LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER
PRODUKSI DAN ANALISIS PROTEIN REKOMBINAN

Nama : Nur Afni Helia Dewi

NIM : 191810401002

Laboratorium Bioteknologi
Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Jember
2020
I. Judul : Produksi Dan Analisis Protein Rekombinan

II. Tujuan Praktikum :

1. Mahasiswa mampu melakukan produksi dan ekstraksi protein
rekombinan.
2. Mahsiswa mampu melakukan analisis protein dengan Sodium Dodecyl
Sulfat-PoliAcrylamide Gel Elektroforesis (SDS-Page).

III. Alat dan Bahan

3.1 Produksi Protein Rekombinan
Alat : 1. Inkubator
2. Sentrifugasi
3. Inokulum
Bahan : 1. E. coli transforman
2. Medium LB cair + amphicilin
3. Arabinosa
4. IPTG
3.2 Ekstraksi Protein Rekombinan
Alat : 1. Sentrifugasi
2. Mikropipet
Bahan : 1. Buffer ekstraksi:
- 50 mM Tris CL (pH 7,4)
- 20 mM MgCl2
- 1 mM EDTA
- β-mer 10 mM
2. Lisozim 50 µg/ml
3. Buffer SDS-Page
4. β-Mercapto
5. Pellet sel + arabinose
6. Pellet sel + IPTG
 7. Pellet sel tidak diinduksi
3.3 Analisis Protein Dengan SDS-Page
Alat : 1. Elektroforesis
Bahan : 1. Buffer elektroda
2. Buffer sampel
3. Sampel protein
4. Gel SDS Page

IV. Skema Kerja

4.1 Produksi Protein Rekombinan
E. coli transforman

Ditumbuhkan di LB cair + amphicilin

Diinkubasi 37ºC over night

Diambil 1 ml sebagai starter

Ditumbuhkan di 50 ml LB cair + amphicilin 3 jam, 37ºC

Diinduksi dengan arabinose, IPTG dan tidak diinduksi, terdapat 3 perlakuan

Diinkubasi 28ºC, shake 120 rpm, 5 jam

Diinkubasi on ice 15 menit

Disentrifugasi 5000 rpm, 4ºC, 10 menit

Diambil pellet

Hasil
4.2 Ekstraksi Protein Rekombinan
Ditambahkan buffer ekstraksi dan lisozim pada pellet

