repetitif

2. Primer
Pilih set primer dengan TM (melting
temperature) yg mirip, yaitu
temperature dimana separuh dari
rantai DNA dlm cairan telah
mengalami dissosiasi temperature
annealing umumnya > rendah dari
TM
TM = 2 x (A+T) + 4 (G+C)oC
Kandungan GC 50%-60%
Konsentrasi primer 25-100 pmol

3. Deoksi nukleotida
Terdiri dari campuran dATP, dTTP,
dGTP, dCTP sama banyak
Konsentrasi dNTP 10 pmol
Konsentrasi 100 mM, stabil pada
suhu -20oC selama beberapa
bulan (untuk stock)

4. DNA template
Harus diekstraksi/diisolasi dulu dari bahan yg
akan diperiksa
Dapat Single strand atau double strand
(biasanya kurang dari 700-1000 pasangan
basa/kb)
Ukuran fragmen DNA yg terlalu panjang/besar,
dapat dipotong dulu dengan ensim retriksi
DNA sirkuler tidak efektif harus linier
DNA template di denaturasi dulu 93oC -95oC
selama 5 menit (HOT start)

5. BUFFER (mengandung
Mg++)

pH = 8,3 (suhu kamar) dan pH 7,2 (72 oC)

terdiri dari:
- KCl 50 mM
- Tris-HCl 10 mM
- MgCl2 = 1,5 mM (kation divalen)
katalisator Mg > baik dp Mn
Hati-hati dengan EDTA atau PO 4= yg
mengkontaminasi pd DNA template (pada
proses sintesa maupun pemurniannya)

Tahap Tahap Siklus PCR

1. Denaturasi suhu 94oC terjadi
pemisahan 2 utas DNA template
2. Annealing pada suhu (misal: 50oC)
terjadi perlekatan primer pada
DNA template
3. Polimerisasi pada suhu 72oC
terjadi pemanjangan rantai
(elongation)
HATI-HATI KONTAMINASI!!!

1. Denaturasi
Sebelum PCR hot start selama 25 agar DNA template terpisah
Waktu denaturasi 30 60 bila
terlalu lama ensim terlalu lama
pada suhu tinggi meningkatkan
kehilangan aktivitasnya
(G+C) rasio meningkat Suhu
denaturasi juga meningkat

Principles of DNA
Extraction
1. Preparasi sel/jaringan
Darah : digunakan leukositnya, eritrosit
dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi
untuk mendapat hasil optimal, penyimpanan
sebaiknya pada suhu 4 derajat C,
penyimpanan yang lama (> 1 bulan) akan
menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 5 ml
whole
blood
Jaringan
: secepatnya diekstraksi.
Penyimpanan pada suhu -80 derajat. Jaringan
yang disimpan dalam paraffin blok sulit untuk
diekstraksi

2. Lisis membran sel/organella

(nukleus)

Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk

melisiskan membran, tetapi toksik.
Guanidine isothicyanate : tidak toksik,
digunakan sebagai pengganti phenol

3. Denaturasi senyawa
organik
Kloroform : paling banyak digunakan karena
prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh
Proteinase K : denaturasi protein, perlu
inkubasi

4. Presipitasi
DNA
Isopropanol dengan volume 1:1
Ethanol absolut dan sodium asetat 1:10

5.
Pencucian/washing
Ethanol 70%

Methods of DNA
Extraction
1.
Phenol:chloroform
Phenol-choloroform-isoamyl
alcohol
Metode standard untuk ekstraksi
DNA
Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik
phenol

2. Salting Out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi
(NaCl 6 M)
Proteinase K untuk denaturasi protein

3. Guanidine
isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode
sebelumnya
Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis
dinding sel
Memerlukan chloroform untuk denaturasi
protein

4. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan
perantaraan garam/buffer tertentu (NaI)
Cepat, tetapi recovery DNA kurang

Measuring DNA
Quality
Kualitas
DNA
Konsentrasi tinggi
Utuh, tidak terputus-putus
Tidak banyak terkontaminasi oleh protein

Menentukan Kualitas
DNA
Spektrofotometer pada panjang gelombang 260
nm (protein 280 nm; DNA baik apabila pengukuran
pada 260:280 = 1,7 1,9). Satu OD = 50 ng DNA.
Dilihat dengan elektroforesis, band yang tebal
secara kualitatif menunjukkan DNA yang bagus

Samples for DNA

Extraction
1. Whole blood (leukosit : buffy
Diambil leukositnya, sebelum itu eritrosit
coat)

dilisiskan dengan lisis buffer (EBL =

erythrocyte lysis buffer).
Paling sering digunakan, 3 5 ml darah fresh
cukup banyak menghasilkan DNA

2. Jaringan biopsi/reseksi (otot, usus

dll)
Sebelum ekstraksi, lebih dulu diinkubasi untuk
menghancurkan jaringan ikat

3. Amniotic fluid/Villi
choriales
Untuk kepentingan prenatal
diagnosis
Jumlah DNA yang diperoleh sangat
sedikit

4. Jaringan
lainnya
Untuk kepentingan
forensik
Jaringan
rusak/membusuk/terbakar
Folikel rambut, kuku, tulang
dll

Storing
DNA
DNA disimpan dalam TE buffer (trishydroxymethyl amino methana EDTA)
Disimpan 80 derajat bisa tahan bertahuntahun
Untuk kerja, sebaiknya disiapkan DNA yang
sudah diencerkan menjadi 100 ng/mikroliter
Freezing thawing berulang dapat
meyebabkan kerusakan DNA

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction

(PCR)
Suatu
metode
enzimatik
untuk
mengamplifikasi (=menggandakan) fragmen
DNA secara spesifik.
Bekerja
berdasarkan
pada
sistem
pemanasan dan pendinginan berulang,
terkontrol dan otomatis dalam suatu
perangkat/mesin, yaitu thermal cycler.
Dapat bekerja secara sensitif dan spesifik.
Aplikasi untuk diagnostik dan penelitian.

DNA template/cetakan
Denaturasi template

Penempelan primer

Cara Kerja
PCR
Sintesis DNA baru, berawal
dari primer yang menempel

Setelah beberapa siklus,

DNA baru terbentuk

Temperature

PCR

100

Melting
94oC

50

Time

Temperature

PCR

100

Melting
94oC

50

Time
3

Heat
5

Temperature

PCR

100

Melting
94oC

50

Melting
94oC
Extension
Annealing
72oC
Primers
50oC

Time
3

5
5

Temperature

PCR

100

Melting
94oC

50

Melting
94oC
Extension
Annealing
72oC
Primers
50oC

Time
3

Heat
5

Heat
5
5

30x

Temperature

PCR

100

Melting
94oC

50

Melting
94oC
Extension
Annealing
72oC
Primers
50oC

Time
3

5
5

30x

Temperature

PCR

100

50

0
3

Melting
94oC

Melting
94oC
Extension
Annealing
72oC
Primers
50oC

Time
5

5
5

Heat
5

Heat
5

30x

Temperature

PCR

100

50

0
3

Melting
94oC
Extension
Annealing
72oC
Primers
50oC

Time
5

5
5

Melting
94oC

30x

Temperature

PCR

100

Melting
94oC

50

0
3

Time
5

5
5

Melting
94oC
Extension
Annealing
72oC
Primers
50oC

Fragmentsof
definedlength

30x

More Cycles = More DNA

Size Numberofcycles
Marker 01015202530

Prosedur Umum PCR

Sampel (kultur, jaringan, serum, dll)

Ekstraksi DNA/Sintesis cDNA dari mRNA

+ PCR Mix (buffer, MgCl2, pasangan primer, H2O,

enzim)

Thermal cycler

Hasil visualisasi pada agarose (elektroforesis)

Proses Post-PCR (sekuensing, kloning)

Komponen PCR
DNA Template DNA asal yang akan diamplifikasi
(=digandakan/diperbanyak).
Pasangan primer Utas DNA pendek sintetis yang
komplemen dan mengapit urutan DNA template yang
akan diamplifikasi.
Enzim DNA Polymerase Menggabungkan dNTP
pada pasangan primer dan memanjangkan utas DNA
baru.
Buffer Menjaga stabilitas pH sistem reaksi
enzimiatis.
MgCl2 Mempengaruhi ikatan primer dgn DNA
template.
Air Pelarut dan pengencer komponen reaksi.
Mineral Oil (overlay) Menahan penguapan dari
komponen reaksi.

Primer PCR
Urutan DNA pendek, berukuran 20-40 pasang
basa, atau tergantung kebutuhan.
Dirancang berdasarkan sekuens/urutan DNA
target (gen, fragmen gen, dll) yang telah diketahui
urutannya.
Pada proses annealing, pasangan primer akan
melekat pada daerah template yang
berkomplemen/berpasangan dengannya.
Primer akan bergabung pada produk PCR (dNTP
diikatkan pada primer yang berfungsi sebagai
tambatan utas DNA produk PCR).

Disain Primer PCR

Dirancang berdasarkan sekuens/urutan DNA
target (gen, fragmen gen, dll) yang telah
diketahui sebelumnya.
Dibuat secara sintetis dengan ukuran (bm,
molaritas, panjang basa, suhu kerja, dll) yang
diketahui dengan pasti.
Menentukan suhu annealing (suhu perlekatan
primer dengan DNA template) yang paling
sederhana:
4(G+ C) + 2(A+ T) - 5
Untuk urutan dan suhu annealing primer yang
lebih kompleks dilakukan dengan bantuan
software komputer, mis. Lasergene DNAStar.

