LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS PANGAN

UJI PCR DAN DNA

Dosen Pengampu : Dr. Titik Budiati, S.TP,MT,M.Sc

Teknisi :1. Widya Rahmawati, S.Si.

2. Wahyu Setiaji Dwiantara S.Si

Disusun Oleh :

MUHAMMAD YOGA GUSTI KURNIAWAN

(B41222208)

Golongan D

KEMENTERIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN, RISET DAN TEKNOLOGI

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI REKAYASA PANGAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN

POLITEKNIK NEGERI JEMBER

2022
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Komponen utamakromosom padaeukariotaadalah molekul DNAdanprotein

histon.Proteinhistonini bersifatbasa,sehinggadapatmenetralkansifatasamdari DNA.
Padadasarnyaselmengandung duaasamnukleat,yaituRNAdanDNA. DNA yang
dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang terdapatdalam
seldiluar nukleusyaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas,DNA plasmid,
ketiganyadisebut DNA ekstrakromosomal.

DNA adalah asamnukleatyang mengandung materigenetik danberfungsi

untukmengatur perkembangan biologisseluruh bentukkehidupan. DNA terdapat
dinukleus,mitokondria,dankloroplas.Adaperbedaandiantaraketigalokasi
DNAini,yaitu:DNAnukleusberbentuklineardanberhubungansangaterat
denganproteinhiston,sedangkanDNA mitokondria dankloroplas berbentuk
sirkulardan tidak berhubungan dengan protein histon.

DNAmemilikistruktur helixutasganda,yang mengandung komponen-

komponen gula pentosa,gugusfosfat,danpasanganbasa nitrogen. Satusel memiliki
DNAyang merupakan materigenetik dan akan diturunkan pada keturunannya.

Langkahpertama untukmendapatkanDNAbaikuntukkepentingan rekayasa

genetika,forensikmaupunmolekularlainnyatahapawalyangakandilakukan
yaituekstraksiDNA, ReaksiBerantaiPolimerasedan Electroforesisyangakan di
praktekkan padapraktikum kali ini.

1.2. Tujuan

1. Mengetahui metode umum mengisolasi DNA bakteri coliform

2. Memahami metode ekstraksi DNA bakteri coliform
3. Mengetahui dan memahami Metode PCR
4. Mengetahui dan memahami prinsip dasar metode Elektroforesis
Agarose
 BAB II

ALAT DAN BAHAN

2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu:
1. Micropipette 0.5-10 µl, 10-200 µl, 100-1200 µl.
2. Pipette Tips 10 µl, 200 µl, 1000 µl.
3. Microtube 1.5 mL, 0.5 mL.
4. Sentrifuge
5. Incubator
6. Waterbath
7. Beaker glass

2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu:
 Ekstraksi DNA
1. Kultur Bakteri
2. Nuclei Lysis Solution
3. RNase
4. Protein Precipitation Solution
5. Isopropanol Alkohol
6. Etanol 70%
7. Rehydration Solution

 PCR gen 16S rRNA

1. GoTaq
2. Primer CTAGAATCC
3. Sampel
4. Nuclease Free Water

 Elektroforesis
1. Gel Agarosa 2%
2. Larutan buffer Tris-acetate EDTA (TAE)
3. Etilium Bromida (ETBR)
 BAB III

HASIL PENGAMATAN

NO Proses Gambar Keterangan

1. Ekstraksi DNA Pada gambar tersebut
merupakan sampel dna
yang telah dikestraksi dan
siap masuk ke tahapan
PCR.

2. PCR - -
3. ELEKTRO 1-9:1500
FORESIS 10:1000
11:900
12:800
13:700
14:600
15:500
16:400
17:300
18:200
 BAB IV

PEMBAHASAN

1.DNA

Isolasi DNA merupakan pemisahan molekul DNA dari komponen sel. Isolasi
DNA mempunyai dua prinsip, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Gaya sentrifugasi dan
perbedaan berat molekul menjadi prinsip kerja dari sentrifugasi, sedangkan pengendapan
DNA agar terpisah dari zat lain yang berada dalam sel menjadi prinsip kerja dari
presipitasi. Tahapan isolasi DNA secara umum yaitu sentrifugasi, inkubasi, presipitasi,
elusi, pencucian, dan pengeringan (Wahyuni, 2011).

