Anda di halaman 1dari 20

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

ISOLASI DNA

Disusun Oleh:
Nama
NIM
Kelompok
Asisten

: Ahmad Idhan Rifaldi


: 135040201111345
: O2 Senin, 15.05-16.45 WIB
: Havinda

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Dalam sel makhluk hidup terdapat dua jenis asam
nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA merupakan materi
genetik yang mengkode semua informasi yang
dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organism. DNA ada dua macam, yaitu DNA kromosomal
dan DNA ekstrakromosomal.DNA ekstrakromosomal
seperti DNA mitokondria, DNA kloroplas dan DNA
plasmid.
Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu DNA yang tidak
terkontaminasi oleh protein, RNA atau sel dari suatu
jaringan. Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik
harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik
dan enzimatis. Hal ini disebabkan membran sel dari
membrane inti sebagian besar tersusun atas lipida.
1.2 Tujuan
Untuk mendapatkan DNA murni dengan
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak,
dan karbohidrat.
1.3 Manfaat
Agar mahasiswa dapat mengetahui tahapan isolasi
DNA, metode yang digunakan serta dapat mengetahui
bentuk dari DNA.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan mengeluarkan materi
DNA dari inti yang sebelumnya dinding sel harus
dipecahkan terlebih dahulu dengan cara mekanik
ataupun enzimatik
(Kartini, 2012).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA.Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan
sentrifugasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya.Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung
dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung
(Mader, 1993).
DNA isolation is the use of DNA for analysis or
manipulation usually requires that it is isolated and
purified to a certain extend (Wilson, 2010).
Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk
dianalisis atau dimanupilasi sehingga harus diisolasi
terlebih dahulu agar kandungannya murni.
2.2 Macam Metode Isolasi DNA
2.2.1Metode dengan Menggunakan Kit Ekstraksi DNA
(Wizard Genomic DNA Purufucation Promega)
Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan
oleh Promega Corporation dan telah teruji
hasilnya, namun disisi lain biaya yang dibutuhkan
cukup besar (Mulyani, 2013).

2.2.2 Metode CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl


Amonium Bromide) dengan Phenol
Metode ini memiliki waktu pengerjaan cukup
singkat dimana pada proses presipitasinya
digunakan penambahan P : C : I untuk
memisahkan DNA dengan materi ikutan lainnya
(Mulyani, 2013).
2.2.3 Metode Modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl
Trimethyl Amonium Bromide)
Metode ini memaksimalkan presipitasi DNA
dengan menggunakan C : IAA secara berulang
yakni dua kali untuk mendapatkan DNA yang
bebas dari pengotor. Nilai konsentrasi DNA yang
didapat relatif tinggi namun didalam
pengerjaannya dibutuhkan waktu yang relatif
lebih lama (Mulyani, 2013)
2.2.4 Metode Ekstraksi DNA dengan Thermal Lysis
Metode ini memiliki waktu pengerjaan yang
sangat singkat. Namun dalam pengerjaannya
tidak melibatkan proses presipitasi dan
pencucian DNA melainkan hanya melakukan
proses ekstraksi saja (Mulyani, 2013).
2.2.5 Teknik Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD)
Teknik pengujian polimofisme DNA
berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-

segmen DNA acak yang menggunkan primer


tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan
secara acak.Primer tunggal ini biasanya
berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu
annealing yang rendah yang memungkinkan
primer menempel pada beberapa lokus pada
DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah
terdiri atas 18-28 susunana basa dengan
presentase G + C 50-6-% (Subandiyah, 2006).
2.2.6 Slating Out
Teknik ini mneggunakan garam konsentrasi tinggi
(NaCl 6M), untuk mendenaturasi protein
menggunakan proteinasi K untuk denaturasi
protein
(Barnum, 2005).
2.2.7 Guanidine Isothiocyanate
Metode ini lenih cepat dibandingkan dua metode
sebelumnya. Thyocyanate bersifat toksik yang
berfungsi dalam melisis dinding sel. Juga
memerlukan chloroform untuk denaturasi protein
(Barnum, 2005).
2.2.8 Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantara
garam/buffer tertentu.Metode ini berlangsung
cepat, tetapi recovery DNA kurang
(Barnum, 2005).
2.2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Metode ini merupakan suatu teknik perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah

