LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA II

Analisis Data Sequencing

OLEH

NAMA : Windi Nopitasari

NIM/TM : 19032162/2019

PRODI : Biologi NK

DOSEN : 1. Dr. Yuni Ahda, M.Si.

2. Afifatul Achyar, S.Si., M.Si

ASISTEN : 1. Cahaya Kamila Putri

2. Nurfadillatun Nisa Wijaya

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAN

UNIVERSITAS NEGERI PADANG

2021
 Analisis Data Sequencing

A. Tujuan Praktikum
1. Praktikan memahami prinsip kerja Sanger Sequencing
2. Praktikan terampil mengolah dan menganalisis data sequencing menggunakan
NCBI BLAST

B. Waktu dan Tempat Praktikum

Hari/Tanggal : Senin/ 22 November 2021
Waktu : 13.20 – 15.50
Tempat : Online

C. Teori Dasar
Sekuensing DNA merupakan suatu teknik atau metode pengurutan semua
nukleotida DNA atau gen, termasuk pengurutan asam amino yang dikodekan secara
tepat dan cepat. Pada prinsipnya, sekuensing DNA terdiri atas preparasi DNA
template, reaksi annealing, reaksi sekuensing, dan reaksi terminasi. Hasil sekuensing
dapat dimanfaatkan untuk menentukan tingkat homologi urutan nukleotida DNA
dengan berbagai organisme. Pemeriksaan secara menyeluruh dapat menentukan
sumber DNA asal bahan yang digunakan (Shofa et al., 2019).
Panjang sekuen yang dihasilkan berkisar antara 1.000-1.200 pasang basa (bp)
dan tidak mampu mencapai lebih dari 2.000 bp. Untuk mendapatkan sekuen yang
lebih panjang dikembangkan metode sekuensin g shotgun melalui proyek sekuensing
genom manusia. Pada metode ini, templat DNA dipotong dengan enzim restriksi lalu
fragmen DNA diklon pada vektor sekuensing dan individu fragmen DNA setiap klon
disekuen terpisah. Hasil sekuen lengkap dari fragmen DNA yang panjang dapat
diperoleh dengan menjajarkan (alignment) dan menyambung (assembly) sekuen
fragmen DNA berdasarkan bagian sekuen yang berkomplemen (overlapping), yang
memungkinkan pemetaan genom manusia dapat diselesaikan (Tasma, 2015).
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan sifat enzim DNA polymerase
yaitu fragmen klenow, yang memiliki kemampuan untuk mensintesis DNA dengan
adanya dNTP dan ketidakmampuannya membedakan deoksinukleotida trifosfat
(dNTP) dengan dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP). Molekul dNTP tidak memiliki
gugus hidroksil (OH), pada atom C nomor 2 pada cincin gula pentose, sedangkan
molekul ddNTP tidak memiliki 2 gugus OH pada posisi atom C nomor 2 dan nomor 3
pada cincin gula pentosa (Radji, 2011).
Prosedur Sanger menggunakan sintesis DNA in vitro di hadapan terminator
rantai tertentu untuk menghasilkan populasi fragmen DNA yang berakhir pada As,
Gs, Cs, dan Ts, masing-masing. 2’,3’-Dideoxyribonucleoside triphosphates (ddXTPs)
Gambar 14.16) adalah rantai-terminator yang paling sering digunakan di Sanger
protokol urutan. Ingat bahwa DNA polimerase memiliki persyaratan mutlak untuk
3’OOH gratis pada untaian primer DNA. Jika 2’,3’-dideoxynucleotide ditambahkan
ke akhir rantai, itu akan memblokir perpanjangan berikutnya dari rantai itu sejak
2’,3’-dideoxynucleotides tidak memiliki 3-OH. Dengan menggunakan (1) 2’,3’-
dideoxythymidine triphosphate (ddTTP), (2) 2’,3’-dideoxycytidine triphosphate
(ddCTP), (3) 2’,3’-dideoxyadenosine triphosphate (ddATP), dan (4) 2,3-
dideoxyguanosine triphosphate (ddGTP), masing-masing dilabeli dengan pewarna
yang berpijar, sebagai chain terminator dalam reaksi sintesis DNA, populasi fragmen
baru-baru ini akan yang mencakup rantai dengan 3 termini di setiap posisi yang
mungkin. Selain itu semua rantai yang berakhir dengan ddG akan berpijar satu warna;
mereka yang berakhir dengan ddA akan fluoresce warna kedua; rantai yang berakhir
dengan ddC akan berpijar sepertiga warna; dan mereka yang berakhir dengan ddT
akan berpijar warna keempat (Snustad, 2012).
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) adalah alat NCBI utama untuk
membandingkan urutan protein atau DNA dengan urutan lain dalam berbagai
database. Pencarian BLAST adalah salah satu cara mendasar untuk mempelajari
protein atau gen: pencarian mengungkapkan urutan terkait apa yang ada dalam
organisme yang sama dan organisme lainnya. Situs web NCBI mencakup beberapa
sumber daya yang sangat baik untuk belajar tentang BLAST. Pencarian BLAST
memungkinkan pengguna untuk memilih satu urutan (diratakan kueri) dan melakukan
perataan urutan pairwise antara kueri dan seluruh database (disebut target). Biasanya,
ini berarti bahwa puluhan juta urutan dievaluasi dalam pencarian BLAST (melibatkan
sekitar 50 miliar nukleotida dalam kasus pencarian terhadap database DNA default),
dan hanya kecocokan yang paling terkait erat yang dikembalikan (Pevsner, 2015).
Sekuensing merupakan tahap akhir dalam menentukan urutan nukleotida
fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Sekuensing dilakukan dengan metode Sanger
menggunakan Automatic DNA Sequencer yang berdasarkan pada metode dye
terminator labelling. Tahapan sekuensing DNA yang dilakukan pada penelitian ini
meliputi : (1) penyiapan DNA, (2) proses amplifikasi melalui PCR dengan
menggunakan primer universal, (3) pemurnian DNA, (4) elektroforesis, dan (5)
pembacaan elektroforegam hasil sekuensing. Data yang diperoleh berupa
elektroforegram dalam bentuk ABI file, dimana setiap nukleoida ditunjukkan oleh
warna yang berbeda. Nukleotida Adenin (A) ditunjukkan dengan warna hijau, Guanin
(G) ditunjukkan dengan warna hitam, Timin (T) ditunjukkan dengan warna merah dan
Sitosin (C) ditunjukkan dengan warna biru. Analisis hasil sekuensing produk PCR
dilakukan dengan membandingkan urutan nukleotida sampel terhadap urutan
nukleotida Kontrol. Urutan nukleotida sampel dan urutan nukleotida kontrol
dimasukkan pada program ini yang dengan otomatis program ini akan mengurutkan
nukleotida sampel sesuai dengan urutan dan posisi nukleotida standar dan kemudian
akan menandai nukleotida tertentu yang berbeda dengan nukleotida kontrol. Adanya
mutasi pada daerah Gen Follicle Stimulating Hormone reseptor diketahui dengan
membandingkan elektroforegam sampel populasi dengan urutan nukleotida standar
rCRS (revised Cambridge Reference Sequence) (Lokapirnasari et al., 2017).
D. Alat dan Bahan
1. Alat
- Komputer
- Internet
2. Bahan
- File sekuen nukleotida hasil sequencing (FASTA)