Disentrifugasi 4ºC, 10 menit, 12000 rpm

Ditambahkan 1:1 buffer SDS-Page dan β-Mercapto pada pellet

Hasil

4.3 Analisis Protein Dengan SDS-Page

Ditambahkan sampel protein dan buffer sampel

Dipanaskan di suhu 95ºC, 3 menit

Dimasukkan ke dalam sumur gel

Dielektroforesis pada 70A, 3 hingga 4 jam

Diwarnai staining dan destaining

Hasil

V. Hasil dan Pembahasan

5.1 Hasil
Hasil yang didapat pada acara produksi dan analisis protein rekombinan
adalah berupa pita-pita protein yang terbentuk.
5.2 Pembahasan
Praktikum kali ini dengan acara produksi dan analisis protein rekombinan
yang akan membahas mengenai proses produksi, ekstraksi protein rekombinan
dan analisis dengan SDS-Page serta fungsi dari setiap bahan maupun perlakuan.
Bakteri yang digunakan untuk produksi protein yaitu E. coli DH-5ɑ dimana
membawa plasmid pGLO. Konsentrasi acrylamide yang digunakan adalah 12,5%
pada gel SDS-Page dalam analisis protein.
Menurut Artama (1991), DNA rekombinan adalah penggabungan DNA dari
spesies berbeda dimana akan menghasilkan sifat-sifat yang diinginkan. DNA
rekombinan terjadi perubahan urutan basa nitrogen sehingga akan mempengaruhi
protein yang diproduksi atau sesuai dengan keinginan. Menurut Gaffar (2010),
Protein rekombinan adalah protein yang dihasilkan dari hasil teknologi DNA
rekombinan. Teknologi DNA rekombinan dilakukan dengan pemindahan gen
pengkode enzim atau protein dari satu organism ke organisme yang lain.
Pembuatan DNA rekombinan dilakukan beberapa tahap yaitu Menurut Casali
dan Preston (2003), mengekstraksi DNA asing ke dalam sel bakteri melalui pori
pada dinding serta membrane selnya dengan proses heat shock sehingga dari
proses masuknya molekul DNA asing ke dalam protoplasma akan mengakibatkan
perubahan materi genetiknya. Menurut Sword (2003), Transformasi pada DNA
rekombinan didalam plasmid dibutuhkan induksi oleh zat-zat tertentu. Sel bakteri
yang sudah mengalami perlakuan fisik sehingga mampu dalam mengambil DNA
asing merupakan sel kompeten. Menurut Hardianto dkk (2012), Tahap-tahap
dalam pembuatan DNA rekombinan yaitu dengan mengisolasi DNA suatu
organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme lain atau berbeda
sehingga akan terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke
dalam sel organisme baik prokariot maupun eukariot dimana DNA akan
bereplikasi dan terekspresikan.
Menurut Maksum dkk (2017), Produksi protein rekombinan pada bakteri E.
coli yaitu dengan memasukkan bakteri E. coli transformasi ke dalam media kultur
dengan memperlakukan sel dengan berbagai agen sehingga akan didapatkan sel
bakteri yang mengandung protein rekombinan. Menurut Choi dan Lee (2004),
Produksi protein rekombinan tidak memerlukan proses lisis membrane luar
dimana untuk mempertahankan produksi protein rekombinan yang berkelanjutan.
Menurut Tong dkk (2000), Setelah panen sel bakteri dilakukan dimana
dibutuhkan metode fisik atau senyawa kimia untuk mengluarkan protein secara
ekstraseluler.
Menurut Watson dkk (1992), E. coli cukup sering digunakan sebagai host/
inang untuk ekspresi protein rekombinan. E. coli digunakan karena memiliki
tingkat ekpresi yang tinggi, mudah dalam peningkatan skala produksi dan media
pertumbuhan yang murah. Penggunaan E. coli dalam produksi protein
rekombinan dari genom eukariot membutuhkan modifikasi pasca-translasi karena
bakteri prokariotik tersebut tidak memiliki mesin intraseluler untuk melakukan
modifikasi pasca-translasi. E. coli untuk ekspresi protein rekombinan sangat
tergantung dengan struktur primer, sekunder, tersier dan fungsi karakteristik dari
protein tersebut. Menurut Makrides (1996), E. coli tidak memiliki kemampuan
dalam pelipatan protein asing (folding) dan modifikasi pasca-translasi sehingga
tipe protein yang dapat diekspresikan terbatas. Menurut Lueking dkk (2000), E.
coli tidak cocok dalam mengekspresikan protein yang mengandung banyak ikatan
disulfide.
Menurut Gaffar (2010), Penggunaan Saccaromyces cerevisiae sebagai inang
untuk mengatasi kendala sistem ekspresi pada E. coli dimana protein rekombinan
dari sel eukariota banyak diekspresikan dalam sistem ekspresi S. cerevisiae
karena terdapat promotor gen yang kuat yang digunakan sebagai vector ekspresi
