Petunjuk Praktikum Teknik Dasar Riset Biomedik

ISOLASI DNA

Kontributor:
dr. Yogik Onky Silvana Wijaya, Ph.D.
Dr.rer.nat. Risky Oktriani, M.Biotech., M.Sc.

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN, KESEHATAN MASYARAKAT DAN
KEPERAWATAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2023

1
 ISOLASI DNA
A. Petunjuk umum
1. Mahasiswa wajib mengerjakan pre-test sebelum sesi praktikum yang telah diunggah di
eLOK sesuai jadwal dan menjadi salah satu poin penilaian praktikum. Link:
https://elok.ugm.ac.id/course/view.php?id=8835&notifyeditingon=1
2. Mahasiswa wajib membaca buku petunjuk praktikum Isolasi DNA
3. Mahasiswa diharapkan dapat melihat video isolasi DNA dengan link berikut:
https://youtu.be/YO3rHnZ2xkw
4. Mahasiswa wajib mengerjakan post-test setelah sesi praktikum yang telah diunggah di
eLOK sesuai jadwal dan menjadi salah satu poin penilaian praktikum. Link:
https://elok.ugm.ac.id/course/view.php?id=8835&notifyeditingon=1

B. Pendahuluan
Ekstraksi biomolekul seperti deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), dan
protein merupakan salah satu metode penting yang digunakan dalam bidang biologi molekuler.
Isolasi DNA merupakan langkah awal dari analisis biomolekular selanjutnya seperti
polymerase chain reaction (PCR), mutagenesis, hingga sub-cloning. Oleh karena itu,
mengetahui bagaimana cara melakukan isolasi DNA dengan baik dan benar memegang
peranan penting dalam keberhasilan eksperimen lanjutan (Tan dan Yiap, 2009).
Pada prinsipnya, organisme yang memiliki asam nukleat bisa dijadikan sebagai sumber
DNA untuk diisolasi, seperti bakteri, virus, hingga manusia. DNA dari organisme bisa diisolasi
dari dua komponen besar yaitu: chromosomal DNA yang berada di dalam nukleus dan extra-
chromosomal DNA yang berada diluar nukleus (plasmid, mitokondria, kloroplas atau cell-free
DNA) (Gu et al., 2020).
Pada sampel manusia, DNA bisa diisolasi dari berbagai sumber, misalnya darah, saliva,
sperma, biopsi jaringan ataupun folikel rambut (Ghatak et al., 2013). Pada prinsipnya untuk
mendapatkan hasil DNA yang maksimal dan berkualitas, maka proses isolasi DNA sebaiknya
dilakukan segera setelah pengambilan sampel darah. Namun, apabila tidak dapat segera
melakukan isolasi DNA, maka sampel darah dapat disimpan dengan memperhatikan suhu
penyimpanan dan lama simpan (Madisen L et al., 1987; Huang LH et al., 2017).
DNA masih dapat diekstraksi dari darah yang disimpan pada suhu -70°C selama >2 bulan
atau pada suhu 23°C selama kurang lebih seminggu. Namun, tentunya kualitas dan kuantitas
DNA yang dihasilkan akan menurun akibat penyimpanan. Riset melaporkan bahwa durasi
penyimpanan lebih mempengaruhi kuantitas DNA yang dapat dihasilkan sedangkan kualitas
DNA tidak banyak terpengaruhi. Penurunan kuantitas ini dikaitkan dengan banyaknya leukosit
yang lisis selama masa penyimpanan (Madisen L et al., 1987; Huang LH et al., 2017).
Proses isolasi DNA terbagi menjadi beberapa komponen penting, diantaranya: 1) lisis
struktur sel (dinding sel, membran sel dan membran nukleus) untuk membebaskan asam
nukleat, 2) pemisahan DNA dari senyawa biomolekul kontaminan lain (protein, lipid, sel debris,
fenol, ataupun metabolit sekunder), 3) presipitasi DNA, dan 4) pencucian dan elusi DNA.
Beberapa metode sering dipergunakan untuk mengisolasi asam nukleat, diantaranya
adalah Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction, Alkaline Extraction Method,

