ANALISIS PROTEIN DENGAN

REAKSI MILLON, REAKSI

NITROPRUSIDA, DAN REAKSI SAKAGUCHI
 ANALISIS PROTEIN
Kandungan protein pada pangan ditentukan dengan:
Analisis Kualitatif
Proses dalam mengidentifikasi keberadaan protein dalam suatu sampel yang
tidak diketahui
 Reaksi xantoprotein, reaksi Hopkins Cole, reaksi Millon, reaksi
Nitroprusida, Reaksi Sakaguchi, dll.
Analisis Kuantitatif
Proses dalam mengidentifikasi jumlah protein yang ada dalam suatu sampel
 Metode Kjeldahl, metode Lowry, metode biuret, metode spektrofotometer Struktur Protein
UV, metode turbudimetri, metode pengecatan, metode titrasi mol, dll.
ANALISIS KUALITATIF
REAKSI XANTOPROTEIN

Menunjukkan adanya gugus benzene (cincin fenil).

• Menggunakan larutan asam nitrat pekat yang dicampur ke larutan sampel (protein).

• Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan.

• Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzene yang terdapat pada molekul protein.

• Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping fenil  asam
amino tirosin, fenilalanin, dan triptofan.
REAKSI HOPKINS-COLE

Prinsip dari reaksi Hopkins-Cole berdasar dari reaksi dehidrasi  pereaksi Hopkins-Cole
mengandung asam glioksilat yang dibuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium di dalam
air.

• Asam amino bereaksi dengan reaktan asam glioksilat kemudian dituangkan asam sulfat
secara perlahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein.

• Kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut akibat reaksi
dehidrasi pada triptofan.
REAKSI MILLON
1. Digunakan, umumnya, untuk menunjukkan adanya asam amino tirosin pada
protein
2. Bekerja terhadap derivat-derivat monofenol seperti tirosin
3. Pereaksi yang digunakan: Larutan merkuri (Hg) dalam asam nitrat (HNO3)
4. Hasil: Endapan putih yang dapat berubah jadi merah dengan pemanasan.
 Reaksi Millon

 Tirosin ternitrasi asam nitrat sehingga memperoleh penambahan

gugusan N=0, di mana gugus tersebut secara reversible dapat berubah
menjadi N-OH atau hidroksifenil. Hidroksifenil dari tirosin bereaksi dengan
merkuri dari pereaksi millon, sehingga membentuk warna merah.
 REAKSI NITROPRUSIDA
Digunakan untuk mendeteksi asam amino sistein pada protein
Asam amino sistein terbuat dari metionin dan serin
 Metionin: Memberikan atom sulfur
 Serin: Memberikan kerangka karbon untuk sistein

Gugus tiol (-SH) dalam sisten bereaksi dengan sodium

Asam Amino Sistein
nitroprusida dalam keadaan amonia berlebih, membentuk
senyawa berwarna merah. Pada reaksi nitroprusida, protein
yang mengandung sistein memberikan hasil positif.
 REAKSI SAKAGUCHI
Digunakan untuk mendeteksi asam amino arginine pada protein
 Arginine: Memiliki kelompok R-propil (3 metil) dengan gugus
guanidine pada ujungnya
 Gugus guanidine: Atom C pengikat N2 dengan ikatan tunggal,
pengikat N dengan ikatan ganda

Asam Amino Arginine

 Reaksi Sakaguchi

 Gugus guanidine bereaksi dalam uji sakaguchi. Pada kondisi basa, alpha naphtol akan bereaksi
dengan gugus guanidine dalam arginine yang telat teroksidasi sodium hipoklorit, menghasilkan
senyawa berwarna merah. Jika protein mengandung asam amino arginine, protein akan memberikan
hasil yang positif.
ANALISIS KUANTITATIF
 METODE SPEKTROFOTOMETER UV-VIS
Pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang
spesifik menggunakanmonokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.
Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang
digunakan yaitu:
Daerah UV; λ = 200-380 nm
Daerah Visible (tampak); λ = 380 – 700 nm
Daerah inframerah (IR); λ = 700 – 0,3
 Jalannya Sinar Fotometri:

Io = cahaya monokromatik
Ir = cahaya yang dipantulkan
It = cahaya yang dipancarkan
Ia = cahaya yang diserap
Io = Ia+Ir+It

Spektra serapan dapat diperoleh dengan menggunakan sampel dalam berbagai bentuk gas, lapisan
tipis cairan, larutan dalam berbagai pelarut dan bahkan zat padat. Prinsip kerja spektrofotometri
berdasarkan hokum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu metode (larutan), maka
sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulakan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan
melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa
yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya
akandilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalam kuvet.

Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu:

1. Sumber cahaya

2. Monokromator

3. Kuvet

4. Detektor
TURBIDIMETRI
Kekeruhan akan terbentuk dalam larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan
bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic Acid (TCA), Kalium Ferri Cianida
K4Fe9(CN)6 atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat turbidimeter.
Tabel atau kurva juga harus dibuat terlebih dahulu untuk menunjukkan hubungan antara
kekeruhan dengan kadar protein (dapat ditentukan dengan cara Kjeldahl). Cara ini hanya
dapat dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan dan hasilnya biasanya kurang
tepat.
METODE KJELDAHL
Metode untuk penentuan jumlah protein secara empiris dengan menentukan jumlah nitrogen (N) yang
dikandung oleh suatu bahan. Kadar nitrogen yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengkali berdasar
asam amino penyusun protein tersebut.

1. Tahap Digesti

Memecah ikatan kompleks polipeptida menjadi ikatan peptida yang lebih sederhana dan menghasilkan
molekul air, CO2 dan amonium sulfat.

 Memanaskan sampel dalam suasana asam pada temperatur tinggi. Dalam reaksi ditambahkan katalis
seperti potasium sulfat, selenium, titanium, copper. Hasil akhir yang diinginkan adalah amonium sulfat.
METODE KJELDAHL
2. Tahap Distilasi

Mengubah amonium sulfat yang terbentuk dalam proses digesti menjadi gas ammonia yang
kemudian ditangkap menggunakan asam sehingga menghasilkan larutan amonium yang siap untuk
dianalisa kadar nitrogennya.

 Proses pendidihan sampel menggunakan air dan larutan alkali, di mana uap yang terbentuk
didinginkan dalam kondensor kemudian ditampung sebagai destilat. Diakhiri bila semua ammonia
terdistilasi sempurna (larutan menjadi hijau muda).

3. Tahap Titrasi

Dilakukan dengan menggunakan larutan asam, dapat berupa asam sulfat, atau asam hidroklorida.
METODE BIURET
Reaksi warna yang umum untuk gugus peptide dan protein. Digunakan untuk mengetahui ada atau
tidaknya ikatan peptide dalam suatu senyawa (protein).

• Larutan sampel yang diduga mengandung protein ditetesi dengan larutan NaOH

• Kemudian diberi beberapa tetes larutan CuSO4 encer.

• Apabila larutan berubah menjadi warna ungu maka larutan tersebut mengandung protein.
Larutan protein dibuat alkalis dengan NAOH kemudian ditambahkan larutan Cupri Sulfat
(CuSO4) encer.

Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks
antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptide.
METODE LOWRY
Mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan
residu tirosin dan triptofan dalam protein. Metode ini lebih sensitif untuk protein konsentrasi rendah
dibanding metode biuret, karena pengembangan dari metode Biuret dan melibatkan 2 reaksi.

• Awalnya, kompleks Cu(l)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis
Cu(lI) akan tereduksi menjadi Cu(I).

• Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat
(phosphomolybdotungstate).

• Menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam
amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri.
METODE PENGECATAN
• Menggunakan bahan pewarna berupa Orange G (garam natrium organik yang merupakan

garam disodium dari asam 7-hidroksi-8-[(E)-fenyldiazenyl]naftalena-1,3-disulfonat).

• Membentuk senyawaan yang berwarna ketika tercampur dengan protein dan menjadi

bersifat tidak larut.

• Sisa senyawa yang tidak bereaksi dalam larutan diukur dengan kalorimetri untuk

mengetahui kadar jumlah protein.

METODE TITRASI FORMOL
Hanya tepat untuk menentukan proses terjadinya pemecahan protein.

• Menetralkan larutan sampel (protein) dengan NaOH.

