IMUNOFLUORESENSI ASSAY (IFA)

Disusun Oleh Kelompok 5 :

 
Muhammad Ziddan Bayu Aji
(1813453074)
Dita Kusuma Wardani (181345379)
Triya Utami Ramadiantaru (1813453080)
Nanda Anisa Putri (1813453081)
Defha Fafilah (1813453082)
Octa Monica Juwantari (1813453085)
 Pengertian FAT (IFA)

• Antibodi Fluorescent Teknik adalah alat

diagnostik di mana pewarna fluorescent
ditambahkan ke jaringan yang mengandung
anti gen. Hasilnya menyebabkan wilayah yang
ditargetkan bersinar dengan sinar ultraviolet
bila dilihat dengan mikroskop fluorescent.
 Pengertian FAT (IFA)

• Imunofluoresen adalah metode imunologi untuk

mendeteksi antibodidari berbagai kelas immunoglobulin
dalam serum, cairan ludah, cairan otak dengan cara
mereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-
antibodi yang dilabel denagan Fluoresence Isothiocyanat
(FITC), sehingga terpancar sinar warna hijau atau merah
jika di label dengan Rodhamin. Tetapi dalam
perkembangan sekarang imunofluoresen banyak
digunakan dalam penelitian untuk mendeteksi antigen
antigen atau antibody dalam mukosa usus, mukosa
mulut, dan dalam jaringan, urine, cairan mata.
Macam-macam Pemeriksaan Pemeriksaan FAT (IFA)

• Metode FAT (IFA) dikenal ada 2 macam

pemeriksaan yaitu :
1. Antibodi Fluorescent Teknik, Langsung
• Suatu bentuk teknik antibodi fluorescent
memanfaatkan terkonjugasi fluorochrome ke
antibodi, yang ditambahkan secara langsung ke
jaringan atau suspensi sel untuk mendeteksi
antigen tertentu. Atau dengan cara melabel
langsung antibodinya.
 2. Antibodi Fluorescent Teknik, Langsung
• Suatu bentuk teknik antibodi fluorescent yang biasa
digunakan untuk mendeteksi antibodi serum dan
kompleks imun pada jaringan dan mikroorganisme
dalam spesimen dari pasien dengan penyakit menular.
Teknik ini melibatkan pembentukan sebuah kompleks
antigen-antibodi yang diberi label dengan fluorescein-
conjugated anti-antibodi immunoglobulin. Atau melalui
perantara antibody yang kedua dalam produk pasar
dikenal dengan Konjugat Imunoglobulin Fragment.
 Tujuan dari penggunaan alat IFA

• Tes ini berguna mendeteksi adanya antibody

specific terhadap malaria atau pada keadaan
dimana parasit sangat minimal. Tes ini kurang
bermanfaat sebagai alat diagnostic sebab
antibody baru terjadi setelah beberapa hari
parasitemia. Manfaat tes serologi terutama
untuk penelitian epidemiologi atau alat uji
saring donor darah.
 Prinsip penggunaan alat IFA

•  
• Teknik pewarnaan secara immunofluorescence berprinsipkan
atas ikatan antigen antibody yang dilabel dengan fluorochrome
(pewarna fluorescence). Protokol immunofluorescence sama
dengan protocol IHC hanya saya pelabelnya yang berbeda.
Teknik immunofluorescence juga dapat dibedakan menjadi
direct immunofluorescence dan indirect immunofluorescence.
Direct immunofluorescence menggunakan antibody yang
terkonjugasi dengan fluorochrome (fluorochrome-conjugated
antibody) sedangkan indirect immunofluorescence
menggunakan antibody sekunder (antibody yang bersifat anti
dari antibody primer).
 Prinsip penggunaan alat IFA
• Antibody sekunder yang digunakan adalah antibody yang
terkonjugasi dengan fluorochrome (fluorochrome-
conjugated secondary antibody) ataupun antibody yang
terbiotinilasi (biotin-conjugated secondary antibody). Pada
penggunaan biotin-conjugated secondary antibody,
fluorochrome akan berikatan avidin maupun streptavidin
dimana avidin atau streptavidin ini akan berikatan dengan
biotin pada antibody sekunder. Keuntungan teknik indirect
immunofluorescence adalah kita dapat meningkatkan
jumlah fluorophore (Zola, 1998).
Prosedur pemeriksaan menggunakan alat IFA