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dindingdan
membran sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. Prinsip-prinsip
dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama
sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenismolekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. (Salonen ,et.all 2010).
Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Jumlah dan
kualitas DNA hasil ekstraksi bervariasi tergantung dari spesies mikroba sehingga perlu
dilakukan analisis lebih lanjut seperti hibridisasi DNA, pemotongan DNA dengan enzim
restriksi , dan analisis dengan polymerasechain reaction (PCR) (Pharmawati, 2009).

Ekstraksi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari komponen sel lainnya
seperti protein, karbohidrat, lemak dan lainlain. Ekstraksi DNA terdiri dari tiga tahap
utama yakni perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari komponen lainnya serta
pemurnian DNA (Corkill dan Rapley 2008). Pemecahan sel atau lisis pada proses
ekstraksi sel bertujuan untuk menghancurkan membran dan dinding sel sehingga bagian
dalam sel dapat keluar (Holme dan Peck, 1998). Selanjutnya tahap pemisahan DNA dari
makromolekul lain seperti protein, sebagian kecil RNA, lipid dan polisakarida (Muladno
2010). Tahap terakhir ialah pemurnian DNA. Tahap ini bertujuan untuk menghilangkan
residu dari zat yang digunakan pada tahap lisis dan pemisahan DNA.
Dalam melakukan ekstraksi DNA hal yang pertama dilakukan adalah Kultur
dipanen dalam tabung mikro dan disentrifugasi . Pada saat melakukan sentrifugasi jumlah
sampel harus dipasang berpasangan dan diletakkan sejajar berhadapan, hal ini untuk
menyeimbangkan saat terjadi proses sentrifugasi dan pellet yang didapatkan pun akan
lebih baik dibandingkan dengan sentrifugasi yang tidak berpasangan. Setelah
disentrifugasi didapatkan pelet(hasil dari pemisahan berat molekul oleh gaya sentrifugal).
kemudian buang super natan dan homogenkan dengan nucleilisis. Nucleilisis berfungsi
untuk merusak sel-sel bakteri sehingga akan melemahkan dinding sel bakteri dan akan
mengalami lisis dalam lingkungan hipotonik. Setelah itu inkubasi sampel bakteri pada
suhu 80 derajat celcius selama 5 menit . setelah diinkubasi tambahkan enzim ribo
nuklease yang berfungsi untuk  mendepolarisasi RNA (asam nukleat).kocok campuran
tersebut . Kemudian di inkubasi selama 15 menit pada 37 derajat (Ghanem,et.all 2013).

2.PCR

PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu
secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu (Sambrook et al.,1989). Secara
ringkas, prinsip PCR dapat dijelaskan sebagai berikut : pada suhu 94-950C, DNA
mengalami denaturasi yang menyebabkan pemisahan untai ganda menjadi untai tunggal.
Waktu yang diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 950C atau 15 detik
pada suhu 970C. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida Guanin/Citosin
(G/C), suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan
menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama
dapat mempengaruhi kerja enzim Taq polymerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap
keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai sering sekali
dilakukan pre denaturasi selama 3-5 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
target yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi (Promega, 2001).

PCR dapat digunakan sebagai alternatif metode konvensional untuk

mendeteksi mikroba dalam pangan, air dan sampel lingkungan karena waktu
pengujian yang cepat dengan hasil yang lebih sensitif dan spesifik (Moganedi et al.,
2007).

Tahap pengujian dengan PCR umumnya terdiri dari isolasi DNA, denaturasi
DNA menjadi untai tunggal, annealing primer sekuens spesifik dan penyambungan siklus
polymerase 25 – 40. Hasil PCR adalah produk berupa 50-10000 bp bagian spesifik
genome yang dapat dianalisis dengan elektroforesis gel atau sekuensing DNA (Mufty,
2008).