primer oligonukleotida.Primer yang dgunakan


sebagai pembatas daerah yang diperbanyak
adalah DNA untai tunggal yang urutannya
komplemen dengan DNA templatenya. Proses
tersebut mirip dengan proses replikasi DNA
secara in vivo yang bersifat semi konservatif
(Giri, 2004).
2.3 Tahap Isolasi DNA
2.3.1 Isolasi Jaringan
Tahap pertama yang dilakukan adalah
mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.
2.3.2 Pelisisan Dinding dan Membran Sel
Tahap kedua yaitu melisiskan dinding dan
membrane sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan
lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan
larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel
harus dilisiskan, karena substansi gen yang
diinginkan ada didalamnya.Penambahan larutan
pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang
tidak mengandung DNA agar sel yang
mengandung inti sel dapat diisolasi atau
dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya
yang tidak berfungsi.
2.3.3 Pengekstrasian Dalam Larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk
dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di
dalam larutan.Hal tersebut bertujuan agar
didapat ekstrak.

2.3.4 Purifikasi
Tahap purifikasi ini bertujuan untuk
membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat
lainnya.Pada larutan tersebut kemudian diberikan
RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada
suhu 65oC.Hal tersebut bertujuan untuk
mengoptimalkan kerja enzim yang sangat
dipengaruhi oleh temperature.Penambahan
RNAse berguna untuk menyingkirkan
kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi
secara utuh.
2.3.5 Presipitasi
Presipitasi merupakan tahap terakhir.
Tahap ini bertujuan untuk mengendapkan protein
histon sehingga untai-untai DNA tidak lagi
menggulung (coiling) dan berikatan dengan
protein histon, yang menyebabkan DNA dapat
terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara
meneteskan larutan presipitasi protein dan
kemudian divortex yang bertujuan untuk
menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi
protein terdiri atas ammonium asetat yang jika
berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan
lebih rendah, sehingga menyebabkan protein
mengendap.Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama
sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar,

sedangkan substansi yang lebih ringan akan


terletak di atas (Fauziah, 2010).

2.4 Manfaat Isolasi DNA


2.4.1 Dalam program pemuliaan tanaman, diperlukan
identifikasi baik karakter morfologi maupun
molekuler untuk menguji keragaman genotip
klon-klon yang akan dipilih untuk tetua
persilangan.
2.4.2 Teknik biologi molekuler telah memberikan
peluang untuk mengembangkan dan
mengindentifikasi peta genetik dari suatu kultivar
tanaman. Pendekatan genetika molekuler
dengan menggunakan penanda DNA telah
berhasil membentuk penanda molekuler yang
mampu dalam mendetekdi gen dan sifat-sifat
tertentu, evaluasi keragaman dan evolusi pada
tingkat genetik. Beberapa teknik penanda DNA
tersebut adalah Restriction Fragment Length
Polymorphism dan Random Amplified
Polymorphic DNA
(Agus, 2010).

BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
1. Timbangan
2. Tubes 1,5 dan 2 ml
3. Tip 1 ml
4. Mikro pipet
5. Vortex
6. Oven
7. Centrifuge

8. Frezer

: untuk menimbang bahan


: untuk tempat larutan
:menampung larutan
pada micro pipet
: untuk mengambil larutan
: untuk menghomogenkan
larutan
: untuk menginkubasi pada
suhu 65oC
: untuk memisahkan DNA
dari zat lain dalam sel
berdasarkan berat
molekulnya
: untuk menggumpalkan
supernatan

3.1.2 Bahan
1) Daun jagung

: sebagai bahan isolasi


DNA
2) Daun kacang tanah : sebagai bahan isolasi
DNA
3) PVP (polivinil pirolidon): mencegah terjadinya
browning dan kontaminasi
fenol
4) Nitrogen Cair
: untuk merusak dinding

