LAPORAN PRAKTIKUM DIAGNOSTIK MOLEKULER II

“Preparasi Sampel dan Isolasi DNA untuk Deteksi Gen GAPDH pada
Sampel Jaringan”

Dosen Pengampu:

Ahmad Fahrurrozi, S.Si., M.Sc

Puji Lestari, S.Si M.Biotech

Disusun Oleh:

Tasya Regita Maharani P3.73.34.2.18.036

POLTEKKES KEMENKES JAKARTA III

DIV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS SEMESTER V

TAHUN AJARAN 2020/2021

 I. Judul Praktikum
Preparasi Sampel dan Isolasi DNA untuk Deteksi Gen GAPDH pada Sampel Jaringan

II. Waktu Pelaksanaan Praktikum

Hari dan Tanggal : Rabu, 10 Februari 2021
Pukul : 08.30 - 11.50
Tempat : Lab.Biologi Molekuler Lt.5, Gedung Teknologi Laboratorium
Medis, Poltekkes Jakarta 3

III. Tujuan Praktikum

Mahasiswa dapat memahami dan mengetahui Prinsip kerja, Cara kerja dan Teknik
Preparasi sampel serta melakukan Isolasi DNA untuk Deteksi Gen GAPDH pada
Sampel Jaringan dengan menggunakan KIT Thermo Scientific Genomik GeneJET

IV. Pendahuluan
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai
macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi
DNA merupakan suatu teknik untuk memperoleh DNA murni yaitu tanpa adanya
protein maupun RNA dalam suatu sel dalam jaringan. Molekul DNA dapat diekstraksi
atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA
melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk melindungi DNA
dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga yaitu : Penghancuran (lisis sel) → Ektraksi (Pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein) → Pemurnian DNA (Corkill dan
Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam
proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan
seperti protein dan RNA.
Secara prinsip, teknik ekspresi gen apapun berusaha untuk menghitung
kuantitas dari transkrip mRNA di dalam sebuah sampel biologis. Sebagaimana
diketahui, kuantitas tersebut ditentukan oleh aktivitas transkripsi yang mana kadarnya
berbeda untuk jaringan yang berbeda. Oleh karena itu, normalisasi ekspresi gen dari
tiap sampel harus dilakukan. Normalisasi transkrip mRNA umumnya dilakukan
dengan mengukur rasio dari transkrip mRNA target dan mRNA total. Namun karena
lazimnya di dalam sel semua mRNA merupakan subyek vaasai dan efisiensi yang
 tergantung pada sel, kuantifikasi jumlah transkrip gen target dapat dilakukan dengan
membandingkan kuantitas dari transkrip gen yang relatif stabil di dalam sel, yaitu
gen-gen housekeeping. Gen-gen yang tergolong dalam
kelompok housekeeping paling dikenal di literatur adalah gliseraldehida-3-
fosfat (GAPDH), β-aktin, protein ribosom (RPL), ubiquitin (Ubi), β-tubulin (Tub),
18S RNA ribosom (18S rRNA) dan kinase fosfogliserat (PGK).
Pada praktikum kali ini, kami melakukan Isolasi DNA untuk Deteksi Gen
GAPDH pada sampel jaringan menggunakan KIT Thermo Scientific Genomik
GeneJET dengan sampel hati ayam dikarenakan sampel mudah didapat sehingga
mempermudah saat proses preparasi sampel.

V. Alat dan Bahan

a. Alat

No Nama Gambar
.
Mikropipet
1

2 Tip Steril

3 Microtube steril

4 Collection tube

5 Waterbath
 6 Mortar & Pastle

7 Microcentrifuge

8 Vortex

9 Wadah Limbah

10 Kit Thermo Scientific

Genomik GeneJET

11 Beaker Glass

b. Bahan

No Nama Gambar
.
Hati Ayam
1
 2 Digestion Solution

3 Proteinase K

4 RNAse

5 Larutan Lisis

6 Etanol 50%

7 Wash Buffer I

8 Wash Buffer II

9 Elution Buffer

VI. Cara Kerja

1. Gerus/gilingkan 5 mg sampel menggunakan mortal dan pastle. Cara lainnya,
potong jaringan menjadi potongan-potongan kecil atau hancurkan menggunakan
 homogenizer. Kemudian, masukkan sampel yang sudah dihancurkan ke dalam
tabung microtube 1,5 ml

2. Dipipet 180 μL Digestion Solution, dan tambahkan 20 μL Proteinase K.

Kemudian homogenisasi dengan vortex selama 15 detik

3. Diinkubasi sampel pada suhu 56°C selama 1 jam sambil sesekali di vortex selama
15 detik (Untuk waktu inkubasi sampel tergantung jenis sampel/jumlah sampel
yang digunakan. Semakin banyak jaringan yang digunakan maka semakin lama
waktu yang diperlukan karena lebih banyaknya sampel yang harus dilarutkan)
4. Dipipet 20 μL Larutan RNase A, lalu homogenisasi dengan vortex selama 15
detik dan inkubasi campuran selama 10 menit pada suhu kamar.