PCR: Thermal Cycler

Otomatisasi
proses
PCR

sebelumnya
menggunakan beberapa waterbath dengan
suhu bervariasi
Tersusun dari blok reaksi (tempat tabung
reaksi)
yang
dihubungkan
dengan
unit
pemanas, pendingin dan pengontrol.
Bisa dibuat program untuk DNA target yang
berbeda- beda, misalnya:
Denaturasi : 95oC, 1 menit
Penempelan Primer : 55oC, 30 detik
Perpanjangan rantai DNA : 72oC, 1 menit

Thermal Cycler (1)

Thermal Cycler (2)

Penanganan Sampel Untuk PCR

Sampel: virus, sel prokaryot/eukaryot, jaringan hewan/tumbuhan, dll
Ekstraksi (isolasi)
DNA

RNA
Reverse Trancriptase
cDNA
PCR
Hasil

Modifikasi Pasca PCR

Kloning
Sequencing
Engineering

DNA Template/Cetakan
Diperoleh
dengan
ekstraksi
DNA

mengeluarkan/memisahkan DNA dari sel maupun

sumber lain.
Diperoleh dari RNA (mRNA) dengan teknik RT-PCR
(Reverse Transcriptase) menghasilkan cDNA
(complementary DNA) sebagai DNA template.
Teknik
bervariasi,
dari
yang
home
made
(menyiapkan setiap komponen secara tersendiri)
hingga yang RTG (Ready-To-Go) alias reagen siap
pakai.

Elektroforesis:
Visualisasi DNA Hasil PCR
DNA akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub
positif pada medan listrik.
DNA ukuran besar akan bergerak lebih lambat
dibandingkan dengan DNA yang lebih pendek.
Dengan penambahan Ethidium Bromida, DNA akan
tampak di bawah iluminasi UV dalam bentuk pita
(band) berpendar.
Ukuran DNA produk PCR dapat dihitung berdasarkan
DNA standar yang telah diketahui ukurannya.
Hasil elektroforesis juga untuk melihat apakah proses
PCR yang dilakukan bermasalah atau tidak.

Electrophoresis Apparatus

Hasil Elektroforesis DNA

pcr

1/23/17

Yunan Jiwintarum/2008

ALAT-ALAT PCR

DNA THERMAL CYCLER (MESIN PCR)

DNA THERMAL CYCLER (MESIN PCR)

DNA THERMAL CYCLER (MESIN PCR)

KEGUNAAN:
OTOMATISASI REAKSI
CONTOH:
THERMOLYNE AMPLITRON I
MYCYCLER BIORAD
TAHAPAN REAKSI:
- DENATURASI
- ANNEALING
- POLIMERISASI/ELONGATION

MICROCENTRIFUGE

MICROCENTRIFUGE
KEGUNAAN:
PENGENDAPAN DNA
CONTOH:
TOMY MC-140
KECEPATAN:
14.000 rpm.

MICROPIPETTE

MICROPIPETTE
KEGUNAAN:
MENCAMPUR PEREAKSI/MENGAMBIL
PEREAKSI ATAU SAMPEL
CONTOH:
EPPENDORF
VOLUME:
0,5 10 l

FREEZER -20 C
O

FREEZER -20 C
O

KEGUNAAN:
MENYIMPAN REAGEN
CONTOH:
MERK DERBY, SANYO

DEEP FREEZER -80 C

O

DEEP FREEZER -80 C

O

KEGUNAAN:
MENYIMPAN DNA, RNA
CONTOH:
SANYO (MDF-U281)

ELEKTROPHORESIS
SUB-MARINE GEL ELEKTROPHORESIS
app.
ANALISA PRODUK PCR BIORAD
(MINI SUB CELL)
ELECTROPHORESIS POWER SUPPLY
DNA ELECTROPHORESIS BIORAD
PAC 1000

1/23/17

Yunan Jiwintarum/2008

1/23/17

Yunan Jiwintarum/2008

1/23/17

Yunan Jiwintarum/2008

UV TRANSILUMINATOR

KEGUNAAN: ANALISA
PRODUK PCR

pcr

1/23/17

Yunan Jiwintarum/2008

WATERBATH & VORTEX MIXER

(MENCAMPUR PEREAKSI/BARNSTEAD)

LAMINARY FLOW (PROSEDUR

ASEPTIK/BASSAIRE)

LAMINARY FLOW

ELEKTROPHORESIS
Elektroforesis adalah suatu tehnik
pemisahan yang banyak digunakan
untuk memisahkan makro molekul
(seperti protein dan asam nukleat).
Elektroforesis merupakan suatu
metode pemisahan, sama halnya
dengan kromatografi. Prinsip dasar
bekerjanya elektroforesis ialah
adanya perbedaan kecepatan gerak
partikel-partikel bermuatan bila

ELEKTROPHORESIS
Pada elektroforesis ini bahan yang akan
dipisahkan ditempatkan dalam tabung
bentuk U yang kedua ujungnya dihubungkan
dengan anoda dan katoda dan berisi larutan
dapar sebagai pelarutnya. Apabila kepada
sistem dipasang tegangan searah, ion-ion
dalam larutan dapar akan bergerak dengan
kecepatan yang tergantung kepada, antara
lain: muatan netto, ukuran bahan dan
bentuk ionnya.