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus
dan berlangsung dengan cepat :
1. Denaturasi
Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase
ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan
DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3
menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai
tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi
(membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya
proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas
enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2
jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC ( Yusuf,
2010 ).
 2. Annealing (penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa
primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk
kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer
itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan
mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi
efisiensi PCR.Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45
detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.Kisaran
temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36oC sampai dengan 72oC,
namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60oC ( Yusuf, 2010 ).

3.Pemanjangan Primer (Extention)

Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer
dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC
diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH,
konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR
dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap
perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk
tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan
terbentuk DNA untai ganda.Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30
kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai
ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih
banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya
siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran
reaksi.Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengamenggunakan
elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel
agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil pindah
dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif.Keunggulan
PCR dikatakansangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan
keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya mengamplifikasi
sehingga menghasilkan produk melalui sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi
karena DNA polymerase mampu menghindari kesalahan pada amplifikasi produk
( Yusuf, 2010 ).
Berdasarkan data pengamatan dengan acuan ukuran marker DNA 1,500 bp. Pada
sampel 4 dan 7 tidak ada cahaya yang muncul dimarker 1,500 bp,hal ini kemungkinan
saat pengambilan sampel DNA tidak terambil saat melakukan estraksi DNA,DNA kurang
terhomogen dengan sempurna sedangkan pada sampel lain menunjukkan cahaya yang
sesuai pada leadernya yaitu 1.500 bp. Yang artinya memang benar bahwa gen 16s rRNA.
Dalam pemanfaatannya, gen 16s rRNA banyak digunakan berbagai bidang
terkait,keuntungannya terutama dalam bidang identifikasi. Gen ini memiliki banyak
manfaat sehingga dijadikan gen penanda.
 BAB V

KESIMPULAN

Dapat disimpulkan bahwa pada saat dilakukan ekstraksi DNA untuk menghasilkan kemurnian
ekstrak DNA yang merupakan syarat untuk dilakukan uji PCR. Hasil pada PCR mendapatkan gen
16s rRNA, menggunakan gen ini karena sangat terkonservasi dan ada disemua organnisme.
Dilakukan elektroforesis gel agarose 2% dan mendapatkan 16s rRNA amplikasi 1,500 bp namun
ada yang tidak sesuai leader. Kemudian terjadin karena human eroe, tidak terambilnya DNA.
 DAFTAR PUSTAKA

Corkill, G., Rapley, R. (2008). The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools
&. Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition.

Ghanem, A., Healey, R., Adly, F.G. 2013. Current trends in separation of plasmid
DNAvaccines: A review. Analytica Chimica Acta .

Holme DJ, Peck H. 1998. Analytical. Biochemistry. Ed ke-3. Harlow (GB):.

Pearson Education Limited

Moganedi KLM, Goyvaerts EMA, VenterSN, SibaraMM. 2007.Optimisation of

the PCR-invAprimers for thedetection of Salmonella in drinking and
surfacewaters followingpre-cultivation step. WaterSA33, 196-202.

MuftyMM. 2008. Application of a real time PCR methode for detection of

Salmonella spp. in shrimp and scallop and its partial validation.
Fisheries Training Programme. TheUnited Nation University.Iceland.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika, Edisi Kedua. Bogor: IPB.

Newton, C.R. and A. Graham. 1994.PCR. UK: Bios ScientificPublisher.

Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada grevillea

spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi 13(1): 12-16. 

Promega. 2001. PCR Core System-Technical Buletin. Instruction for use of

Products M7660 and M7665. PromegaCorporation, Printed in USA.

Salonen, A., Nikkilä, J., Tuovinen, J.J., Immonen, O., Stojanović, M.R., K ekkonen,R.A.,
Palva, A., Vos, W.M.D. 2010. Comparative Analysis Of Fecal DNAExtraction
Methods With Phylogenetic Microarray:Effective Recovery OfBacterial And
Archaeal DNA Using Mechanical Cell Lysis. Journal of Microbiological Methods

Wahyuni,Tri.2011.Ekspresi Gen CSF3SYN Dengan Promotor Konstitutif pada

Pichia Pastoris

Yusuf,Z.K.,. (2010). Polymereaction Chain Reaction ( PCR ). Saintek , 5, 1-6.