2
CTAB Extraction Method, dan Salting Out Method. Asam nukleat yang menjadi target harus
bebas dari kontaminan termasuk protein, karbohidrat, lipid, atau asam nukleat lainnya. Kualitas
dan integritas asam nukleat yang diisolasi secara langsung akan mempengaruhi hasil dari
penelitian (Tan dan Yiap, 2009).
Tingkat kemurnian dan integritas DNA yang telah diisolasi bisa diperiksa dengan
berbagai cara, salah satunya adalah dengan menggunakan spektrofotometer. Asam nukleat
dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang 260 nm (Tabel 1). DNA yang murni biasanya
memiliki rasio absorbansi 260/280 sekitar ~1,8-2.0. Rasio <1,8 dapat disebabkan oleh
kontaminasi protein atau fenol (Barbas et al., 2007; Thermoscientific).
Selain itu, rasio absorbansi 260/230 juga dapat dijadikan sebagai indikator kemurnian
sekunder dimana DNA dianggap murni apabila memiliki nilai rasio 260/230 sebesar ~2.0 – 2.2.
Rasio 260/230 yang rendah dapat mengindikasikan adanya kontaminasi garam EDTA (sisa
dari tabung koleksi darah), karbohidrat (pada isolasi dari tanaman), fenol, glikogen (biasa
digunakan sebagai pemberat molekul DNA) atau guanidin HCl (pada column-based kit isolasi)
yang memiliki absorbansi maksimum pada 230 nm (Barbas et al., 2007; Thermoscientific).

Tabel 1. Absorbansi maksimum asam nukleat dan kontaminan yang dapat mempengaruhi
kemurnian DNA hasil isolasi
Panjang gelombang Molekul/Senyawa Catatan
230 nm EDTA Sisa EDTA dari tabung koleksi
dengan antikoagulan
Karbohidrat Sering terjadi pada isolasi DNA
dari tanaman
Fenol Sisa reagen isolasi, pencucian
tidak adekuat
Glikogen Biasa digunakan sebagai
pemberat molekul DNA
Guanidin HCl Sering digunakan pada kit isolasi
berbasis column-spin
260 nm Asam nukleat DNA dan RNA target
280 nm Protein Sisa jaringan atau sel debris,
pencucian tidak adekuat
Fenol

Selain menggunakan spektrofotometer, kualitas DNA juga dapat ditentukan secara

kualitatif dengan menggunakan elektroforesis, dimana DNA dengan integritas tinggi akan
menghasilkan band yang jelas dan tidak ada smearing yang mengindikasikan terjadinya
fragmentasi DNA (Barbas et al., 2007; Stanzick KJ et al., 2023).

C. Tujuan pembelajaran
Pada akhir sesi praktikum, mahasiswa diharapkan mampu:
1. Memahami konsep dasar isolasi DNA
2. Melakukan isolasi DNA dan melakukan trouble shooting proses isolasi DNA

3
D. Protokol Isolasi DNA dari Darah menggunakan Wizard Promega Kit
1. Persiapan:
a. Persiapan diri:
i) Kenakan jas lab
ii) Gunakan glove
iii) Gunakan masker
b. Persiapan bahan:
i) Sampel darah dengan EDTA
ii) Wizard Promega Kit
iii) Isopropanol
iv) Etanol 70%
c. Persiapan alat:
i) Micropipet
ii) Yellow dan blue tip
iii) Mikrotub 1.5mL
iv) Sentrifus dingin
v) Vortex
vi) Tisu
vii) Stopwatch
d. Persiapan tempat:
i) bersihkan area kerja dengan etanol
ii) lapisi bench work dengan plastic wrap (optional)

2. Lisis Sel Darah Merah

a. Pipet 300µL darah dan 900µL larutan Cell Lysis ke dalam tube 1.5mL. Campur dengan
membolak-balikan tabung 5x
b. Inkubasi selama 10 menit di suhu ruang
c. Sentrifus 15.000x g selama 1 menit
d. Buang supernatan, lalu vortex pelet

3. Lisis Nukleus dan Presipitasi Protein

a. Tambahkan 300µL larutan Nucleic Lysis ke dalam pelet, campur dengan membolak-
balik 5x
b. Tambahkan 100µL larutan Protein Precipitation, vortex 20 detik
c. Sentrifus 15.000x g selama 4 menit

4. Presipitasi DNA dan Rehidrasi

a. Siapkan tabung baru berisi 300µL isopropanol
b. Transfer seluruh supernatan ke dalam tabung baru berisi isopropanol
c. Sentrifus 15.000x g selama 2 menit
d. Buang supernatan, lalu tambah 300µL etanol 70%
e. Sentrifus 15.000x g selama 2 menit
f. Aspirasi etanol dan keringkan pelet selama 10-15 menit.
g. Larutkan pelet dengan 50-100µL larutan DNA Rehydration kemudian panaskan pada
suhu 65oC selama 1 jam atau satu malam pada suhu 4oC
h. Hitung konsentrasi dan kemurnian DNA dengan nanodrop

4
E. Protokol Isolasi DNA dari Jaringan menggunakan Wizard Promega Kit
1. Persiapan:
a. Persiapan diri:
i. Kenakan jas lab
ii. Gunakan glove
iii. Gunakan masker
b. Persiapan bahan:
i. Sampel jaringan sebanyak 10-20mg (misalnya jaringan hepar atau otak)
ii. Wizard Promega Kit
iii. Isopropanol
iv. Etanol 70%
v. Glass beads
c. Persiapan alat:
i. Micropipet
ii. Yellow dan blue tip
iii. Mikrotub 1.5mL
iv. Sentrifus dingin
v. Vortex
vi. Tisu
vii. Stopwatch
d. Persiapan tempat:
i. bersihkan area kerja dengan etanol
ii. lapisi bench work dengan plastic wrap (optional)

