Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa

nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang
merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang
dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan
untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara
membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui1.

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode yang dikembangkan oleh
Allan Maxam dan Walter Gilbert pada tahun 1977. Pada metode Maxam-Gilbert, degradasi DNA
terjadi secara kimiawi. Dalam metode ini diperlukan DNA untai ganda, tetapi tidak diperlukan
primer karena bukan sintesis untai baru. Pemotongan untai DNA terjadi secara kimia, sehingga
reagen kimia tertentu harus ditambahkan ke dalam sistem reaksi 2. Namun ternyata metode
Maxam-Gilbert ini memiliki beberapa kekurangan, diantaranya: (a) memerlukan banyak DNA
murni; (b) melalui banyak tahapan pemurnian intermediet; dan (c) hanya bisa diterapkan untuk
pembacaan DNA dengan untai yang relatif pendek. Sehingga dewasa ini metode sekuensing
Maxam-Gilbert sudah jarang digunakan karena ditemukannya metode lain yang jauh lebih
praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh Fred Sanger dan A. R. Coulson pada
tahun 1980. Prinsip dasar pada metode dideoksi Sanger ini adalah terjadinya terminasi rantai
nukleotida sebagai akibat adanya nukleotida dideoksi (ddNTP)3.

Selanjutnya, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan dan berhasil diautomatisasi
pada pertengahan 1980-an. Sejak tahun 1995, berbagai proyek genom yang bertujuan
menentukan sekuens keseluruhan DNA pada banyak organisme telah diselesaikan, termasuk
Proyek Genom Manusia. Sekuensing DNA seluruh genom semakin terjangkau dan cepat
dilakukan berkat pengembangan sejumlah teknik sekuensing generasi berikutnya mulai tahun
2000-an 4.

Metode Sanger Memerlukan5 :

 DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA
 Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan
berfungsi sebagai starting point untuk replikasi

 DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung
3 dari template
  Sejumlah nukeotida normal

 Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna

fluorescent)

 Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy
(DD) nukleotida diambil (dipasangkan).

 Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti

 Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada

DDnukleotida tertentu yang dilabel.

 Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama
elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

Tahapan Sekuensing Metode Sanger :

1. Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double strand DNA)

2. Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA)
3. Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi

4. Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing adalah
template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase.
  Template DNA berfungsi sebagai cetakan.
 Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang mengenal situs spesifik pada DNA
template untuk memulai prooses polymerase.

 dNTP (deoksi nukleotida tri phospat) berfungsi sebagai sumber nukleotida pada proses
polymerase sekuensing. dNTP ada 5 jenis, yaitu dATP (deoksi adenin tri phospat), dGTP
(deoksi guanin tri phospat), dUTP (deoksi urasil tri phospat), dCTP (deoksi citosin tri
phospat), dan dTTP (deoksi timin tri phospat).

 ddNTP (dideoksi nukleotida tri phospat) berfungsi untuk menghentikan/terminasi proses

enzim polymerase, sehingga proses perbanyakan nukleotida terhenti.

 Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi polimerisasi atau perbanyakan nukleotida.

5. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu ddGTP,
ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan ddNTP yang berbeda.
Tabung pertama diisi dengan ddGTP, tabung kedua diisi dengan ddCTP, tabung ketiga diisi
dengan ddATP, dan tabung keempat diisi dengan ddTTP.

6. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing tabung diisi
dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan
dTTP.
7. Memasukkan dNTP ke dalam tabung reaksi tadi.

8. Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi mengenali situs
spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai landasan/pijakan untuk memulai
polimerisasi.
9. Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase (taq-polymerase).Enzim
polimerase memulai proses polimerisasi.

10. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari nukleotida dNTP
(deoksi nukleotida tri phospat)
11. Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara nukleotida,
deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer nukleotida sebelumnya
12. Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi proses
polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda panjangnya

a). Berikut ini gambar perbedaan struktur dNTP (deoksinukleotida tri phospat) dan ddNTP
(dideoksinukleotida tri phospat).
b). Keberadaan ddNTP menghalangi terbentuknya ikatan phospodiester antara satu nukleotida
dengan nukleotida berikutnya, sehingga mengakibatkan terminasi/pengakhiran proses
polimerisasi

13. Kehadiran ddNTP menghasilkan beberapa rantai polinukleotida berbeda

14. Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13 dilakukan pada semua tabung reaksi

15. Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk di alirkan pada gel agarosa
16. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak pada gel agarosa.
Polinukleotida yang paling pendek bermigrasi/pergerakannya apling cepat pada gel agarosa.
17. Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen, yaitu 5’
AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’ GGATCGGCT 3’

1. Duan, J., J. J. Heikkila, and B. R. Glick. "Sequencing a bacterial genome: an overview."

signal 10 (2010): 11.
2. Gumilar, G., Supriyanti, F. M. T., Siti, H. H. (2008). Bioteknologi. Bandung: Jurusan
Pendidikan Kimia FPMIPA UPI
3. Gumilar, G. (2007). Deteksi dan sekuensing DNA. [Online]. Tersedia:
http://fpmipa.upi.edu/kuliah/mod/resource/Deteksi_dan_sekuensing_DNA. pdf
4. Conrad, D. F., Pinto, D., Redon, R., Feuk, L., Gokcumen, O., Zhang, Y., ... & Fitzgerald,
T. (2010). Origins and functional impact of copy number variation in the human genome.
Nature, 464(7289), 704-712.
5. Buckingham, Lela dan Maribeth L. Flaws. 2007. Molecular Diagnostics. BSE