I. Nomor Percobaan II. Nama Percobaan III.

Tujuan Percobaan

: V : Penentuan Kadar Protein Secara Biuret : Untuk menentukan kadar suatu protein dengan

menggunakan spektrometer IV. Landasan Teori Protein merupakan polimer asam amino. Ada puluh asam amino yang berbeda merupakan penyusun protein alami. Protein dibedakan satu sama lain berdasarkan tipe, jumlah dan susunan asam aminonya. Perbedaan ini menyebabkan perbedaan struktur molekuler, kandungan nutrisi dan sifat fisikokimia. Protein merupakan konstituen penting dalam makanan, dimana protein merupakn sumber energi sekaligus mengandung asamasam amino esensial seperti lysine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine dan valine (esensial berarti penting bagi tubuh, namun tidak bisa disintesis dalam tubuh). Protein juga merupakan komponen utama dalam berbagai makanan alami, yang menentukan tekstur keseluruhan, misalnya keempukan produk daging atau ikan, dan sebagainya. Protein terisolasi sering digunakan dalam makanan sebagai unsur kandungan (ingredient) karena sifat atau fungsi uniknya, antara lain kemampuannya menghasilkan penampilanm tekstur atau stabilitas yang diinginkan. Misalnya, protein digunakan sebagai agen pembentuk gel (gelling agent), pengemulsi (emulsifier), pembentuk busa (foaming agent) dan pengental (thickener). Beberapa protein makanan merupakan enzim yang mampi meningkatkan laju reaksi biokimia tertentu, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan merusak. Di dalam analisis makanan, mengetahui kadar total, jenis, struktur molekul dan sifat fungsional dari protein sangat penting. Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Apabila suatu cahaya yang mengandung seluruh spektrum dari panjang gelombang melewati suatu medium, misal kaca berwarna atau larutan yang meneruskan cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan menyerap cahaya yang lainnya maka medium seakan-akan berwarna. Warna ini sesuai dengan panjang gelombang yang diteruskan dan disebut sebagai warna komplementer. Sejumlah metode telah ditemukan untuk pengukuran kadar protein berdasarkan spektroskopi UV-visible. Metode ini berdasarkan kemampuan protein menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible. Atau secara kimiawi atau fisik memodifikasi protein untuk membuatnya menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible.

Prinsip dasar di balik masing-masing uji ini serupa. Pertama-tama, semua serapan kurva kalibrasi (atau turbiditas) vs kadar protein disiapkan menggunakan satu seri larutan protein yang sudah diketahui kadarnya. Serapan (atau turbiditas) larutan yang dianalisis kemudan diukur pada panjang gelombang yang sama, dan kadar protein ditentukan dari kurva kalibrasi. Perbedaan utama pengujian ini adalah gugus fungsi yang berperan untuk absorbsi atau pembiasan radiasi elektromagnetik, misalnya ikatan peptida, rantai samping aromatis, gugus inti dan agregat protein.

Sejumlah metode UV-visibe untuk penetapan kadar protein sebagai berikut : a. Pengukuran langsung pada 280nm. Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uv pada 280 nm. Kandungan tryptophan dan tyrosine berbagai protein umumnya konstan sehingga serapan larutan protein pada 280 nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya. Keuntungan metode ini karena sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak dibutuhkan reagen khusus. Kerugian utama : asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm dan sehingga mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna. Namun demikian, metode ini telah berkembang untuk mengatasi masalah ini, antara lain dengan pengukuran serapan pada dua panjang gelombang yang berbeda.

b. Metode Biuret Warna violet akan terbentuk bila ion cupri (Cu2+) berinteraksi dengan ikatan peptida dalam suasana basa. Reagen biuret, yang mengandung semua bahan kimia yang diperlukan untuk analisis sudah tersedia di pasaran. Reagen ini dicampurkan dengan larutan protein, didiamkan 15-30 menit, kemudian diukur serapannya pada 540 nm. Keuntungan utama dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah. Teknik ini kurang sensitif terhadap jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan pada gugus samping spesifik.

c. Metode Lowry Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (FolinCiocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm,

tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar di sekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein dengan konsentrasi rendah dibanding metode biuret.

d. Metode pengikatan pewarna Pewarna dengan muatan negatif (anionik) ditambahkan dalam jumlah berlebih pada larutan protein yang pH nya telah disesuaikan sehingga protein menjadi bermuatan positif (misalnya dibuat di bawah titik isoelektrik). Protein membentuk kompleks tak larut dengan pewarna karena interaksi elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat yang larut. Pewarna anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidine, arganine dan lysine) dan pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks protein-pewarna dipisahkan (misalnya dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan. Jumlah protein yang ada di larutan awal berhubungan dengan jumlah pewarna yang terikat : [Pewarnaterikat] = [Pewarnaawal] - [Pewarnabebas]

e. Metode Turbimetri Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur derajat kekeruhan (turbiditas).

Keuntungan dan kerugian menggunakan UV-visible Keuntungan : Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhadap protein dengan konsentrasi rendah.

