ISOLASI DNA PADA OTOT MENCIT DAN UJI KUANTITATIF DNA

LAPORAN PRAKTIKUM

Disusun untuk memenuhi Matakuliah Teknik Analisis Biologi Molekular

yang dibina oleh Ibu Dr.Umie Lestari, M.Si

Oleh
Kelompok 3/Offering G 2016

Alifa Aulia Ainayya 160342606292

Krismonik Dwi Maulida 160342606270
Miftahul Mufi Nadiroh 160342606244
Mochammad Abdul Hafidh 160342606252
Permata Windra Deasmara 160342606241

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULATAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Maret 2018
 A. Topik
Isolasi DNA dan Uji Kualitas DNA

B. Tujuan
Praktikum ini dilakukan dengan tujuan :
1. Mengisolasi DNA dari darah, dan memahami teknik pengisolasian DNA
daridarah.
2. Menguji kualitas DNA dari darah

C. Dasar Teori
Didalam inti sel suatu organisme, terdapat materi genetik. Materi genetik
ini harus mempunyai kemampuan untuk mengkode suatu informasi secara
spesifik dan menggandakan suatu informasi secara tepat (NCBI-Griffiths dkk:
2000). Contoh dari materi genetic adalah DNA/RNA, gen dan kromosom. DNA
dan RNA dimiliki oleh organisme prokariotik, sedangkan eukariotik hanya
memiliki RNA. DNA/RNA adalah informasi genetik yang dibentuk oleh asam
deoksiribonukleat untuk DNA atau Ribosanukleat untuk RNA (Solomon dkk
2005: 38). DNA manusia dan hewan biasanya diperoleh dari darah dan jaringan
dalam. Namun DNA juga dapat diektraksi darisemen, saliva, akar rambut, urine,
dan gigi (Medical Genomics 2004: 1). Namun demikian, bahan yang paling sering
digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah karena bahan tersebut relatif
mudah diperoleh (Siswanto et al,2016)
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi DNA dari suatu sel sebagai tahap
awal suatu analisis genetik. Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari
pengambilan sampel sel, pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA,
presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA (Gaikwad,2010: 2).
Kualitas DNA dapat diketahui dengan proses elektrophoresis gel
agarose,menggunakan pewarna Ethidium Bromida, sedangkan kemurnian DNA
dapatdiketahui berdasarkan hasil ba`gi nilai OD 260 terhadap nilai OD 280 yang
terbaca pada UV spektrophotometer (Sambrook, 1989).
 D. Alat bahan

