METODE DETERMINASI

PROTEIN
• Protein adalah salah satu bio-makromolekul yang penting perananya
dalam makhluk hidup. Fungsi dari protein itu sendiri secara garis
besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan
struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular.
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu ;
1. Secara kualitatif terdiri atas ; reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-
Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi.
2. Secara kuantitatif terdiri dari ; metode Kjeldahl, metode titrasi
formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan
metode spektrofotometri UV
(Sudarmadji, 1989).
Analisa Kualitatif
• 1. Reaksi Xantoprotein
• Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam
larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat
berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah
nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi
ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan
triptofan.
Reaksi Hopkins-Cole

• Larutan protein yang mengandung triptofan dapat

direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung
asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan
serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan
pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-
lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein.
Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas
antara kedua lapisan tersebut.
Reaksi Millon

• Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam

asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein,
akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi
merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-
fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus
hidroksifenil yang berwarna.
• 4. Reaksi Natriumnitroprusida

• Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan

protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat
memberikan hasil positif.

• 5. Reaksi Sakaguchi

• Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini
memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang
mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.
• 6. Metode Biuret

• Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan

larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adany senyawa-
senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama
gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai
dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
Analisa Kuantatif

• Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu:

Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi,
destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.

• Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri

visible, metode spektrofotometri UV. Digunakan untuk protein terlarut
1. Metode Kjedahl

• Prinsip metode kjeldahl ini adalah senyawa-senyawa yang

mengandung nitrogen tersebut mengalami oksidasi dan dikonversi
menjadi ammonia dan bereaksi dengan asam pekat membentuk
garam amonium. Kemudian ditambahkan basa untuk menetralisasi
suasana reaksi dan kemudian didestilasi dengan asam dan dititrasi
untuk mengatahui jumlah N yang dikonversi.
Tahapan Kerja Metode Kjedahl
• a. Tahap Destruksi

• Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga
terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen
teroksidasi menjadi CO, CO2, dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan
berubah menjadi (NH4)SO4. Untuk mempercepat proses destruksi
sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO.
b. Tahap Destilasi

• Pada tahap destilasi ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3)

dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar selama
destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau
timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam
zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh
larutan asam standar yang dipakai dalam jumlah berlebihan
c. Tahap Titrasi
Larutan asam pada penampung destilat yang dapat digunakan adalah larutan standar asam
kuat seperti asam sulfat atau larutan asam borat. Jika dipakai larutan asam kuat standar maka
titrasi yang dilakukan disebut titrasi kembali sedangkan jika dipakai larutan asam borat maka
disebut titrasi tidak langsung. Pada metode titrasi kembali, larutan asam standar yang
berlebihan setelah bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan larutan standar NaOH. Titrasi
ini disebut titrasi kembali karena jumlah asam yang bereaksi dengan ammonia tersedia dalam
keadaan berlebih sehingga melewati titik ekuivalen reaksi. Oleh karena itu, analis harus
mengembalikan titik ekuivalen reaksi dengan titrasi menggunakan NaOH
• Keuntungan menggunakan metode kjeldahl ini adalah dapat diaplikasikan untuk
semua jenis bahan pangan, tidak memerlukan biaya yang mahal untuk
pengerjaannya, akurat dan merupakan metode umum untuk penentuan kandungan
protein kasar, dapat dimodifikasi sesuai kuantitas protein yang dianalisis. Adapun
kelemahan menggunakan metode kjeldahl ini adalah jumlah total nitrogen yang
terdapat didalamnya bukan hanya nitrogen dari protein, waktu yang diperlukan relatif
lebih lama (minimal 2 jam untuk menyelesaikannya), presisi yang lemah, pereaksi
yang digunakan korosif (Sumantri, 2013).
2. Metode Spektofotometri

• Penentuan kadar protein dengan menggunakan instrumen dibagi menjadi

dua yaitu: 1) metode pengukuran langsung pada panjang gelombang 205
nm dan 280 nm dan 2) metode pembentukan warna dengan pereaksi
tertentu. Metode pengukuran langsung pada panjang gelombang 205 nm
dan 280 nm Absorbansi pada panjang gelombang 205 nm dan 280 nm
digunakan untuk menghitung konsentrasi protein dengan terlebih dahulu
distandarisasi dengan protein standar.
• Keuntungan metode ini adalah waktu yang diperlukan untuk analisis
cepat, memiliki sensitifitas yang baik, tidak ada gangguan dari ion
ammonium dan garam-garam buffer, larutan sampel masih dapat
digunakan untuk analisis lain selain analisis protein. Kerugian metode
ini adalah asam nukleat juga memiliki absorbansi yang kuat pada
panjang gelombang 280 nm, susunan asam amino aromatis dapat
bervariasi untuk setiap sampel protein, larutan protein harus
benar_x0002_benar jernih dan tidak berwarna ataupun keruh
(Budianto, 2009)
3. Metode Pembentukan

• Warna dengan pereaksi tertentu a. Pereaksi Biuret Prinsip penetapan protein

metode Biuret adalah pada kondisi basa, Cu2+ membentuk kompleks dengan
ikatan peptida (-CO-NH-) suatu protein menghasilkan warna ungu, sehingga
kadar protein sampel dapat ditetapkan dengan spektrofotometer. Pemilihan
protein standar dapat menyebabkan kesalahan fatal dalam analisis, standar
yang digunakan harus memiliki tingkat kemurnian yang tinggi. Untuk analisis
protein secara umum, standar Bovine Serum Albumin (BSA) (Budianto, 2009).
4. Metode Titrasi
• Formol Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan formalin
akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya
sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksil) dengan
basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan
adala fenolftalein, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda
yang tidak hilang dalam 30 detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu
proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein

(Sudarmadji, 1989).
5. Metode Dumas

• Pada metode ini sampel dioksidasi pada suhu sangat tinggi (700-
900°C). Hasil oksidasi menghasilkan gas O2, N2 dan CO2. Gas nitrogen
yang dilepaskan dikuantitasi menggunakan kromatografi gas dengan
detektor konduktivitas termal (Thermal Detector Conductivity/TDC)
kemudian jumlah nitrogen yang diperoleh dikonversi. Jumlah nitrogen
dalam sampel sebanding dengan kadar proteinnya.
• Keuntungan metode ini adalah tidak memerlukan zat kimia
berbahaya, analisis dapat diselesaikan dalam waktu 3 menit,
instrumen otomatis terbaru dapat menganalisis 150 sampel secara
bersamaan. Adapun kekurangan metode ini adalah membutuhkan
instrumen analisis yang mahal, mengukur total nitrogen, bukan hanya
mengukur nitrogen yang berasal dari protein (Sudarmadji, 1989).