PRAKTIKUM BIOKIMIA

UJI PROTEIN DAN PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

OLEH

PUTU AYU WULANDARI /1703051004

PROGRAM STUDI DIII ANALIS KIMIA

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA

TAHUN 2019
 I. TUJUAN PERCOBAAN
Tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk menguji protein dengan
menggunakan reagent biuret dan untuk mengetahui kadar protein dengan menggunakan
metode biuret.
II. REAKSI
III. LANDASAN TEORI
Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan
kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino
tertentu dengan susunan yang sudah tertentu pula dan bersifat turunan
Struktur protein dapat dikelompokkan menjadi empat kelas, yaitu struktur primer,
sekunder, tersier dan kwartener. Keempat struktur tersebut pada dasarnya dibedakan atas
jenis dan jumlah ikatan/interaksi kimia. Untuk mengidentifikasi protein berdasarkan
ikatan peptidanya dilakukan beberapa uji. Uji –uji yang dilakukan adalah Uji Penentuan
Konsentasi Protein Cara Biuret, Reaksi Pengendapan, dan Reaksi Perubahan Warna yang
meliputi Uji Biuret, Xantoprotein, Millon, Ninhidrin, dan Sulfur
Sebagian besar ilmu kimia organisme hidup menyangkut 5 golongan senyawa utama,
yaitu: karbohidrat, lipida, mineral, asam nukleat dan protein. Protein menentukan
kebanyakan sifat-sifat yang ditemukan dalam kehidupan. Protein memiliki berbagai
fungsi biologis yang berbeda-beda yaitu, Katalis enzim, Transport dan penyimpanan,
Fungsi mekanik, Pergerakan, Pelindung dan Proses informasi.
Protein utama merupakan makro molekul yang paling berlimpah didalam sel dan
menyusul lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein
merupakan instrument yang mengekspresikan informasi genetik. Seperti juga terdapat
ribuan gen didalam inti sel. Masing-masing mencirikan suatu sifat nyata dari organisme,
didalam sel terdapat ribuan jenis protein yang berbeda. Masing-masing membawa fungsi
spesifik yang dibentuk oleh gen yang sesuai. Protein, karenanya bukan hanya merupakan
makromolekul yang berlimpah. Tetapi juga amat bervariasi. Protein adalah suatu zat
dalam susunan kimianya mengandung unsur-unsur oksigen, karbon, hydrogen, nitrogen
dan kadang-kadang mengandung unsur-unsur lain seperti sulfur dan fosfor
Asam amino merupakan satuan penyusun protein. Berdasarkan rumus bangunnya
asam amino dapat dipandang sebagai turunan karboksilat, yang salah satu hidrogenya
diganti oleh gugus amino (-NH3). Protein dapat dipecah kembali menjadi asam amino,
yaitu dengan memakai asam, basa, ataupun hidrolisis dengan enzim. Asam amino
tergolong amfoter yaitu dapat bereaksi asam atau basa .
Pemeriksaan protein umumnya berdasarkan reaksi warna. Reaksi ini adalah reaksi-
reaksi khas protein yang berdasarkan ikatan peptide maupun adanya sifat-sifat tertentu
dari asam amino yang dikandungnya. Salah satunya adalah dengan menggunakan
reagent biuret.
Uji biuret digunakan untuk menunjukkan adanya ikatan peptida dalam suatu zat yang
diuji. Adanya ikatan peptida mengindikasikan adanya protein, karena asam amino
berikatan dengan asam amino yang lain melalui ikatan peptida membentuk protein.
Ikatan peptida merupakan ikatan yang terbentuk ketika atom karbon dari gugus karboksil
suatu molekul berikatan dengan atom nitrogen dari gugus amina molekul lain. Reaksi
tersebut melepaskan molekul air sehingga disebut reaksi kondensasi.