No. Alat Bahan

1. Mikropipet Organ mencit yang akan diisolasi

2. Tip (Kuning, Biru, Putih) Larutan PbS

3. Mikrotube NTES lysis buffer (NaCl, Tris, EDTA, SDS

10%

4. Mortar Larutan PCIA (Phenol/Chloroform/Isoamyl

5. Pistil Alkohol 70%

6. Neraca Alkohol 100%

7. Centrifuge dH2O/TE Buffer

8. Gunting Protein Kinase K

9. Inkubator

10. Vortex

11. Cawan petri

12. Pinset

No. Bahan Fungsi

1. Larutan PbS Untuk mencuci organ yang akan digerus

2. NTES lysis buffer :

- NaCl Untuk menjaga isotonis DNA

- Tris Untuk menjaga pH DNA

- EDTA Untuk merusak membran sel dan nukleus

- SDS 10% Untuk merusak integrasi membran

3. Protein Kinase K Untuk pemurnian protein

4. PCIA Pelarut dan untuk mengendapkan protein

5. Alkohol 70% dan 100% Untuk mengendapkan DNA

6. TE buffer Menjaga agar DNA tetap dialisis

7. dH2O Untuk melarutkan DNA hasil isolasi

E. Prosedur
1. Prosedur larutan NTES Lysis Buffer

Disiapkan mikrotube 2 mL untuk menampung cairan NTES

Dimasukkan 20 µl 5M NaCl ke dalam mikrotube

Ditambahkan 50 µl 1 M Tris pH 8,0 kedalam mikrotube

Ditambahkan 100 µl 0,5 EDTA pH 8,0 ke dalam mikrotube

Ditambahkan 100 µl 10% SDS ke dalam mikrotube

Ditambahkan 730 µl dH2O ke dalam mikrotube

Ditambahkan 10 µl protein kinase ke dalam mikrotube

Dihomogenkan semua bahan dalam mikrotube dengan vortex

 2. Prosedur isolasi DNA

Sebanyak 0,3 gram sampel dipotong dan digerus dengan mortar dan pistil

Sampel dimasukkan pada mikrotube 2 ml

Ditambahkan 500 µl NTES lysis bufer pada sampel dan sebaikanya diinkubasi pada
suhu 50 ºC-60 ºC selama semalam

Ditambahkan 500 µl larutan Phenol/Chloroform/Isoamyl alkohol dengan perbadingan

25:24:1, dihomogenisasi dengan pipetting lalu dilanjutkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang

Dipindahkan aqueous phase (supernatan) pada tabung mikrotube baru (maksimal

sekitar 300-400 µL)

Ditambahkan 500 µL 100% alkohol dan membolak balikkan tabung mikrotube secara
perlahan (5-10 kali)

Dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang,
kemudian supernatan dibuang

Dicuci DNA pelet dengan 500 µL 70% alkohol dan disentrifugasi pada kecepatan
13000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang

Dikeringkan tabung mikrotube setelah membuang sisa alkohol 70% dalam tabung
selama 20-30 menit

Dilarutkan DNA hasil isolasi dengan 10-20 µL dH2O atau TE buffer lalu dilanjutkan
dengan kuantifikasi DNA pada Nanodrop
 3. Prosedur Nanodrop

Dinyalakan komputer

Diklik software Nanodrop spektrofotometer yang ada pada dekstop komputer

Dibersihkan area kuvet Nanodrop dengan memasukkan 3 µL aquades dan ditunggu

selama 3 menit

dibersihkan area kuvet dengan menggunakan kertas lensa hingga bersih

Disiapkan sampel yang akan diukur konsentrasi dan kemurniannya

Dimasukkan 1 µL buffer pelarut sesuai dengan sampel yang diukur

Diklik "blank" kemudian dibersihkan area kuvet dengan menggunakan kertas lensa
hingga bersih

Diberi nama kode sampel

Dimasukkan 1 µL sampel hasil isolasi lalu diklik "measure"

Dipilih area simpan file kemudian diklik "save"

Dianalisis grafik yang dihasilkan kemudian dibersihkan area kuvet dengan kertas lensa
hingga bersih

Dibersihkan area kuvet Nanodrop spektrofoometer dengn memasukkan 3 µL aquades

steril dan ditunggu selama 3 menit
 F. Hasil Pengamatan
Organ yang digunakan adalah organ otot mencit

Nucle
Date 260 260 Samp
N Samp User ic Uni A26 A28 Facto
and /28 /23 le
o le ID name Acid t 0 0 r
Time 0 0 type
Conc.

1. DNA Nano 2/03/2 288,6 ng/ 5,77 4,67 1,2 1,4 DNA 50,00
_3 Drop 018 µL 1 5 3 4
2000 9:12:3
9 AM

G. Analisis Data

Berdasarkan hasil uji kuantitatif DNA menggunakan Nanodrop

spektrofotometer, sampel otot mencit yang telah diisolasi memiliki nilai
konsentrasi asam nukleat sebesar 288,6 ng/µL dengan nilai kemurnian yang
didapat pada gelombang 260/280 sebesar 1,23 sedangkan pada gelombang
260/230 sebesar 1,44.

