Macam Macam Metode Blotting

1. Southern Blot
Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini mentransfer DNA ke
kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan
gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti
spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk
pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke
membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara
gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan
menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai
dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat
kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut. 

2. Northern Blot 
Northern Blot merupakan tekniknya sama dengan Southern Blot, namun menggunakan kertas
DBM dan biasanya mendeteksi RNA.

3. Eastern Blot
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), adalah proses transfer
bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik.

4. Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot sebagai olok-
olokan terhadap tekini southern blot yang pertama kali ditemukan.

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang
homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan
dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein
berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian
akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak
protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut. 

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran.
Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada
membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada
organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan
pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara
antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya
akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.

Langkah-langkah dalam Western Blot :

1) Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah
tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin. 

2) Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil. 

3) Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak 

Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan 

a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena : 

• Sinyal yang lebih baik 
• Spesifisitas yang lebih tinggi 
• Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot 

b. Antibodi Poliklonal 
- Mengenali lebih banyak epitop 

4) Melisis Sel 
Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis sel
dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah sebuah protein yang
terfosforilasi, maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut
tidak dibuang. Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin
dengan menggunakan kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung
eppendorf, jaga agar tetap dingin. 

5) Gel Elektroforesis 
Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel
electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik.
Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi
polipeptida setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya.
Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker.
Protein sampel akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak
menuju elektroda positif melalui jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak
lebih cepat melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat
pada pita-pita yang tergambar pada tiap jalur. 

6) Transfer Gel 
Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus dipindahkan dari
gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di
atas gel, dan tumpukan kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan
merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya.