ISOLASI DAN UJI KUANTITATIF DNA DARI DARAH AYAM

LAPORAN PRAKTIKUM

Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Teknik Analisis Biologi Molekuler

yang dibina oleh Hendra Susanto, S.Pd, M.Kes, Ph.D

Oleh:
Kelompok 3 / Offering G
Afif Qoiri Putri (160342606250)
Devi Ayu Mandasari (160342606249)
Muly Pramesti (160342606245)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI BIOLOGI
Maret 2018
A. TOPIK
Isolasi dan Uji Kuantitatif DNA dari Darah Ayam

B. TANGGAL PRAKTIKUM
Hari dan Tanggal : 1) Isolasi DNA dari Darah Ayam
Senin, 19 Februari 2018
2) Uji Kuantitatif Hasil Isolasi DNA dari Darah
Ayam
Senin, 26 Februari 2018
Waktu Kegiatan : Pukul 13.10 – 17.20 WIB
di Laboratorium Biologi Molekuler FMIPA UM

C. TUJUAN
Tujuan diadakan praktikum Isolasi dan Uji Kuantitatif DNA dari Darah
Ayam adalah mahasiswa dapat:
1. Untuk mengetahui cara isolasi DNA dari darah ayam.
2. Untuk mengetahui cara mengukur kuantitas hasil isolasi DNA dari darah
ayam dengan menggunakan alat nanodrop spektrofotometer.
3. Mendeteksi ada/tidaknya kontaminasi protein dengan melihat nilai
kemurnian DNA menggunakan alat nanodrop spektrofotometer.

D. DASAR TEORI
Menurut Watson (2013), penelitian menyatakan bahwa DNA
merupakan molekul genetik utama yang membawa seluruh informasi
keturunan pada kromosom, yang secara langsung terfokuskan pada
strukturnya. DNA memiliki susunan double-helix yang terdapat rantai
polideoksinukleotida. Kedua strand dari double-helix akan mengalami
denaturasi apabila terkena suhu yang tinggi, pH ekstrim, atau berbagai
perlakuan yang dapat merusak ikatan hdrogen. Sehubungan dengan
perubahan kondisi sel menjadi normal, maka strand tunggal yang mengalami
denaturasi akan secara spesifik terhubung kembali.
Menurut Klug & Cummings (1994): Raven & Johnson (2002),
struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan
DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Menurut
Listyorini, dkk (2015), organisme eukariot menyimpan DNA di dalam inti
sel. Terdapat dua cara isolasi DNA, yaitu cara sederhana/konvensional dan
cara yang mutakhir dengan dasar pada kedua metode isolasi DNA tetap
melalui tahap yang sama. Secara garis besar, prinsip isolasi DNA melalui
tahap-tahap yaitu mengisolasi jaringan, melisiskan dinding dan membran sel
untuk mengeluarkan isi sel, melisiskan protein membran, protein sitoplasmik,
maupun protein nukleolar, dan terakhir presipitasi DNA untuk memisahkan
dari material sel yang lain. Metode sederhana akan menghasilkan DNA
“kotor” dan dapat dengan mudah dilihat dengan mata telanjang, sedangkan
metode mutakhir akan menghasilkan DNA murni yang terlarut di dalam
pelarutnya.
Menurut Listyorini, dkk (2015), pemeriksaan kualitatif DNA dapat
dilakukan dengan elektroforesis. Melalui teknik ini akan diketahui apakah
diperoleh DNA atau tidak, namun tidak bisa diketahui jumlah yang pasti dari
DNA yang diperoleh. Pemeriksaan secara kuantitatif dapat dilakukan dengan
menggunakan nanodrop spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm.
Untuk mengetahui kemurnian DNA yang diperoleh maka dilakukan juga
pengukuran pada panjang gelombang 280 nm. Rasio jumlah DNA pada
260/280 nm yang lebih kecil dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi RNA,
sedangkan rasio lebih dari 2 menunjukkan adanya kontaminasi protein.
E. ALAT DAN BAHAN

E.1 Tabel Alat dan Bahan

Alat : Bahan :
1. Hasil ekstraksi darah ayam
1. Nanodrop Spektrofotometer 2000
2. KIT (Tissue lytic, binding buffer,
Thermoscientific
proteinase-K, Isopropanol,
2. Komputer
Inhibitor Removal Buffer, Wash
3. Mikropipet (0,5 µl – 10 µl)
buffer, Buffer elution)
4. Mikropipet (20 µl – 200 µl)
3. Aquades steril
5. Mikropipet (100 µl – 1000 µl)
4. Tissue
6. Mikropistil
5. Tip mikropipet
7. Vortex
6. Eppendorf
8. Waterbath
7. High Pure filter tube
9. Sentrifus
8. Collection tube
10. Freezer
9. TE Buffer

E.2 Fungsi Alat dan Bahan

E.2.1 Alat
1. Nanodrop Spektrofotometer 2000 Thermoscientific : Menguji kuantitas DNA.
2. Mikropipet (0,5 µl – 10 µl) : Mengambil larutan dalam rentang 0,5 µl – 10 µl.
3. Mikropipet (20 µl – 200 µl) : Mengambil larutan dalam rentang 20 µl – 200 µl.
4. Mikropipet (100 µl – 1000 µl) : Mengambil larutan dalam rentang 100 µl –
1000 µl.
5. Komputer : Membaca hasil analisis uji kuantitatif DNA .
6. Mikropistil : Menghomogenkan larutan secara manual.
7. Vortex : Menghomogenkan larutan dengan kecepatan tertentu.
8. Waterbath : Menghomogenkan larutan dengan rentang suhu 5oC -
40oC.
9. Sentrifus : Memisahkan partikel berdasarkan ukuran (pellet,
supernatan).
10. Freezer : Menyimpan dan menjaga sampel pada suhu rendah.
E.2.2 Bahan
1. Hasil ekstraksi darah ayam : Sampel untuk mengisolasi DNA.
2. KIT Tissue lytic : Melisiskan sel-sel darah ayam.
3. KIT Binding buffer : Memisahkan ikatan antar membran sel darah
ayam.
4. KIT Proteinase-K : Menginaktivasi protein-protein pada sel darah ayam.
5. KIT Isopropanol : Mempercepat presipitasi DNA.
6. KIT Inhibitor Removal Buffer : Merusak komponen kontaminan presipitasi
DNA.
7. KIT Wash buffer : Menghapus residu membran sel.
8. KIT Ellution buffer : Melepaskan asam nukleat keluar dari membran sel
9. Aquades steril : Mengkalibrasi kuvet dan mensterilkan alat.
10. Tissue : Membersihkan alat.
11. Tip : Mengambil larutan.
12. Eppendorf : Menampung larutan.
13. High Pure Filter tube : Menampung larutan hasil sentrifus (filtrat yang
dipakai).
14. Collection tube : Menampung larutan hasil sentrifus (yang tidak dipakai).
15. TE Buffer : Pelarut DNA untuk melindungi dari degradasi.

F. PROSEDUR KERJA
Isolasi DNA dari darah ayam
Mengambil sisa alkohol pada tube yang digunakan untuk menyimpan
sampel darah.

Menambahkan 100 µl Tissue Lytic

Menghomogenkan secara mekanik menggunakan mikropistil

Menambahkan 100 µTissue Lytic

Menghomogenkan secara mekanik menggunakan mikropistil

Menambahkan 200 µl Binding Buffer

 Menambahkan 40 µl Proteinase K

Memvortex (hingga larutan bening)