5) Chisam
6) Isopropanol dingin
7) Buffer pencuci
8) Buffer TE 20 ml
9) Buffer ekstraksi
10) Mercaptoethanol
11) Karbon

sel
: menghilangkan etanol
dan flafanoid
: menggumpalkan DNA
: untuk menghindari
kontaminasi
: melarutkan DNA
: melindungi DNA ketika
terjadi reaksi kimia
: mencegah terjadinya
browning dan kontaminasi
polisakarida
: untuk menghindari
kerusakan saat
penggerusan

3.2 Langkah Kerja

MMM
SeV
nemo
nt
acis
ex
makt
lkm
bab
pnane
hu
na
krg
tt
d
e
n1
b
m
h
n

ee
r y

u p
aa

b
a
,
a
a

5
l

MMM eee m
MmmSSM ee ii eennn m
MMt r i eef un n
ddmb aao b hhl a k
tags r meui f pbu e
kgk- b aa a ann ml i k
ugk aee r i n
aa h t ki a
ng
nDp eN l Al e

buang
rn a ta n
g
t

m e n it

a n g in
s e la m a

Dokumentasi

3.3 Analisis Perlakuan


Pertama menyiapkan alat dan bahan yang
dibutuhkan dalam percobaan. Mencampur buffer
ekstraksi 1 ml, karbon dan mercaptoethanol 4 l.
buffer ekstraksi berfungsi untuk melindungi DNA
ketika terjadi reaksi kimia, karbon berfungsi untuk
menghindari kerusakan saat penggerusan,
sedangkan mercaptoethanol berfungsi untuk

mencegah terjadinya browning dan kontaminasi


polisakarida, kemudian memasukkan campuran
tersebut ke tube 1,5 ml. Setelah itu menimbang
daun jagung dan daun kacang tanah masing-masing
0,1 gram tanpa tulang daun, memasukkan ke mortar
lalu menambahkan nitrogen cair dan PVP.
Daun segera digerus sampai halus dan jangan
mencair.Penambahan nitrogen berfungsi untuk
merusak dinding sel agar mudah digerus,
sedangkan PVP berfungsi untuk mencegah
terjadinya browning dan kontaminasi fenol. Setelah
itu memasukkan ke dalam tube 1,5 ml tadi, dan
vortex larutan agar homogen. Lalu diinkubasi dalam
oven dengan suhu 65oC selama 10 menit.Setelah
dioven, mendinginkan larutan sebentar.Langkah
berikutnya, larutan di sentrifuge dengan kecepatan
10.000 rpm selama 5 menit. Centrifuge berfungi
untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam sel
berdasarkan berat molekulnya. Setelah itu,
mengambil supernatan dan memindahkannya ke
tube (2ml) baru.Supernatan adalah larutan yang
berada diatas dan berwarna lebih bening. Lalu
menambahkan 500l chisam dan vortex lagi agar
larutan homogen. Chisam: berfungsi untuk
menghilangkan etanol dan flafanoid. Setelah
homogen, larutan di sentrifuge lagi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.Selanjutnya,
memindahkan supernatan ke tube (2ml) baru,
menambahkan chisam lagi dan vortex lagi, lalu
sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5
menit. Berikutnya memindahkan supernatantke tube
(2ml) baru dan menambahkan 300 l isopropanol
yang berfungsi untuk menggumpalkan DNA.