Kerugian : Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan

larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan tersebut telah mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula)

HUKUM LAMBERT-BEER Lambert merumuskan hubungan antara absorbansi dan panjang gelombang yang ditempuh sinar dalam larutan. Log = k1 b ........................(1) = absorbansi

Dimana Log

P = tenaga radiasi yang keluar medium Po = tenaga radiasi yang masuk medium b = tebal lapisan medium Menurut Beer, absorbansi dipengaruhi oleh konsentrasi sehingga Log = k2 c ........................(2)

Bila k1 = f (c) dan k2 = f (b) maka substitusi dari persamaan (1) dan (2) adalah : Log = f (c) b Log = f (b) c

f (c) b = f (b) c = Maka Log =k = f (c) b = f (b) c = k b

Jika konsentrasi larutan dalam mol/liter maka k harus ditulis sebagai dimana = absortivitas molar Log = b c

Jika konsentrasi larutan dalam gram/liter maka k harus ditulis sebagai a dimana a = absortivitas Log A=a =a b c b c

Jika absorbsi = Log A = Log %T=

= transmitansi (T)

= Log = - log T x 100%

Metode least square Metode Least Square dipilih untuk pendekatan spektrofotometer menurut Hukum Beer yang merupakan dasar absorbsi. A=a Dimana : a = absortivitas b = tebal cuvet Bila A dialirkan untuk c terhadap cuplikan yang tebalnya b cm akan menghasilkan daerah dimana hukum Beer berlaku suatu garis lurus dengan lereng ab. A c = konsentrasi zat pengabsorbsi b c

Tetapi secara instrumentasi didapat grafik yang kurang memenuhi hubungan linier antara absorbsi dan konsentrasi pada penentuan absorbansi larutan sehingga untuk memenuhi hukum Beer kurva A vs C dipakai metode Least Square. y = mx + c dimana : y = absorbansi m = bilangan tetap (konstanta) x = kadar larutan seri Sedangkan m= c=

V. Alat dan Bahan Alat : Rak tabung reaksi Beker gelas Pipet tetes Spektrometer Tabung reaksi Gelas ukur Batang pengaduk Bahan : reagen-reagen reagen biuret : Larutkan 1,5 gr CuSO4.5H2O dan 6,0 gr natrium kalium tartrat (NaK C4O6.4H2O) kedalam kira-kira 500 ml air di labu takar 1 liter. Kemudian tambahkan 300 ml 10 % NaOH sambil d ikocok-kocok. Dan akhirnya tambahkan air sampai garis. Larutan biru ini dapat disimpan lama sekali. Apabila pembuatannnya kurang baik dapat terjadi endapan hitam atau merah. Reagen yang demikian tidak boleh dipakai. Larutan protein : buatlah larutan serum albumin murni atau kasein dalam air yang berkadar 10 mg per ml. untuk mudah larutannya tambahkan beberapa tetes 3 % NaOH.

VI. Prosedur Percobaan Pipet kedalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung 1 sampai 10 mg per ml. tambahkan 4 ml reagen biuret. Kocok dan diamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Hukum lambert-beer berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 dan 10 mg per ml.

VII. Hasil Pengamatan

Konsentrasi Kasein (mg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Adsorbansi (A) albumin 0,199 0,249 0,299 0,341 0,465 0,561 0,592 0,598 0,623 0,676

Adsorbansi (A) blanko 0,148 0,137 0,154 0,153 0,141 0,142 0,146 0,141 0,142 0,141

Absorbansi Sampel : 0.536

VIII. Reaksi Kimia

O O O H2N

Cu2+ + 2 H N 2

NH

H N

4 NaOH

HN
HN

Cu

NH
NH

4 HO 2

4Na

HO

N H

OH

IX.

Analisa Data X2 1 4 9 16 25 36 49 64 81 100

X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Y 0,199 0,249 0,299 0,341 0,465 0,561 0,592 0,598 0,623 0,676

XY 0,199 0,498 0,897 1,364 2,325 3,366 4,144 4,784 5,607 6,76

X= 55 Y= 4,603 N . XY - X . Y Slope (A) = N . X2 (X)2

XY = 29,944 X2 = 385

10(29,944) 55 (4,603) = 10 (385) (55)2 = 0,056091 Y . X2 - X . XY Intersep = N . X2 (X)2 4,603(385) 55 (29,944) = 10 . 385 (55)2 = 0,1518 Y = AX+ B Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (1) + 0,15 = 0,21 Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (2) + 0,15 = 0,27 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (6) + 0.15 = 0.51 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (7) + 0.15 = 0.57

Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (3) + 0,15 = 0,33 Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (4) + 0,15 = 0,39 Y = 0,06 X + 0,15 = 0,06 (5) + 0,15 = 0,45 X 0 1 2 Y 0.15 0.21 0.27

3 0.33

Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (8) + 0.15 = 0.63 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (9) + 0.15 =0.69 Y = 0.06 X + 0.15 = 0.06 (10) + 0.15 = 0.75 4 5 6 7 0.39 0.45 0.51 0.57

8 0.63

9 0.69

10 0.75

Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.21 0.15 0.33 0.27 0.39 0.51 0.45 0.63 0.57 0.69

0.75

10

Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin dalam regresi linear
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.75 0.69

absorbansi

0.15 1

0.21

0.27

0.33

0.39

0.45

0.51

0.57

0.63

10

kadar albumin

Dengan menggunakan kurva standar konsentrasi vs absorban maka konsentrasi sample X yang memiliki Absorbansi= 0.536 dapat ditentukan dengan rumus berikut : = = = = =

X.