Menginkubasi selama 30 menit pada suhu 70C dengan menggunakan

waterbath dan memvortex tiap 10 menit

Menambahkan 100 µl Isopropanol dan memvortex segera

Memasukkan campuran ke dalam high pure filter tube

Mensentrifus 8000 x g (9200 rp) selama 1 menit

Membuang flow through dan collection tube

Memasangkan filter tube pada collection tube yang baru

Menambahkan 500 µl Inhibitor Removal Buffer

Mensentrifus 8000 x g (9200 rp) selama 1 menit

Membuang flow through dan collection tube

Memasangkan filter tube pada collection tube yang baru

Menambahkan 500 µl Inhibitor Wash Buffer

Mensentrifus 8000 x g (9200 rp) selama 1 menit

 Membuang flow through dan collection tube

Memasangkan filter tube pada collection tube yang baru

Menambahkan 500 µl Inhibitor Wash Buffer

Mensentrifus 8000 x g (9200 rp) selama 1 menit

Membuang flow through dan collection tube

Memasangkan filter tube pada collection tube yang baru

Mensentrifus 13.000 rpm selama 10 detik

Membuang flow through dan collection tube

Memasangkan filter tube pada microsentrifuge baru

Menambahkan 100 µl Buffer Ellution (yang sudah diinkubasi pada suhu

70C) dan mendiamkan selama 1 menit

Mensentrifus 8.000 x g (9.200 rpm) selama 1 menit

Membuang filter tube

Memberi label pada tabung microsentrifuge

Menyimpan pada freezer dengan suhu antara -20C - 0C

Uji kuantitatif DNA

Menyalakan komputer

Mengklik software nanodrop spektrofotometer pada desktop komputer

Membersihkan area cuvet nanodrop spektrofotometer dengan memasukkan

3 µl aquades steril dan menunggu 3 menit

Membersihkan area cuvet menggunakan kertas lensa hingga bersih

Memilih jenis sampel yang akan diukur konsentrasi dan kemurniannya

Memasukkan 1 µl buffer pelarut sesuai dengan sampel yang diukur

Klik ‘blank’

Membersihkan area cuvet menggunakan kertas lensa hingga bersih

Memberi nama kode sampel

Memasukkan 1 µl sampel hasil isolasi

Klik ‘measure’

Memilih area simpan file dan klik ‘save’

Menganalisis grafik yang dihasilkan

Membersihkan area cuvet menggunakan kertas lensa hingga bersih

Membersihkan area cuvet nanodrop spektrofotometer dengan memasukkan

3 µl aquades steril dan menunggu 3 menit
G. HASIL (DATA PENGAMATAN)
Kualitas DNA pada
Nama Sampel Tipe Sampel
gelombang 260/280 n
K1 1,86 ng/µl DNA
K2 1,88 ng/µl DNA
K3 1,87 ng/µl DNA
K4 1,89 ng/µl DNA

H. ANALISIS HASIL
Pengukuran kualitas DNA dilakukan menggunakan nanodrop
spektrofotometer 2000 thermoscinetific. Berdasarkan pengukuran kualitas DNA,
diperoleh hasil kualitas DNA dari 4 sampel tersebut yaitu K1 sebesar 1,86 ng/µl,
K2 sebesar 1,88 ng/µl, K3 sebesar 1,87 ng/µl, dan K4 sebesar 1,89 ng/µl. Sampel
merupakan hasil isolasi DNA dari darah ayam.

I. PEMBAHASAN
Praktikum isolasi DNA bertujuan untuk melatih ketrampilan mahasiswa
dalam mengisolasi DNA darah ayam serta mengetahui konsentrasi dan kemurnian
DNA yang telah diisolasi. Isolasi Pada dasarnya sel mengandung dua asam
nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA
kromosomal, DNA lain yang terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA
mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya disebut DNA
ekstrakromosomal (Fachtiyah, 2011). Isolasi DNA merupakan proses pemisahan
DNA dari komponen-komponen penyusun sel lainnya. Proses ini melibatkan
penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein, dan pemurnian
(purifikasi) DNA (Muladno, 2010).
Tahap pertama dalam isolasi DNA sampel darah ayam adalah dengan
menambahkan 100µL tissue lytic dan menghomogenkan secara mekanik dengan
mikropistil secara manual kemudian menambahkan 200µL binding buffer dan
menambahkan 40µL proteinase K dan divortex hingga larutan bening.
Penggunaan tissue lytic dalam praktikum ini adalah untuk menghancurkan atau
merusak membran sel atau jaringan secara kimiawi sedangkan homogenisasi
menggunakan mikropistil merupakan perusakan membran sel atau jaringan secara
fisik. Hal ini sesuai pernyataan Giocomazzi (2005) yang menyebutkan bahwa
terdapat beberapa cara untuk menghancurkan membran sel atau jaringan yaitu
dengan cara fisik, kimiawi dan enzimatik. Penghancuran membran secara fisik
dapat menggunakan mortar dan pestle (Giocomazzi, 2005). Penghancuran
mambran sel atau jaringan secara kimiawi dapat memanfaatkan senyawa kimia
yang dikombinasikan dengan EDTA (Subandiyah, 2006). Penghancuran secara
enzimatis dengan menambahkan proteinase K yang bertujuan untuk melisikan
membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein
globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki, 2000).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari protein. Penambahan
100µL isopropanol yang bertujuan untuk mempresipitasi DNA sehingga
terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Surzycki, 2000). Prinsip-prinsip
presipitasi antara lain, yang pertama yaitu menurunkan kelarutan asam nukleat
dalam air, isopropanol merupakan pelarut yang lemah bagi asam nukleat, yang
kedua adalah penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam
larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi, yang ketiga adalah penggunaan
isopropanol akan menurunkan aktivtas molekul air sehingga memudahkan
presipitasi DNA (Surzycki, 2000). Pada tahap presipitasi ini, DNA akan terpisah
dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Penambahan 500 µL
inhibitor removal buffer, 500µL wash buffer dua kali (dilakukan dua kali untuk
memperkecil DNA dari kontaminan protein) serta penambahan 100µL buffer
ellution bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa
dan untuk membilas serta meloloskan DNA (Rahmawati, 2012). Hasil presipitasi,
yaitu endapan (pellet) dan supernatant akan dipisahkan.