dan memiliki mekanisme modifikasi pasca-translasi sehingga dapat melakukan
(folding). Konsekuensi dalam proses pembuatan protein rekombinan pada S.
cerevisiae yaitu urutan pengode dari protein rekombinan yang membutuhkan gula
ikatan-O atan ikatan-N. Urutan pengode atau pemula diinsersikan di bagian depan
cDNA yang akan diekspresikan sehingga pembentukan ikatan disulfide tepat dan
modifikasi pasca-translasi terjadi.
Menurut Bassiri (2011), Bakteri E. coli DH-5ɑ memiliki plasmid pGLO yang
merupakan plasmid termutagenasi dimana plasmid pGLO membawa gen β-
laktamase untuk resisten terhadap ampicillin (AmpR). Plasmid pGLO juga
memiliki gen yang mengkode protein fluoresen hijau (GFP) dan operon arabinosa
repressor (araC). Protein GFP memiliki sifat memendarkan warna hijau ketika
proses visualisasi UV yang diakibatkan terdapat gugus chromophore. Praktikum
kali ini menggunakan bakteri E. coli DH-5ɑ dikarekan adanya gen pengkode
protein fluoresen hijau (GFP) dimana saat menganalisis dapat dengan mudah
ditemukan keberhasilan dalam produksi protein rekombinan.
Tahap yang dilakukan dalam produksi protein yaitu menumbuhkan bakteri E.
coli DH-5ɑ pada medium LB cair dengan kandungan antibiotic yaitu amphicilin.
Menurut Henunili (2013), Penanda yang telah dibawah oleh plasmid pGLO
seperti penanda resisten terhadap antibiotic yang digunakan sebagai pembeda
antara sel yang sudah tertransformasi dan yang tidak tertransformasi. Tahap
selanjutnya setelah ditumbuhkan pada medium dilakukan inkubasi selama over
night untuk menumbuhkan atau memperbanyak sel bakteri. Tahap berikutnya
dilakukan 3 perlakuan dimana diinduksi dengan arabinose, IPTG dan tidak
diinduksi dan dilakukan inkubasi kembali menggunakan shaker 28ºC. Menurut
Pujawati dan Nawfa (2016), penggunaan shaker incubator betujuan agar dapat
memelihara atau menjaga bakteri pada jam tertentu serta menjaga kadar oksigen
tetap ada didalam atau lingkungan media. Tahap berikutnya dilakukan inkubasi on
ice selama 15 menit yang bertujuan agar sel bakteri tidak pecah saat akan memulai
sentrifugasi pada 4ºC. Proses sentrifugasi dilakukan untuk mendapatkan pellet
yang akan diberi perlakuan selanjutnya. Menurut Istianah dkk (2018), Sentrifugasi
digunakan untuk proses pemisahan dimana diberikan gaya sentrifugal dengan
pergerakan cepat pada partikel padat (solid), sehingga partikel solid tersebut akan
terpisah dengan cairan (liquid) secara perlahan pada sampel.
Tahap ekstraksi protein rekombinan dilakukan dengan cara yaitu pellet yang
didapatkan ditambahkan dengan buffer ekstraksi dan lisozim kemudian
disentrifugasi. Buffer ekstraksi terdiri dari beberapa komponen yaitu Tris CL,
MgCl2, EDTA dan β-mer. Menurut Das dan Dash (2015), Tris Cl berfungsi dalam
mempertahankan pH fisiologis internal sel pada saat penambahan reagen lain.
Penggunaan EDTA berperan dalam menginaktivasi enzim DNAase dengan
mengikat ion magnesium sehingga dapat mencegah DNA terdenaturasi oleh
DNAase dan memecah dinding sel maupun membrane sel. MgCl2 bertindak
sebagai pendonor ion Mg dalam menginaktivasi enzim DNAase. Menurut Walker
dan Rapley (2008), Penambahan β-mer berperan dalam denaturasi protein dengan
membentuk ikatan hydrogen sehingga akan terpisah dengan DNA. Menurut
Maksum dkk (2019), Penambahan lisozim membantu dalam menghancurkan
struktur dinding sel pada bakteri. Tahap terakhir yaitu dengan penambahan buffer
SDS-Page yang bertujuan untuk mengubah muatan pada protein menjadi negative
dan β-Mercapto berfungsi sebagai memisahkan protein dengan DNA.
Perlakuan yang diberikan saat menumbuhkan bakteri E. coli DH5-ɑ pada
medium LB cair dengan amphicilin (sebagai starter) dimana dilakukan 3 jenis
induksi yaitu dengan arabinose, IPTG dan tidak diinduksi dan hal ini akan
mengacu pada mekanisme kerja dari arabinose dan IPTG dalam sel bakteri.
Bakteri E. coli DH5-ɑ yang diinduksi IPTG akan terjadi sistem Lac operon.
Menurut Marbach dan Bettenbrock (2012), Lac operon adalah sistem ekpresi gen
yang dapat diinduksi dan operon ini memiliki 2 bagian yaitu ekspresi repressor
LacI dan ekspresi gen target yang dapat diinduksi. Represor LacI akan terikat
