Nama : Roisatul Fitri

NIM : 171810301022

TUGAS TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA

ESSAY ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF PROTEIN

Protein merupakan senyawa organik kompleks berupa molekul tinggi yang merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan
peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur
serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan
virus. Protein juga merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi
struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton.
Protein juga berfungsi dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam
bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan dan juga dalam transportasi hara. Protein
merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang
merupakan penyusun utama makhluk hidup.

Protein merupakan zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena dapat berfungsi
sebagai bahan bakar dalam tubuh dan berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Fungsi
utama protein bagi tubuh ialah untuk membentuk jaringan baru dan memperthankan jaringan yang
telah ada. Protein merupakan rantai panjang yang tersusun dari mata rantai asam-asam amino.
Asam amino merupakan senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil [-COOH] dan
satu atau lebih gugus amino [-NH2] yang salah satunya terletak pada atom C tepat disebelah gugus
karboksil. Asam-asam amino yang berbeda-beda berikatan melalui ikatan peptida, yaitu ikatan
diantara gugus karboksil satu asam amino dengan gugus amino dari asam amino disampingnya.

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan secara
kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole,
reaksi Millon, reaksi Sakaguchi, reaksi ninhidrin dan metode Biuret. Sedangkan analisis protein
secara kuantitatif terdiri dari uji bradford, metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode
spektrofotometri.

Analisis kualitatif pada protein, antara lain:

 1. Uji Xantoprotein

Uji xantoprotein berfungsi untuk mengidentifikasi adanya inti benzena dalam senyawa
protein seperti: tirosin, triptofan dan fenilalanin. Pengujian ini memberikan hasil positif terhadap
asam amino yang mengandung cincin benzena, seperti fenilalanin, tirosin, dan triptofan. Cara
pengujiannya yaitu ke dalam protein ditambahkan asam nitrat pekat sehingga terbentuk endapan
putih karena terjadi proses nitrasi terhadap cincin benzena. Endapan putih tersebut akan berubah
menjadi kuning jika dipanaskan. Reaksi ini menyebabkan nitrasi inti benzena dalam molekul
protein. Tirosina, fenilalanina dan triptofan memberikan hasil positif terhadap reaksi ini karena
memiliki cincin aromatik yang bereaksi dengan asam nitrat pekat. Protein dengan asam nitrat
dipanaskan membentuk warna kuning sampai jingga. Reaksi yang terjadi saat dilakukan uji
xantoprotein adalah:

2. Uji Hopkins-Cole

Uji hopkins-cole dapat dilakukan dengan triptofan dapat berkondensasi dengan beberapa
aldehida dengan bantuan asam kuat dan membentuk senyawa yang berwarna. Larutan protein yang
mengandung triptofan dapat direasikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam
glioksilat. Pereaksi Hopkins-Cole dicampur, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga
membentuk lapisan di bawah larutan protein. Cincin ungu terbentuk pada batas antara kedua
lapisan. Reaksi ini bergantung dengan adanya triptofan dalam molekul protein. Triptofan akan
berkondensasi dengan macam-macam aldehida dengan adanya asam kuat sehingga terbentuk
kompleks warna. Reaksi Hopkins-Cole memberi hasil positif khas untuk gugus indol dalam
protein. Contohnya reaksinya yaitu ketika triptofan direaksikan dengan asam glioksilat yang
terkandung di dalam pereaksi Hopkins-Cole, hasilnya akan terdapat cincin ungu pada sampel yang
mengindikasikan adanya protein di dalamnya. Reaksinya yaitu :
 3. Uji Millon

Uji millon digunakan untuk menunjukkan adanya asam amino tirosin pada suatu zat. Uji
millon bekerja terhadap derivat-derivat mono fenol seperti tirosin. Pereaksi yang digunakan
merupakan larutan merkuri (Hg) dalam asam nitrat (HNO3). Tirosin akan ternitrasi oleh asam nitrat
sehingga memperoleh penambahan gugus N=O, gugus tersebut secara reversibel (bolak balik)
dapat berubah menjadi N – OH (hidroksifenil). Merkuri dalam pereaksi millon akan bereaksi
dengan gugus hidroksifenil dari tirosil membentuk warna merah.