Pembahasan Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau

absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Terdapat beberapa metode spektrofotometri untuk penetapan kadar protein yaitu Pengukuran langsung pada 280nm, Metode Biuret, Metode Lowry, Metode pengikatan pewarna dan Metode Turbimetri. Namun pada percobaan kali ini penentuan kadar protein dengan menggunakan metode biuret. Dimana protein yang akan di uji adalah larutan albumin. Pada percobaan kali ini, larutan protein di buat dari 1 sampai 9 mg per ml yang di encerkan dari larutan albumin 10%. Setelah larutan protein dibuat lalu dimasukkan dalam tabung reaksi dan semua tabung tadi ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret dan dikocok lalu diamkan selama 30 menit. Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan buih karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi biuret, sampel didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan operating time yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 30 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu. Selain itu digunakan juga larutan blanko, larutan blanko merupakan larutan tidak berisi analit. Larutan blanko biasanya digunakan untuk tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko diberi perlakuan yang sama seperti larutan albumin. Setelah itu akan terlihat warna biru ungu pada semua tabung reaksi tadi. Pembentukan warna biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu+2. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu spectrometer UV pada panjang gelombang 540 nm, dengan alat ukur ini kita dapat secara sfesifik mengukur absorbansi atau % T dari senyawa yang mengandung unsure logam, oleh sebab itulah larutan standar ditambahkan dengan reagen biuret yaitu reagen yang mengandung ion logam dalam hal ini adalah Cu2+. Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama adalah CuSO4 dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah K-NaTartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana

basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Dari hasil pengukuran pada spektrofotometer, didapatlah harga absorbansi pada masing-masing konsentrasi yaitu 0.249, 0.299, 0.341, 0.465, 0.561, 0.592, 0.598, 0.623, 0.676. Data tersebut menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi harga absorbansi yang didapat semakin besar. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi yang berbanding lurus, yaitu semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya. XI. Kesimpulan 1. Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret, terjadi pembentukan warna biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu2+. 2. Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang bewarna ungu. 3. Semakin tinggi konsentrasi larutan protein maka semakin banyak ikatan peptida dalam larutan yang menyebabkan pembentukan kompleks semakin banyak, ini dapat dilihat dari warna biru ungu yang semakin pekat. 4. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu spektrometer UV pada panjang gelombang 540 nm. 5. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu 6. Semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula daya serapnya.

XII. Daftar Pustaka Anonim. (2012,Juni 09). Penentapan Totap Protein Serum Dengan Metode Biuret. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://smartfresh.blogspot.com/2012/06/penetapan-total-protein-serum-dengan.html Poedjiadi, Anna.1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press. Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. Lesmana, I. (2011,Maret 01). Fungsi Larutan Blanko. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://indralesman.blogspot.com/2011_03_01_archive.html

Lampiran : a. Gambar Alat

Pipet tetes

Beaker Gelas

Gelas Ukur

Erlenmeyer Spektometer

b. Jawaban Pertanyaan

1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang diberikan
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konsentrasi Albumin

Karena diketahui harga adsorbansi sampel sebesar 0,536 maka konsentrasi sampelnya terletak antara 5-6 mg/ml = = = = =

2. Berikan penjelasan tentang hukum Lambert-beer Jawab : Hukum lambert-beer menyatakan hubungan antara konsentrasi dengan adsorbansi yang semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya. Hal ini ditunjukkan dengan bentuk kurva yang linear antara konsentrasi dan adsorbannya.

3. Senyawa apakah yang dapat menganggu cara biuret seperti di atas ? Jawab : Senyawa yang memberikan endapan warna hitam atau merah pada reagen biuret yaitu garam amonia. Jika hal tersebut terbentuk maka reagen biuret tidak terbentuk.

Adsorban

4. Mengapa reaksi tersebut juga disebut dengan reaksi biuret ? Jawab : Karena menggunakan reagen biuret

5. Senyawa kompleks apa yang terjadi ? Jawab : Senyawa kompleks bewarna ungu

6. Apakah peptida juga memberikan reaksi biuret, jika memberikan, berikan penjelasan dan bagaimana cara menentukan kadar protein yang bercampur di dalam peptide ? Jawab : Ya, karena pada uji tersebut berfungsi untuk menunjukkan adanya ikatan peptida pada molekul protein dengan memberikan efek warna ungu. Cara menentukannya yaitu dengan menambahkan reagen biuret pada larutan protein dengan pengukuran adsorbansi.