E. Cara Kerja
- Siapkan file data sequencing dan pastikan sudah terhubung dengan
internet!  FASTA (bisa dibuka dengan wordpad/notepad)  AB1
(software bioinformatik: Bioedit; Geneious; DNA star, dll)
- Buka NCBI BLAST pada url https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
- Pilih “Nucleotide BLAST”
- Masukkan sekuen data sequencing dengan cara copy-paste sekuen ke
kolom “Enter Query Sequence”
- Gunakan default setting, lalu klik “BLAST”
- Lakukan analisis hasil BLAST pada kolom:  Description  Graphic
Summary  Alignment  Taxonomy
- Tariklah kesimpulan bahwa sekuen DNA hasil sequencing yang dianalisis
memiliki kemiripan/homology dengan sekuen DNA apa pada database
genebank NCBI!
F. Hasil Pengamatan

1. Sampel 8_F

2. Sampel 9_F
G. Pertanyaan
1. Apakah tujuan melakukan sequencing?
Jawab :
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai
sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom
karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk
hidup.
Sequencing menggunakan teknik yang dikenal sebagai elektroforesis untuk
memisahkan potongan DNA yang berbeda hanya dengan satu basis. ... molekul yang
lebih kecil bergerak melalui gel lebih cepat, sehingga molekul DNA dipisahkan
menjadi pita yang berbeda sesuai dengan ukurannya.