2. Homogenisasi jaringan
a. Letakkan 10 – 20 mg jaringan ke dalam 1.5 mL microtube
b. Tambahkan 600 µL Nuclei Lysis Solution (dingin), letakkan di atas es
c. Homogenisasi dengan homogenizer selama 10 detik, 2 kali
d. Inkubasi lisat selama 15 – 30 menit pada suhu 65°C
e. Transfer ± 600 µL lisat ke dalam tabung mikrosentrifus baru
f. Tambahkan 3 µl RNase
g. Inkubasi 37°C selama 30 menit kemudian dinginkan hingga mencapai suhu ruang

3. Presipitasi Protein
a. Tambahkan 200µL larutan Protein Precipitation, vortex 20 detik
b. Sentrifus 15.000x g selama 4 menit
c. Protein akan terpresipitasi. Supernatan sekarang mengandung DNA.

4. Presipitasi DNA dan Rehidrasi

a. Siapkan 1.5 mL microtube baru berisi 600µL isopropanol.
b. Tambahkan 600µL supernatan kedalam mikrotube. Bolak-balik mmikrotube secara
perlahan hingga terlihat benang DNA.
c. Sentrifus 15.000x g selama 2 menit
d. Buang supernatan, lalu tambah 600µL etanol 70%
e. Sentrifus 15.000x g selama 2 menit
f. Aspirasi etanol dan keringkan pelet selama 10-15 menit.
g. Larutkan pelet dengan 50µL larutan DNA Rehydration kemudian panaskan pada suhu
65oC selama 1 jam atau inkubasi satu malam pada suhu 4oC
h. Hitung konsentrasi dan kemurnian DNA dengan nanodrop

5
F. Hasil dan Diskusi
Catat konsentrasi dan absorbansi DNA hasil isolasi. Tulislah laporan praktikum secara
individu yang memuat hal-hal berikut ini:
1. Halaman judul (identitas, judul laporan)
2. Prosedur kerja
3. Hasil
4. Diskusi.
Jawablah pertanyaan-pertanyaan berikut ini sebagai bahan diskusi dan pembelajaran.
1. Apa saja faktor yang mempengaruhi kualitas DNA pada isolasi DNA terutama dari
jaringan darah?
2. Apa saja faktor yang dapat menghambat luaran isolat DNA (DNA yield)? Bagaimana
cara mencegah hal tersebut?

6
Referensi
Barbas CF, Burton DR, Scott JK. dan Silverman GJ. 2007. Quantitation of DNA and RNA.
Cold Spring Harbor Protocols: Cold Spring Harbor, 11: 47
Ghatak S, Muthukumaran RB, Nachimuthu SK. 2013. A simple method of genomic DNA
extraction from human samples for PCR-RFLP analysis. J Biomol Tech, 24(4):224-231.
doi:10.7171/jbt.13-2404-001
Gu X, Yu J, Chai P, Ge S, dan Fan X. 2020. Novel insights into extrachromosomal DNA:
redefining the onco-drivers of tumor progression. Journal of experimental & clinical
cancer research : CR, 39(1), 215. https://doi.org/10.1186/s13046-020-01726-4
Huang LH, Lin PH, Tsai KW, et al. The effects of storage temperature and duration of blood
samples on DNA and RNA qualities. PLoS One. 2017;12(9):e0184692. Published 2017
Sep 19. doi:10.1371/journal.pone.0184692
Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, Crisp M, Hodes ME. DNA banking: the effects of storage
of blood and isolated DNA on the integrity of DNA. Am J Med Genet. 1987;27(2):379-
390. doi:10.1002/ajmg.132027021
Stanzick KJ, Simon J, Zimmermann ME, Schachtner M, Peterhoff D, Niller HH, Überla K,
Wagner R, Heid IM, Stark KJ. 2023. DNA extraction from clotted blood in genotyping
quality. Biotechniques, 74(1):23-29. doi: 10.2144/btn-2022-0061.
Tan SC dan Yiap BC. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present.
Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2009: 1-10.
Thermoscientific. Assessment of Nucleic Acid Purity. Diakses dari
https://medicine.yale.edu/keck/dna/protocols/tube/t042-nanodrop-spectrophotometers-
nucleic-acid-purity-ratios_407666_284_7035_v1.pdf pada 31 Januari 2023.
Wang TY, Wang L, Zhang JH, dan Dong WH. 2011. A simplified universal genomic DNA
extraction protocol suitable for PCR. Genet Mol Res, 10(1):519-25.