Regensia :
• Aceton
• Feotal Calf Serum (FCS)
• Phospat Buffer Saline (PBS).
• Konjugat Fragmen immunoglobulin
• Rhodamin.
 Prosedur pemeriksaan menggunakan alat
IFA
ALAT : BAHAN :
• Deckglass • Serum sampel
• objek glas • Antigen dari sel kultur atau
• Mikroskop Fluorescent antigen dari jaringan
• Pinset
• Gelas incubator
• Kotak incubator
• Inkubator
 Prosedur pemeriksaan menggunakan alat
IFA
Cara Kerja
• Direct Imunofluoresen (Deteksi Antigen)
– Sel pada deck cover glass yang diinfeksi dengan virus difiksasi dengan
aceton-20oC selama 15 menit.
– Cuci dengan PBS dan keringkan pada temperature ruangan sampai
kering.
– Masukan deck cover glass pada PBS yang mengandung 1%FCS dan
biarkan 15 menit.
– Siapkan serum sampel dan encerkan dengan PBS sesuai keperluan.
– Teteskan 20µl serum sampel di atas glass obyek.
– Taruh deck cover glass di atas sampel dengan bagian sel di bawah dan
letakkan dalam kotak dan kertas yang telah dibasahi dengan air.
– Inkubasi pada incubator denagan temperatur 37oC selama 45 menit.
Prosedur pemeriksaan menggunakan alat
IFA
– Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 Menit.
– Siapkan Konjugat fragmen Imunoglobulin dengan pengenceran
1:100µl.
– Teteskan Konjugat 20µl di atas glas obyek dan letakkan deck cover
glass di atasnya.
– Inkubasi pada incubator dengan temperatur 37oC selama 15 menit
– Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 menit dan selanjutnya angkat
deck cover glass dan sentuhkan deck cpver glass pada kertas tissue
agar airnya berkurang, sehingga kering tapi basa.
– Teteskan Glycerin 50% 20µl di atas glass obyek dan selanjutnya deck
cover glass di taruh diatasnya dan langsung dilihat hasilnya dengan
mikroskop fluorescent pada pembesaran 40x. catatan preparat ini
dapat disimpan pada 4oC sampai 2-3 minggu
 Prosedur pemeriksaan menggunakan alat IFA

– Interpretasi hasil

• Gambar 2. Teknik immunofluorescence. A: direct immunofluorescence, B:

indirect immunofluorescence (fluorochrome-conjugated secondary
antibody), C: indirect immunofluorescence (biotin-conjugated secondary
antibody + avidin / streptavidin-flourescein) (Zola, 1998).  
 Prosedur pemeriksaan menggunakan alat
IFA
Berikut adalah fluorophore beserta data
absorpsi dan emisi pada fluorescence.
• Tabel 1. Fluorophore beserta data absorpsi
dan emisi pada fluorescence
• Prosedur immunofluorescence memiliki
kelebihan pada prosedur multi-labelling.
Dalam satu jaringan dengan satu prosedur
pewarnaan kita dapat melabel 2 atau lebih
antigen. Double labelling dapat dilakukan
dengan syarat spesies antibody primer yang
digunakan adalah berbeda, misalnya antibody
A dalam mouse dan antibody B dalam rabbit.
Gambar 3. Doubel immunofluorescence (VectorL aboratories, Inc. 2005)
Gambar 4. Prosedur double immunofluorescence. Pada teknik double labelling
di atas menggunakan dua avidin conjugate yaitu: fluorescein avidin DC (hijau)
dan texas red avidin DCS (merah) (Vector Laboratories, Inc. 2005)
Gambar 5. Pewarnaan double immunofluorescence. Pada teknik double labelling di atas
menggunakan rabbit polyclonal anti-P antibody virus rabies (P), Mab 62B5 anti-N
antibody virus rabies (N) dan polyclonal anti-M antibody virus rabies (M). DAPI (biru)
digunakan untuk mewarnai nuclei (merge). Colocalization bewarna kuning (merge).
Pengamatan menggunakan confocal laser microscopy (Lahaye et al., 2009).