2. Analisislah dua data sequencing yang diberikan pada link gdrive berikut:
https://drive.google.com/drive/folders/1o6XJsN3VSTbB4OFgmldBI2Gp6nigoUR1?u
sp=sharing
Jawab :
- Sekuens DNA hasil sequencing dari sampel 8_F memiliki kemiripan
dengan sekuens DNA Human DNA sequence from clone RP11-288H12 on
chromosome 6 dengan persentase kemiripan 100% dan sekuens Homo
sapiens partial oct1 gene for organic cation transporter, exon 1 and joined
CDS dengan kemiripan 99,03%.
- Sekuens DNA hasil sequencing dari sampel 9_F memiliki kemiripan
dengan sekuens DNA Human DNA sequence from clone RP11-288H12 on
chromosome 6 dengan persentase kemiripan 100% dan sekuens Homo
sapiens partial oct1 gene for organic cation transporter, exon 1 and joined
CDS dengan kemiripan 98%.

3. Bagaimanakah kualitas data sequencing dari dua sampel yang diberikan?

Jawab :
Data sequencing yang diperoleh dari dua sampel yang diberikan memiliki
kualitas yang baik, karena data yang dihasilkan pada gelombang nya sudah terlihat
jelas/tegas antar satu basa dengan basa yang lainnnya. Namun, Pada saat pengambilan
data sekuens bagian awal dan akhir akan dibuang sebanyak 20 atau 30 basa
nukleotida Karena pada bagian awal dan akhir sekuens komatogramnya tidak stabil
sehingga akan mempengaruhi hasil pada saat kita menganalisa nya.

4. Dimanakah letak perbedaan nukleotida antara kedua sekuen tersebut?

Jawab :
Sampel 8_F memiliki kemiripan 100% dengan Human DNA sequence from
clone RP11-288H12 on chromosome 6 sedangkan sampel 9_F memiliki kemiripan
 99,86%. Hal ini terjadi karena adanya perbedaan basa nukleotida antara sampel
dengan database. Namun, perbedaan ini tidak begitu signifikan sehingga masih bisa
dikatakan bahwa sampel tersebut memiliki kemiripan dengan Human DNA sequence
from clone RP11-288H12 on chromosome 6.
Selain itu, juga terdapat perbedaan pada sekuens Homo sapiens partial oct1
gene for organic cation transporter, exon 1 and joined CDS. Sampel 8_F memiliki
99,03% kemiripan dengan sekuens Homo sapiens partial oct1 gene for organic cation
transporter, exon 1 and joined CDS sedangkan sampel 9_F memiliki kemiripan
98,89%. Hal ini terjadi karena adanya perbedaan basa nukleotida antara sampel
dengan database. Namun, perbedaan ini tidak begitu signifikan sehingga masih bisa
dikatakan bahwa sampel tersebut memiliki kemiripan dengan sekuens Homo sapiens
partial oct1 gene for organic cation transporter, exon 1 and joined CDS.

5. Buatlah kesimpulan dari hasil analisis BLAST!

Jawab :
Jadi, diantara kedua sampel tersebut, sampel 8_F merupakan sampel yang
sesuai dengan sekuens target yang terdapat pada database NCBI. Karena sampel ini
memiliki kemiripan 100% dengan sekuens target yaitu pada gen Human DNA
sequence from clone RP11-288H12 on chromosome 6.
H. Pembahasan

Pada praktikum kali ini membahas mengenai analisis data sequencing yang
tujuannya adalah untuk menentukan urutan DNA. Pada analisis sequencing ini bisa juga
mengidentifikasi spesies sampel yang belum diketahui dengan PCR yaitu ssrRNA untuk
prokariot dan 18 ssrRNA unutk eukariot. Tujuan praktikum kali ini adalah untuk
memahami prinsip dasar sequencing terutama sanger sequencing dan terampil mengolah
dan menganalisis data sequencing menggunakan NCBI BLAST.

Sanger Sequencing, juga dikenal sebagai “chain termination method” adalah

metode untuk menentukan urutan nukleotida DNA. Metode ini dikembangkan oleh Peraih
Nobel Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977, sehingga dinamai Sanger
Sequencing. Tahapan Sanger Sequencing adalah Chain termination PCR yaitu PCR
dengan ddNTPs (dideoxynucleotides triphosphate) yang diberi label dengan pewarna
berfluoresens. Selanjutnya adalah tahapan Capillary gel electrophoresis yaitu pemisahan
fragmen berdasarkan ukuran menggunakan gel kapiler yang memiliki pori sangat kecil.
Tahapan ketiga adalah Eksitasi laser dan deteksi oleh mesin sequencing (sequencer)
sehingga diperoleh urutan nukleotida dalam bentuk kromatogram.