Membolak-balikkan tube secara perlahan, lalu


diinkubasi dalam freezer selama 15 menit.Sentrifuge
kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 5
menit.Langkah berikutnya adalah membuang
supernatan, lalu menambahkan buffer pencuci 500
l pada pellet dalam tube dan vortex kembali.Buffer
pencuci ditambahkan untuk menghindari
kontaminasi.Kemudian sentrifuge dengan kecepatan
9000 rpm selama 5 menit.Lalu mengamati DNA
yang muncul. DNA akan tampak seperti titik-titik
putih dalam larutan.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan
didapatkan hasil bahwa DNA yang berasal dari daun
tanaman kacang tanah terlihat dengan jelas, karena
ukuran DNA yang hanya seperti garis melingkar
putih dan menempel disekitar tube. Hal ini tidak
terlihat pada daun tanaman jagung, pada daun
jagung DNA tidak terlihat.
Pada Kacang tanah

Pada Jagung

4.2 Pembahasan
DNA yang berasal dari daun tanaman kacang
tanah terlihat jelas karena saat pengambilan sample
tidak terkontaminasi dengan endapan yang
dibawahnya. Sedangkan DNA yang berasal dari
tanaman jagung tidak terlihat. Hal tersebut karena
daun jagung yang digunakan untuk isolasi DNA
adalah jagung yang berwarna hijau tua atau daun
jagung yang sudah tua. Pernyataan ini sesuai
dengan literatur Langga (2012) mengatakan bahwa
perlakuan pada konsentrasi DNA ada tiga yaitu
perlakuan suhu, lama inkubasi dan interaksi antara
suhu dengan lama inkubasi, dari ketiga faktor
tersebut, suhu berpengaruh nyata terhadap
konsentrasi DNA begitu juga dengan lama inkubasi,
sedangkan interaksi antara lama suhu dan inkubasi
tidak berpengaruh nyata terhadap konsentrasi.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.
Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa pada
tanaman jagung dan kacang tanah terlihat pita DNA nya,
semua bahan yang digunakan saat pengamatan masih
segar dan muda, hal ini berpengaruh kuat untuk terlihat
atau tidaknya pita DNA pada praktikum kali ini.
5.2 Kritik dan Saran
5.2.1 Kritik dan Saran Untuk Praktikum Tahun
Depan
Estimasi waktu sangat mempengaruhi kerja pada
praktikum, karena praktikum Bioteknologi
membutuhkan waktu yang cukup lama, sehingga
asisten maupun praktikan harus on time agar tidak
terjadi pengunduran waktu karena bisa merugikan
jam praktikum selanjutnya.
5.2.2 Kritik dan Saran Untuk Asisten
Mbak Havinda sudah sangat baik dalam
membimbing praktikannya pada saat praktikum.
Semoga bisa mempertahankan bahkan lebih baik
dalam saat membimbing praktikannya.

DAFTAR PUSTAKA
Agus dan Maftuchah. 2010. Pengembangan Metode
Isolasi DNA Genom Pada Tanaman Jarak Pagar
(Jatropha curcas). Malang: UMM.
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction
2nd Edition. USA: Thomson Brooks/Cole.
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://misspurplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasidna.html. Diakses tanggal 22 Desember 2014.
Giri, Rahman EA. 2004.Regulasi Ekspresi Gen Pada
Organisme Bakteri.Bandung:KPP Bioteknologi
Bandung.
Kartini, Rizki Ayu. 2012. Karakterisasi Molekuler Padi
Transgenik dengan Bebrapa Metode Isolasi
DNA.Bogor: IPB Repository.
Langga, Indah F., Restu dan Tutik Kuswinanti. 2012.
Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam
Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus
Reins) Serta Analisis Keragaman Genetik
Dengan Teknik RAPD-PCR. Vol.12 No.3:265276. Program Studi Sistem-sistem Pertanian,
Program Pascasarjana, Universitas Hasanuddin.
Mader, S.S. 1993. Biology.Lowa: Wm.C Brown
Publishers.
Mulyani, Yuniar, dkk. 2013. Perbandingan Beberapa
Metode Isolasi DNA untuk Deteksi DIni Koi

Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus


carpio L.). FPIK Universitas Padjajaran Jatinagor.
Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk
Deteksi atau Identifikasi Patogen
Tumbuhan.Beberapa Metode Ekstraksi DNA.
Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan
Aplikasi PCR.Malang: Hlm. 43-50.
Wilson, Keith and John Wlker. 2010. Principles and
Techniques of Biochemistry and Molekuler
Biology. New York: Cambrige University Press.