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila
pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat
berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena
terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein yang
mengandung tirosin akan memberikan hasil positif. Reaksi yang terjadi yaitu :

4. Uji Sakaguchi

Uji sakaguchi merupakan uji yang digunakan untuk mendeteksi adanya asam amino
arginin. Arginin memiliki kelompok-R propil (3 metil) dengan gugus guanidin di ujungnya. Gugus
guanidin merupakan atom C yang dapat mengikat N2 dengan ikatan tunggal dan mengikat N
dengan ikatan ganda. Gugus guanidin akan bereaksi dalam uji sakaguchi dimana dalam keadaan
basa, alpha naphtol akan bereaksi dengan gugus guanidin dalam arginin yang telah teroksidasi
sodium hipoklorit, menghasilkan senyawa berwarna merah. Apabila protein menunjukkan
perubahan warna merah pada uji sakaguchi berarti dalam protein tersebut terdapat arginin. Reaksi
yang terjadi yaitu :

5. Uji Biuret

Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua
molekul urea. Metode biuret dilakukan untuk menguji kandungan dari protein. Uji ini digunakan
untuk uji umum terhadap protein, karena uji ini dapat mendeteksi adanya ikatan peptida. Uji biuret
didasarkan pada reaksi antara ion Cu2+ dan ikatan peptida dalam suasana basa. Warna kompleks
ungu menunjukkan adanya protein. Intensitas warna yang dihasilkan merupakan ukuran jumlah
ikatan peptida yang ada dalam protein yang ada dalam protein. Ion Cu2+ dari pereaksi Biuret
dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun
protein dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Reaksi positif terhadap dua buah
ikatan peptida atau lebih tetapi negatif untuk asam amino bebas atau satu ikatan peptida. Protein
melarutkan hidroksida tembaga utuk membentuk kompleks warna. Reaksi pembentukan warna ini
dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen
atau karbon misalnya senyawa biuret. Rea ksi ya ng terjadi dapat digambarkan sebagai berikut:
 6. Uji Ninhidrin

Asam amino yang bereaksi dengan triketohidrindina hidrat (nihidrin) untuk membentuk
aldehida yang lebih kecil dengan membebaskan karbondioksida, amonia dan menghasilkan warna
biru (violet). Prolina dan hidroksiprolina dihasilkan warna kuning. Senyawa-senyawa ammonium
kuat, senyawa amina, sebagian besar peptida dan protein bereaksi dengan jalur yang sama
walaupun tidak menghasilkan karbondioksida dan amonia. Uji ninhidrin adalah metode yang
digunakan untuk menganalisa protein secara kualitatif. Uji ninhidrin ini didasarkan pada reaksi
yang terjadi antara asam amino dengan ninhidrin. Asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin
membentuk aldehida dengan 1 atom C yang lebih rendah melepaskan molekul NH3 dan CO2, selain
melepaskan NH3 dan CO2, asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin akan membentuk warna
ungu atau biru. Warna yang dihasilkan tersebut disebabkan karena molekul ninhidrin dan hidratin
bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. Reaksi yang terjadi yaitu :

Analisis kuantatif protein, antara lain :