Pada CR dengan ddNTPs (dideoxynucleotides triphosphate) yang diberi label

dengan pewarna berfluoresens akan terjadi proses amplifikasi dari ujung 5 ke ujung 3.
Tahap kedua pada Capillary gel electrophoresis yaitu pemisahan fragmen berdasarkan
ukuran dengan fragmen yang besar berada di posisi atas dan bagian bawah terdapat
fragmen terkeci. Kemudian pada ujung kapiler akan terdapat laser yang akan
ditembakkan dan pendaran dari ddNTPs akan ditangkap oleh mesin sequencing. Jika
tertangkap warna merah, berarti T, warna kuning adalah G, warna biru adalah C dan
warna hijau adalah H.

Pada data awal dan data terahir pada data sequencing biasanya kurang bagus. Data
sekuens yg baik yaitu pada gelombang nya sudah terlihat jelas/tegas antar satu2 basa nya
sedangkan pada gambar, 20-30 basa di awal itu kurang bagus. Kemungkinan
gelombangnya jelek di tengah itu juga ada, hal ini tergantung pada DNA dan alat yang
digunakan (dengan flourence).

Dari hasi pengamatan menggunakan NCBI BLAST dengan sampel 8_F

didaptakan hasil bahwa pada sampel 8_F memiliki panjang sekuens 783 bp. Data sekuens
yang diambil pada sampel ini dimulai dari basa nukleotida ke 30 sampai basa nukleotida
ke 760. Data sekuens tersebut dimasukkan kedalam BLAST. Panjang sekuens yang kita
masukkan sepanjang 733 bp. Hasil yang didapatkan adalah sampel 8_F memiliki
kemiripan dengan 100 buah sekuens lainnya. Sekuens yang sangat mirip pada database
BLAST dengan data dari sampel adalah Human DNA sequence from clone RP11-288H12
on chromosome 6. Sekuens ini memiliki skor 1354 dengan query covernya 100% dan
persentase identiknya 100 % serta E value nya 0 sehingga sekuens ini mirip dengan
sekuens pada sampel. Selain itu, sekuens ini memiliki kemiripan dengan sekuens sampel
pada seluruh panjang basa yang kita masukkan. Pada deretan sekuens nya ditemukan
kemiripan 100% antara sekuens pada sampel dengan sekuens pada database.

Sampel 8_F juga memiliki kemiripan dengan sekuens Homo sapiens partial oct1
gene for organic cation transporter, exon 1 and joined CDS. Sekuens ini memiliki skor
1295 dengan query cover nya 97% dan persen identiknya 99,03% serta E value nya 0.
Sekuens ini memiliki persamaan dengan sekuens sampel dari urutan 1 sampai 718. Pada
urutan basa nukleotidanya terdapat 711 basa yang sama dari 718 urutan basa. Perbedaan
basa nukleotida antara sampel dengan database terdapat pada sekuens 661 sampai 717.
Selain itu terdapat juga gap pada sekuens sampel 663 yang mana tidak terdapat basa
nukleotida sedangkan pada sekuens database terdapat basa nukleotida nya.

Sampel 9_F memiliki panjang sekuens sepanjang 783 bp. Data sekuens yang
diambil sama dengan sampel 8_F mulai dari basa 31 sampai basa 763. Jadi data yang
dimasukkan kedalam BLAST memiliki panjang 733 bp. Hasil yang didapatkan adalah
sampel 9_F memiliki kemiripan dengan 100 buah sekuens lainnya. Sekuens yang sangat
mirip pada database BLAST dengan data dari sampel adalah Human DNA sequence from
clone RP11-288H12 on chromosome 6. Sekuens ini memiliki skor 1349 dengan query
covernya 100% dan persentase identiknya 99,86 % serta E value nya 0 sehingga sekuens
ini mirip dengan sekuens pada sampel. Pada deret sekuens nya ditemukan perbedaan satu
basa nukleotida antara sampel dengan database yaitu pada urutan ke 373. Pada sekuens
sampel basa nukleotida pada urutan ke 373 adalah basa sitosin (C) sedangkan pada
database basa nukleotida pada urutan ke 373 adalah basa timin (T).

Sampel 9_F juga memiliki kemiripan dengan sekuens Homo sapiens partial oct1
gene for organic cation transporter, exon 1 and joined CDS. Sekuens ini memiliki skor
1295 dengan query covernya 98% dan persentase identiknya 98,89% serta E value nya 0.
Sekuens ini memiliki persamaan dengan sekuens sampel pada sekuens 1 sampai 721.
Pada urutan basa nukleotida nya terdapat 713 basa yang sama dari 721 urutan basa.
Perbedaan basa nukleotida antara sampel dengan database terletak di sekuens 361 sampai
719. Selain itu juga terdapat gap pada sekuens sampel 666 yang mana tidak terdapat basa
nukleotida sedangkan pada sekuens database terdapat basa nukleotida nya.