Tahap ketiga dari isolasi DNA adalah pengukuran isolat DNA. Isolat DNA
yang dihasilkan akan diukur konsentrasi kemurniannya menggunakan alat
nanodrop spektrofotometer pada panjang gelombang 260/280 nm. Pengukuran
nilai konsentrasi dan kemurnian DNA didasarkan pada prinsip iradiasi sinar
ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam isolat. Secara maksimal
penyerapan iradiasi oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm
(Muladno, 2010). Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian isolat DNA darah
ayam dari kelompok 3 adalah 1,87 ng/µL yang berarti sampel tersebut murni
(terbebas dari kontaminasi protein maupun RNA) yang sesuai dengan pernyataan
Suharsono dan Widyastuti (2006) yang menyebutkan rasio kemurnian DNA pada
panjang gelombang 260 nm / 280 nm terletak antara 1,8-2,0. Hasil lain juga
ditunjukkan oleh kelompok 1 sebesar 1,86 ng/µL, kelompok 2 sebesar 1,88 ng/µL,
dan kelompok 4 sebesar 1,89 ng/µL yang menunjukkan bahwa dari keempat
sampel tersebut murni (terbebas dari kontaminasi).

J. KESIMPULAN
1. Isolasi DNA dilakukan dengan 3 cara, yaitu perusakan sel atau jaringan
pada sampel darah ayam, pemisahan DNA dari komponen penyusun
lainnya serta pengukuran konsentrasi dan kemurnian isolat DNA sampel
darah ayam.
2. Konsentrasi dan kemurnian isolat DNA sampel darah ayam adalah 1,87
ng/µL yang berarti sampel tersebut murni (terbebas dari kontaminasi
protein maupun RNA). Hasil uji kuantitatif lain dari kelompok 1 sebesar
1,86 ng/µL, kelompok 2 sebesar 1,88 ng/µL, dan kelompok 4 sebesar 1,89
ng/µL.
3. Dari keempat sampel yang diuji menunjukkan sampel tersebut murni
(terbebas dari kontaminasi).
 Daftar Rujukan

Fatchiyah, Aumingtyas EL, Widyarti S, & Rahayu S. 2011. Biologi Molekuler:

Prinsip Dasar Analisis. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Giacomazzi, et al. 2005. Medium Range Structural Properties Of Vitereus

Germania Obtained Through First Principles Analys Of Vibrational Spectra.
Phys. Rev. let 95, 075505.

Khosravinia, et al. 2007. Optimazing Factors Influencing DNA Extraction From

Fresh Whole Avain Blood. African Journal Of Biotechnology. Vol 6(4). Paper
481-486.

Klug, W.S. & Cummings, M. R. 1994. Concepts of Genetics. Englewood Cliffs:

Prentice-Hall Inc., 315-316.

Listyorini, D., dkk. (2015). Teknik Analisis Molekuler Genetik: A Work Book.
Universitas Negeri Malang: IKIP Malang.

Muladno. 2010. Teknologi rekayasa genetika. Edisi kedua. Bogor: IPB Press.

Rahmawati, Putri. 2012. Analisis Daging Babi pada Produk Dendeng Sapi yang
Beredar di Wilayah Ciputat Dengan Metode Amplifikasi DNA Menggunakan
Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Raven, P.H. & Johnson, G.B. 2002. Biology. Edisi 6. New York: McGraw-Hill
Companies, Inc.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction Untuk Deteksi Atau Identifikasi

Patogen Tumbuhan: Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan
workshop identifikasi DNA dengan aplikasi PCR. Malang. Hal 22-25.

Suharsono, Widyastuti U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik

Pengklonan Gen. Bogor: Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati Dan
Bioteknologi IPB.

Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniquesin Molecular Biology. Springer-Verlag

Publisher ISBN 3-540-66678-8
Watson, J.D., dkk. 2015. Molecular Biology of The Gene. Edisi 7. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Lampiran

Hasil pengukuran menggunakan nanodrop

spektrofotometer