1. Uji Bradford

Uji Bradford merupakan uji yang digunakan mengukur konsentrasi atau kadar protein total
menggunakan metode kalorimetri pada suatu larutan. Prinsip kerjanya didasarkan pada
peningkatan secara langsung zat warna Coomasie Brilliant Blue G250 (CBBG). Protein yang
mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin, triptofan, dan
fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Hal ini membentuk suatu kompleks
berwarna biru yang akan diukur nilai absorbansinya. Kompleks warna biru diberi reagen Bradford
maka cepat terbentuk dan stabil. Kestabilan dari warna biru Commassie Brilliant Blue G-250
terjadi karena interaksi antara lapisan hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat warna
Commassie Brilliant Blue G-250. Zat warna tersebut menstabilkan bentuk anion tersebut. Nilai
absorbansi diukur menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Spektrofotometer UV-Vis merupakan
alat yang digunkaan untuk analisis kuantitatif yang berprinsip pada radiasi dimana rentang
panjang gelombang 200-700 nm yang dilewatkan melalui larutan senyawa. Elektron-elektron pada
ikatan dalam molekul menjadi tereksitasi maka menempati keadaan kuantum yang lebih tinggi
serta penyerapan energi yang melewati larutan tersebut.

Tingkat ketelitian dari metode Bradford ketika menentukan kadar protein cukup tinggi
karena koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA konstan pada rentang
konsentrasi flip-10. Nilai presisi dan akurasi data dari metode Bradford cukup tinggi dalam hal
penentuan kadar protein ataupun sampel lain. Metode Bradford digunakan untuk menentukan
kadar protein bukan dari ikatan peptidanya. Metode ini dapat mendeteksi suatu asam amino
spesifik yang pada protein serta berikatan dengan zat warnanya(Dennison 2002). Keuntungan dari
metode Bradford yakni pereaksi yang digunakan sangat sederhana serta mudah didapatkan dan
disiapkan. Nilai akurasi dan presisi data yang diperoleh cukup tinggi serta untuk menjamin
keakuratan data sampel yang berada diluar jangkauan. Hal ini membuat keefekifan kerja sangan
cepat.

2. Metode Spektrometri

Kadar protein ditentukan dengan instrumen dimana dibagi menjadi dua yakni metode
pengukuran pada panjang gelombang tertentu (205 nm dan 280 nm) dan metode pembentukan
warna dengan pereaksi tertentu. Metode pengukuran langsung pada pajang gelombang memiliki
banyak keuntungan diantaranya analisis cepat, sensitivitas yang baik, tidak ada gangguan dari zat
lain, larutan sampel masih dapat digunakan untuk analisis lain selain analisis protein. Kerugian
metode ini adalah asam nukleat juga memiliki absorbansi yang kuat pada panjang gelombang 280
nm. Susunan asam amino aromatis dapat bervariasi untuk setiap sampel protein serta larutan
protein harus benar-benar jernih dan tidak berwarna atau keruh.

Metode pembentukan warna dengan pereaksi tertentu dalam analisis protein digunakan
secara umum sering digunakan BSA (Bovine Serum Albumin). Bovine Serum Albumin
merupakan pilihan yang baik untuk analisis protein dikarenakan tingkat kemurniannya tinggi serta
harganya tidak terlalu mahal. Bovine Serum Albumin (BSA) merupakan protein albumin yang
berasal dari sapi serta merupakan salah satu protein sederhana yang berbentuk globular. BSA dapat
rusak apabila terjadi pemanasan.

3. Metode Kjeldahl

Metode kjeldahl merupakan metode digunakan untuk uji kuantitatif protein. Metode
kjeldahl memiliki tingkat keakuratan tinggi dalam menentukan kandungan nitrogen dalam susu.
Kelebihan metode ini lebih akurat, sederhana dan universal. Metode ini juga mempunyai
kekurangan. Kekurangan dari metode ini yaitu membutuhkan waktu yang relatif lama,
membutuhkan biaya yang besar serta keterampilan tehnis tinggi.

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam
amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat
dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat.
Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke
dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

4. Metode Titrasi Formol

Titrasi formol digunakan untuk menunjukkan kadar N-amino dan dapat digunakan untuk
mengukur hidrolisis protein. Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan
formalin akan membentuk dimethilol. Dimethilol yang terbentuk pada reaksi berarti gugus
aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH
sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah indikator PP.
Akhir titrasi terjadi ketika terdapat perubahan warna dari tidak berwarna menjadi merah muda
yang tidak hilang dalam 30 detik.