Selain itu, kedua sekuens dari sampel juga memiliki kemiripan 90%-99% dengan
primata. Salah satu simpanse yang memiliki kemiripan DNA sebesar 98%-99%. Ini
membuktikan bahwa simpanse merupakan kerabat dekat dari manusia. Hanya terdapat
beberapa perbedaan basa nukleotida antara manusia dengan simpanse. Karena ada nya
kemiripan antara DNA manusia dengan DNA simpanse maka manusia dimasukkan
kedalam ordo primata bersamaan dengan primata lainnya. Selain itu, sekuens sampel juga
memiliki kemiripan dengan beberapa hewan mamalia lainnya seperti babi dan leopard
yaitu sebesar 82-86%. Hal ini terjadi karena manusia termasuk kedalam kelas yang sama
dengan babi dan leopard yaitu mamalia. Hal ini membuktikan bahwa semakin rendah
tingkat takson maka semakin banyak kemiripan yang didapatkan.
 Jadi, diantara kedua sampel tersebut, sampel 8_F merupakan sampel yang sesuai
dengan sekuens target yang terdapat pada database NCBI. Karena sampel ini memiliki
kemiripan 100% dengan sekuens target yaitu pada gen Human DNA sequence from clone
RP11-288H12 on chromosome 6.
I. Kesimpulan
1. Analisis data sequencing adalah metode/teknik untuk menentukan urutan basa
nukleotida pada suatu molekul DNA (A,T,G,C) serta untuk mempelajari
hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang
telah terlebih dahulu diketahui.
2. Sekuens DNA hasil sequencing dari sampel 8_F memiliki kemiripan dengan
sekuens DNA Human DNA sequence from clone RP11-288H12 on chromosome 6
dengan persentase kemiripan 100% dan sekuens Homo sapiens partial oct1 gene
for organic cation transporter, exon 1 and joined CDS dengan kemiripan 99,03%.
3. Sekuens DNA hasil sequencing dari sampel 9_F memiliki kemiripan dengan
sekuens DNA Human DNA sequence from clone RP11-288H12 on chromosome 6
dengan persentase kemiripan 99,86% dan sekuens Homo sapiens partial oct1 gene
for organic cation transporter, exon 1 and joined CDS dengan kemiripan 98,89%.
4. Perbedaan antara 2 sampel terletak pada persentase identic pada hasil sequencing
yang terdapat pada database. Contohnya DNA Human DNA sequence from clone
RP11-288H12 on chromosome 6 memiliki kemiripan 100% dengan sampel 8_F
namun pada sampel 9_F memiliki kemiripan 99,86%
5. Sampel yang sesuai dengan sekuens target pada database adalah sampel 8_F
karena memiliki kemiripan 100 persen dengan gen Human DNA sequence from
clone RP11-288H12 on chromosome 6.
 DAFTAR PUSTAKA

Lokapirnasari, W., Sahidu, A., Nurhajati, T., Supranianondo, S., & Yulianto, A. (2017).
Sekuensing 16S DNA Bakteri Selulolitik Asal Limbah Cairan Rumen Sapi Peranakan
Ongole (Sequencing Of 16s Dna Of Cellulolytic Bacteria From Bovine Rumen Fluid
Waste Ongole Crossbreed). Jurnal Veteriner, 18(1), 76–82

Pesvner, J. 2015. Bioinformatics and Functional Genomics : Third Edition. United States :
John Wiley & Sons, Inc.

Radji, M. 2011. Rekayasa Genetika : Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Jakarta : CV

Sagung Seto

Shofa, A. F., Hariyanti, H., & Wahyudi, P. (2019). Penggunaan DNA Mitokondria Sebagai
Penanda Sumber Gelatin Sediaan Gummy dengan Teknik Polymerase Chain Reaction
dan Sekuensing DNA. Jurnal Sains Farmasi & Klinis, 6(1), 25.

Snustad, D. P. 2012. Principle of Genetics : Sixth Edition. United States : John Wiley &
Sons, Inc.

Tasma, I. M. (2015). Pemanfaatan Teknologi Sekuensing Genom Untuk Mempercepat

Program Pemuliaan Tanaman : Utilization of Genome Sequencing Technology to
Accelerate Plant Breeding Program. Jurnal Litbang Pertanian, 32(2), 159–168.