dengan lacO di bagian kedua operon dan akan memicu represi. Represi tersebut
akan menghentikan proses transkripsi dari promotor sehingga derepresi transkipsi
perlu dilakukan dengan inducer seperti IPTG. IPTG dapat mengikat repressor
LacI sehingga mencegah terikatnya LacI ke operator. IPTG digunakan sebagai
induser utama yang disebabkan stabilitas serta efektivitas yang dimiliki sangat
baik. Bakteri E. coli DH5-ɑ yang dicampurkan dengan arabinose akan mengalami
represi. Menurut Maksum dkk (2019), Transpor arabinose diregulasi oleh faktor
transkripsi AraC dan CRP. AraC akan diikat dengan arabinose sedangkan CRP
akan mengikat cAMP dimana akan mengaktifkan ekpresi gen dalam metabolism
arabinose. Represi katabolit arabinose dihasilkan oleh AraC yang sudah terikat
dengan arabinose dan yang mengikat promotor.
Analisis protein dilakukan dengan SDS-Page menggunakan acrylamide.
Menurut Girindra (1993), Sodium Dodecyl Sulfat-PoliAcrylamide Gel
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan beberapa molekul protein
berdasarkan perbedaan berat molekul. Menurut Davis dkk (1994), Prinsip SDS-
Page adalah dengan memanfaatkan perbedaan kemampuan migrasi pada molekul-
molekul protein yang disebabkan perbedaan berat molekul protein. Tujuan SDS-
Page yaitu untuk memisahkan protein berdasarkan sifat electrophoretic mobility
(berdasarkan berat molekul atau perbedaan tingkat migrasi dalam sebuah medan
listrik). Mekanisme migrasi molekul protein pada gel poliacrilamid yaitu Menurut
Syahputra dkk (2016), Perpindahan molekul protein pada elektroforesis yaitu
molekul protein yang memiliki berat molekul yang kecil akan bermigrasi paling
jauh dari sumuran sedangkan molekul protein yang memiliki berat molekul lebih
besar maka akan terletak di dekat sumuran. Protein marker sebagai standart dalam
menentukan berat molekul protein.
Analisis protein juga dilakukan pewarnaan staining dan destaining serta
menggunakan 2 macam gel yang digunakan yaitu stacking gel dan resolving gel.
Menurut Gaffar (2010), Pewarnaan staining digunakan untuk mewarnai protein
sehingga memudahkan dalam pengamatan dan pewarnaan destaining digunakan
untuk menghilangkan warna atau untuk proses pencucian. Menurut Maksum dkk
(2019), Stacking gel digunakan untuk mencetak sumuran atau penempatan sampel
dan resolving gel digunakan sebagai tempat memisahkan protein berdasarkan
berat molekulnya. Protein akan tertarik ke bagian bawah (+) oleh arus listrik.
Hasil yang didapatkan setelah dilakukan metode SDS-Page pada 3 perlakuan
yang berbeda yaitu pada sampel dengan diinduksi arabinose didapatkan pita
protein GFP (protein rekombinan) yang akan memendarkan warna hijau jika
divisualisasikan dengan UV dan pada sampel dengan diinduksi IPTG juga
terdapat pita protein GFP serta pada sampel yang tidak diinduksi tidak
menghasilkan protein GFP yang disebabkan tidak terekspresinya gen GFP karena
tidak terdapat arabinose dimana AraC akan diikat dengan arabinose. Menurut
Bassiri (2011), Plasmid vector mengandung operon arabinosa repressor (araC)
dimana akan mengkode protein fluoresen hijau (GFP) sehingga pada saat
divisualisasikan akan memendarkan warna hijau. Menurut Ammar dkk (2018),
IPTG dan arabinose memiliki kemiripan struktur yang dapat digunakan untuk
penginduksi promotor lac sehingga transkripsi tetap berlangsung.
VI. Kesimpulan
Praktikum kali ini dengan acara produksi dan analisis protein rekombinan
dapat ditarik kesimpulan bahwa dalam melakukan produksi prtotein rekombinan
diperlukan gen yang diinginkan, terdapat vector dan host. Ekstraksi protein
rekombinan diperlukan buffer ekstraksi dalam memecahkan dinding dan
membrane sel pada bakteri E. coli DH5-ɑ dan penambahan buffer SDS-Page
untuk mengubah muatan pada protein menjadi negative sehingga memudahkan
pada saat proses elektroforesis. Analisis protein diperlukan dua macam gel yaitu
stacking gel dan resolving gel serta pewarnaan staining dan destaining. Hasil yang
diperoleh menunjukkan bahwa pada ketiga perlakuan pada sampel yaitu diinduksi
dengan arabinose menghasilkan protein rekombinan, diinduksi dengan IPTG juga
menghasilkan protein rekombinan dan tanpa diinduksi tidak terdapat protein
rekombinan.
 DAFTAR PUSTAKA