H. Pembahasan

Bedasarkan analisis data diperoleh bahwa hasil uji kuantitatif DNA hasil
isolasi didapatkan konsentrasi asam nukleat sebesar 288.6 ng/µl. DNA yang dapat
terukur yaitu sebesar 4,675 ng/µl yang terlihat pada panjang gelombang 280 nm
dan kontaminasi protein yang terukur yaitu sebesar 5,771 ng/µl pada panjang
gelombang 260 nm, sehingga didapatkan hasil kemurnian DNA sebesar 1,23
ng/µl. Bedasarkan hasil uji kuantitatif dengan Nanodrop Spektofotometer UV-Vis
bahwa DNA hasil isolasi terkontaminasi protein karena nilainya kurang dari 1,8
(Larasati,2011). Hasil konsentrasi dan kemurniaan DNA kurang dari rentangan
DNA murni karena konsentrasi hasil ekstraksi pada waktu ekstraksi dan
komposisi penambahan lisis buffer. Factor kecepatan ekstraksi merupakan factor
paling berpengaruh karena pada tahap lisis sel dan pada saat pengambilan
supernatant terdapat DNA yang mengendap. Selain itu, pada saat pemisahan DNA
dari protein dengan penambahan isoamyl alcohol dan proses sentifugasi protei
tidak benar-benar terlepas dari ikatan DNA sehingga pada saat pengukuran
konsentrasi DNA, DNA tetap terkontaminasi protein (Eknath et al, (1991) dalam
Wahyudi (2001). Faktor lain yang memicu hasil pada isolasi DNA menggunakan
Nanodrop kontaminasi protein adalah, karena Kontaminasi DNA oleh protein
yang tinggi disebabkan oleh kerusakan sampel darah yang akan digunakan
mengalami aglutinasi menurut (Kusumawaty, 2014).

I. Kesimpulan

 Hasil konsentrasi menunjukakan sampel yang diperoleh terkontaminasi

oleh protein.
 Hasil konsentrasi dan kemurniaan DNA kurang dari rentangan DNA
murni karena konsentrasi hasil ekstraksi pada waktu ekstraksi dan
komposisi penambahan lisis buffer.
 DAFTAR RUJUKAN

Gaikwad, A.W. 2010. DNA extraction: comparison of methodologies. 6

hlm.(Online),
(http://www.nbpgr.ernet.in/Portals/6/DMX/GENOMIC_RESOURCES/D
NA%20extraction-Comparison%20of%20methodologies.pdf). Diakses 4
Desember 2017.
Kusumawaty, Diah M.Si,. 2014. Isolasi DNA Skala Kecil (Buah, Daging, Darah,
Bakteri). UPI: Pendidikan Biologi.

Larasati, P. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas.(online), diakses

tanggal 8 Maret 2018.

Medical Genomics. 2004. What can be the source of DNA. 1 hlm. (online).
(http://www.medicalgenomics.co.uk/DNAsources.html.). Diakses 4
Desember 2017.
NCBI. 2000. Buku: An Introduction to Genetic Analysis. 7th ed. 1 hlm. (online).
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22104/).Diakses 4 Desember
2017.
Siswanto, Jo Edy ., Berlian, Tiara ., Putricahya,Evira.,Lidya V. P, Yuniani,Luluk.
2016. Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi
Penderita ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks
Kemurnian
Sambrook, J .E .F, Fritisch and T. Maniatis, 1989 . Molecular Cloning. A
Laboratory manual 2nd Ed . Cold Spring Harbor Laboratory Press .
Analysis and Cloning of Eukaryotic Genomic DNA, 9 .19 .
Solomon, E. P., D. W. Martin, & L. R. Berg. 2005. Biology. 8th ed. Thomson
Corporation, Belmont, USA: 1379 hlm.
Wahyudi, D. 2001. Uji Kuantitatif DNA.(online), diakses tanggal 8 Maret 2018.
 LAMPIRAN

Proses Sentrifugasi Pengambilan

Supernatan yang
supernatan yang
mengandung DNA
mengandung Dna
menggunakan
Mikropipet

Hasil sampel DNA

Proses pengujian
yang didapatkan ( Pengoprasian
kemurnian DNA
DNA pelet ) komputer untuk
menggunakan
melihat hasil
Nanodrop
pengujian

Data yang didapatkan