INKUBASI
SELAMA 10
MENIT

5. Dipipet 200 μL Larutan Lisis ke sampel, lalu homogenisasi dengan vortex selama
15 detik sampai diperoleh campuran yang homogen.

6. Dipipet 400 μL etanol 50 % dan homogenisasi menggunakan vortex selama 15

detik

7. Pindahkan semua cairan yang telah disiapkan ke kolom Pemurnian DNA Genom
GeneJET yang dimasukkan ke dalam tabung pengumpul. Lalu sentrifugasi selama
1 menit pada kecepatan 6000 × g. Buang tabung pengumpul yang berisi cairan,
kemudian diganti dengan ke tabung GeneJET yang baru.
8. Dipipet 500 μL Wash Buffer I (dengan etanol ditambahkan), kemudian centrifuge
selama 1 menit pada kecepatan 8000 × g. Buang cairan yang terdapat pada tabung
pengumpul dan tempatkan kembali kolom pemurnian ke dalam tabung
pengumpul.

9. Dipipet 500 μL Wash Buffer II (dengan etanol yang ditambahkan), kemudian

centrifuge selama 3 menit dengan kecepatan maksimum (≥12000 × g).
 Opsional : Jika larutan sisa terlihat di kolom pemurnian, kosongkan tabung
pengumpul dan putar kembali kolom selama 1 menit. dengan kecepatan maksimal

10. Dibuang tabung pengumpul yang berisi cairan dan pindahkan Kolom Pemurnian
DNA Genomik

11. Dipipet 200 μL Elution. Inkubasi selama 2 menit di kamar suhu dan centrifuge
selama 1 menit pada kecepatan 8000 × g

INKUBASI
SELAMA 2
MENIT

VII. Hasil Praktikum

VIII. Pembahasan
Tahap awal sebelum melakukan proses isolasi DNA dilakukan proses
preparasi sampel terlebih dahulu dengan menggunakan sampel hati ayam. Siapkan 5
gr hati ayam, lalu cuci hingga bersih. Selanjutnya, giling/potong menjadi bagian-
bagian kecil kemudian letakkan hati ayam ke dalam mortar dan haluskan
menggunakan pestle sampai benar-benar halus.
Pada saat isolasi DNA untuk Deteksi Gen GAPDH pada sampel jaringan
dengan menggunakan KIT Thermo Scientific Genomik GeneJET dilakukan beberapa
tahap yaitu lisis sel, washing, presipitasi dan resuspensi. Penambahan Digestion
Solution yang berfungsi membantu melisiskan membran. Lalu penambahan
Proteinase K yang berfungsi untuk mendenaturasi protein. Saat proses Inkubasi
dilakukan untuk mengoptimalkan kerja enzim lalu untuk waktu inkubasi sangat
bervariasi tergantung dengan jumlah serta sampel jaringan yang digunakan. Saat
Penambahan RNase yang berfungsi untuk mendegradasi RNA yang mengotori DNA.
Penambahan Lisis Sel yang berfungsi untuk menghancurkan protein yang
terdapat pada membran sel sehingga komponen-komponen di dalam sel rusak akan
keluar, yaitu RNA, DNA, lipid dan karbohidrat. Penambahan Etanol 50% yang
berfungsi untuk pengendapan DNA. Proses Sentrifugasi dilakukan untuk
menghilangkan kotoran seperti debris cell dan protein presipitat. Kemudian,
Penambahan Washing Buffer 1 yang berfungsi untuk menghilangkan residu protein
dan RNA. Penambahan Washing Buffer 2 berfungsi untuk mencuci strand DNA.
Dan penambahan Elution Buffer digunakan untuk menurunkan DNA dari membrane
silica. Silica sendiri memiliki peran sebagai pengikat DNA sehingga
kontaminan/pengotor dan protein yang ada didalam sampel tidak terikat.

IX. Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan suatu teknik untuk memperoleh DNA murni untuk
keperluan amplifikasi atau analisis DNA. Setelah dilakukan pratikum isolasi DNA
untuk Deteksi Gen GAPDH pada sampel jaringan dengan beberapa tahap yaitu lisis
sel, washing, presipitasi dan resuspensi dengan menggunakan KIT Thermo Scientific
Genomik GeneJET. Hasil isolasi dapat dinyatakan berhasil atau tidaknya apabila
sudah melakukan pembacaan hasil isolasi pada proses elektroforesis.
X. Referensi
MH Badrut Tamam. 2012. “Prinsip, Metode, Teknik Isolasi DNA”.
https://generasibiologi.com/2012/08/isolasi-dna.html (Diakses pada 14 Februari 2021)

Putranto, Riza Arief. 2014. Bogor. Kenapa Normalisasi Data Analisis Ekspresi Gen
Penting Untuk Memahami Fisiologi Tanaman Perkebunan
https://www.iribb.org/artikel/47-kenapa-normalisasi-data-analisis-ekspresi-gen-
penting-untuk-memahami-fisiologi-tanaman-perkebunan (Diakses pada 14 Februari
2021)

Maroloan, Aruan. Dewi Inderiati, dan Chairlan.2019. “Modul Praktek Diagnostik

Molekuler I”