Ammar, E. M. dkk. 2018. Regulation Of Metabolism In Escherichia coli During

Growth On Mixtures Of The Non-glucose Sugars: Arabinose, Lactose, And
Xylose. Scientific Reports, (8) 1: 1–11.

Artama, W. T. 1991. Rekayasa Genetika. Yogyakarta: Pusat Antar Universitas-

Bioteknologi UGM.

Bassiri, A. E. 2011. pGLO Mutagenesis: A Laboratory Procedure in Molecular

Biology for Biology Students. Jurnal BAMBED, (39) 6: 432-439.

Casali, N. dan Preston, A. 2003. E. coli Plasmid Vectors: Methods And

Application. New Jersey: Humana Press.

Choi, J. H. dan Lee, S. Y. 2004. Secretory And Extra Cellular Production of

Recombinant Proteins Using Escherichia coli. Applied Microbiology and
Biotechnology, (64) 5: 625–635.

Das, S. dan Dash, H. R. 2015. Microbial Biotechnology A Laboratory Manual For

Bacterial System. India: Springer New Delhi.

Davis, L. dkk. 1994. Basic Methods: Molecular Biology. Norwola: Applent &
Lange.

Gaffar, S. 2010. Produksi Protein Rekombinan Dalam Sistem Ekspresi Pichia

pastoris. Bandung: UNPAD Press.

Girindra, A. 1993. Biokimia I. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Hardianto, D. dkk. 2012. Transformasi Plasmid PTRLI Dengan Teknik

Elektroporasi Pada Aspergillus terreus Dan Uji Stabilitas Transforman.
Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia, (14) 1: 24-28.

Henunili, V. 2013. Genetika Molekular. Yogyakarta: Diktat Kuliah FMIPA Jurdik

Biologi Universitas Negeri Yogyakarta.
Istianah, N. A. dkk. 2018. Teknologi Bioproses. Malang: UB Press.

Lueking, A. dkk. 2000. A System For Dual Protein Expression In Pichia pastoris
And Escherichia coli. Protein Express Purif, (20) 3: 372-378.

Makrides, S. C. 1996. Strategies For Achieving High-Level Expression Of Genes

In Escherichia coli. Microbiol Reviews, (60) 3: 512-538.

Maksum, I. P. dkk. 2017. Extracellular Secretion of Recombinant Human

Epidermal Growth Factor By Using Trimethylamine N-Oxide Reductase A
(TORA) Signal Peptide In Escherichia coli BL21 (DE3). Journal of
Pharmaceutical Sciences and Research, (9) 6: 1007–1016.

Maksum, I. P. dkk. 2019. Sistem Ekspresi Protein Rekombinan di Escherichia

coli Secara Ekstraselular. Sumedang: Alqaprint.

Marbach, A. dan Bettenbrock, K. 2012. Lac Operon Induction In Escherichia

coli: Systematic Comparison Of IPTG And TMG Induction And Influence Of
The Transacetylase LacA. Journal Biotechnol, (157) 1: 82-88.

Pujawati, A. S. P. dan Nawfa, R. 2016. Studi Produksi Plastik PHA dengan

Pengaruh Penggunaan Media Minimal Cair dan Glukosa oleh Ralstonia
pickettii. Jurnal Sains dan Seni ITS, (5) 1: 6-9.

Sword, W. E. 2003. Chemical transformation of E. coli. New Jersey: Humana

Press.

Syahputra, A. dkk. 2016. Komparasi Metode Isolasi DNA Patogen Antraknosa

dan Bulai untuk Deteksi PCR. Jurnal Fitopatologi Indonesia, (12) 4: 124-
132.

Tong, L. dkk. 2000. Extracellular Expression, Purification, and Characterization

of a Winter Flounder Antifreeze Polypeptide From Escherichia coli. Protein
Expression and Purification, (18) 2: 175–181.
Walker, J. M. dan Rapley, R. 2008. Molecular Biomethods Handbook. UK:
Humana Press

Watson, J. D. dkk. 1992. Recombinant DNA. USA: Scientific American Books.