• Setelah dinetralkan, larutan ditambahkan dengan formalin (CH2O)

yang akan membentuk dimethilol.

• Setelah terbentuk dimethilol, gugus aminonya terikat dan tidak

memengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksil) dengan basa
NaOH.

• Indikator yang digunakan adalah PP (fenolftalein), dan ketika

dititrasi dengan tepat akan menghasilkan warna merah muda yang
tidak hilang selama 30 detik.
SDS PAGE
Metode elektroforesis yang menggunakan deterjen anionic sodium dodecyl sulfate untuk menentukan berat molekul dan
kemurnian protein.

• Rantai polipeptida mengikat jumlah SDS secara proporsional dengan massa molekul relatifnya.

• Muatan negatif pada SDS menghancurkan sebagian besar struktur kompleks protein, dan sangat tertarik pada anoda
(elektroda bermuatan positif) dalam medan listrik.

• SDS mengikat sebagian besar protein dalam jumlah yang sebanding dengan berat molekul protein, sekitar satu molekul
SDS untuk setiap dua residu asam amino.

 Pemisahan protein oleh SDS-PAGE dapat digunakan untuk memperkirakan massa molekul relatif, menentukan kelimpahan
relatif protein utama dalam sampel, dan menentukan distribusi protein di antara fraksi. Metode pewarnaan yang berbeda
dapat digunakan untuk mendeteksi protein langka dan mempelajari sesuatu tentang sifat biokimia mereka.
EDMAN DEGRADATION
Metode pengurutan asam amino yang terdapat dalam peptida. Dalam metode ini, residu terminal amino dari peptida
terlabeli dan terbelah dari rantai peptida tanpa mengganggu ikatan peptida antar residu-residu asam amino lainnya.

• Fenil isotiosianat direaksikan dalam keadaan sedikit basa dengan gugus amino terminal-N peptida yang tidak
bermuatan untuk membentuk turunan feniltiokarbamoil yang berbentuk siklik.

• Dalam kondisi asam, turunan asam amino terminal ini dibelah sebagai turunan tiazolinon.

• Asam amino tiazolinon secara selektif diekstraksi ke dalam pelarut organik dan diberikan asam untuk membentuk
feniltiohidantoin (PTH) yang lebih stabil.

 PTH ini adalah turunan asam amino yang dapat diidentifikasikan menggunakan kromatografi atau
elektroforesis.
EDMAN DEGRADATION
WESTERN BLOTTING
Metode yang digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi protein. Pada metode ini, protein
dipisahkan berdasarkan berat molekul dan jenis dengan cara elektroforesis. Hasil pemisahan ini
kemudian akan dipindahkan ke sebuah membran, di mana mereka dideteksi menggunakan
antibodi untuk menargetkan protein.
1. Sample Preparation
Jaringan perlu dipecah dan sel biasanya ditambahkan buffer agar lisis dan melarutkan protein.
2. Gel Electrophoresis
Setelah preparasi sampel, ekstrak sudah siap untuk pemisahan protein berdasarkan ukuran
dengan metode gel elektroforesis.
3. Blotting to Membrane
Diberikan tegangan pada proses pemindahan protein dari gel ke membran yang
mengakibatkan perpindahan elektron dari gel ke membran. Ada tiga membran, yaitu:
nitroselulosa, polyvinylidene difluoride (PVDF) dan nilon.
WESTERN BLOTTING
4. Antibody Probbing
Terjadi pengikatan antibodi yang spesifik ke protein yang terdapat pada membran.
5. Detection
Kompleks Protein-Antibodi-Antibodi dideteksi oleh membran. Terdapat beberapa jenis pelabelan
antibodi sekunder, seperti: Enzim, fluorofor, biotinylation, gold conjugation, dan radioisotop.
6. Imaging
Pengambilan gambar dapat dianalogikan menggunakan film, atau secara digital dibentuk
dengan kamera CCD atau pemindai yang menangkap berbagai jenis sinyal yang
dipancarkan.
7. Analysis
Langkah terakhir adalah menganalisis hasil. Keberadaan protein dikonfirmasi, kadar protein
diperkirakan dengan inspeksi visual dan ukurannya ditentukan dengan perbandingan.
REFERENSI