Uji biuret, reaksi ini umumnya untuk peptide dan protein, termasuk diantaranya hasil
hidrolisis protein seperti metaprotein, protease, pepton, polipeptida, kecuali asam amino.
Reaksi positif terjadi dengan adanya warna ungu atau merah muda akibat terjadinya
senyawa antara Cu dan N dari air. Bila ikatan peptide panjang warnanya ungu sebaliknya
bila pendek warnanya merah muda. Prinsip uji biuret didasarkan pada reaksi antara ion
Cu2+ ikatan peptida dalam suasana basa.
Metode pengukuran kadar protein kali ini adalah metode Biuret. Metode ini
berprinsip pada reaksi yang terjadi antara ion tembaga dengan ikatan peptide yang ada
pada protein. Reaksi Biuret menggunakan tiga macam reagen, yaitu reagen A, B, dan C.
Reagen A mengandung CuSO4 dalam akuades. CuSO4 berfungsi sebagai penyedia ion
Cu2+ untuk membentuk kompleks dengan protein. Reagen B mengandung KI dalam
akuades. KI berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu 2+ sehingga tidak
mengendap. Reagen C mengandung Na-sitrat, Na2CO3, dan NaOH. Na-sitrat dan Na2CO3
berfungsi sebagai buffer dan NaOH berfungsi untuk menyediakan seasana basa.
 Uji ini dapat mendeteksi kehadiran ikatan peptida. Uji Biuret didasarkan pada reaksi
antara ion Cu2+ dan ikatan peptida dalam suasana basa. Warna kompleks ungu
menunjukkan adanya protein. Intensitas warna ynag dihasilkan merupakan ukuran jumlah
ikatan peptida yang ada dalam protein. Ion Cu 2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa
akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan
membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua
buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau ikatan peptida.
Protein melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksi
pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil
yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon. Kelebihan metode pengukuran dengan
menggunakan metode Biuret ialah mudah dilakukan dan menggunakan bahan yang
murah. Namun, kekurangannya ialah metode ini memerlukan bahan yang cukup karena
sensitivitasnya yang rendah.
IV. ALAT DAN BAHAN
Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu neraca analitik, sendok bahan,
spatula, gelas beaker, labu ukur, gelas ukur, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes,
pipet volume, dan spektrofotometer UV-Vis. Bahan – bahan yang digunakan yaitu larutan
CuSO4.5H2O 10g/L, larutan NaOH 10 N, sampel protein (albumin, kasein, gelatin dan
pepton) 5g/L, dan aquadest.
V. PROSEDUR KERJA
Pertama – tama dilakukann preparasi reagent biuret dengan cara CuSO4.5H2O
ditimbang sebanyak 2,5 gram pada neraca analitik. Kemudian CuSO 4.5H2O dilarutkan
dalam 50 mL aquadest. Setelah itu dilakukan preparasi sampel dengan cara masing –
masing sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram kemudian dilarutkan dalam 50 mL
aquadest. Kemudian sampel protein dimasukkaan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 mL,
kemudian ditambahkan 5 tetes larutan CuSO4 dan 2 mL larutan NaOH. Kemudian tabung
reaksi dikocok dan diamati perubahan warna yang terjadi.
Kedua, dilakukan penentuan kadar protein pada sampel dengan menggunakan alat
spektrofotometri UV-Visibel. Dilakukan preparasi reagent biuret dengan cara
CuSO4.5H2O ditimbang sebanyak 0,15 gram pada neraca analitik. Kemudian kalium
natrium tartrat ditimbang sebanyak 0,6 gram pada neraca analitik. Kemudian keduanya
dilarutkan dalam sedikit aquadest dan ditambahkan 30 mL larutan NaOH 10%. Larutan
ini dikocok dan diencerkan menjadi 100 mL. Setelah itu dibuat larutan standar protein
 dengan cara dibuat larutan albumin fraktion V dengan variasi konsentrasi 2000 ppm,
1600 ppm, 1200 ppm, 800 ppm dan 400 ppm, jika sulit larut, ditambahkan beberapa tetes
larutan NaOH 3%. Larutan standar protein 2000 ppm dibuat dengan cara albumin
fraktion V ditimbang sebanyak 0,02 gram dan dilarutkan dalam 10 mL aquadest. Larutan
standar protein dibuat dengan cara larutan standar protein 2000 ppm diambil sebanyak 8
mL dan diencerkan dalam labu ukur 10 mL, larutan standar protein 1200 ppm dibuat
dengan cara larutan standar 1600 ppm diambil sebanyak 7,5 mL kemudian diencerkan
menjadi 10 mL, larutan standar 800 ppm dibuat dengan cara larutan standar protein 1600
ppm diambil sebanyak 6,67 mL kemudian diencerkan sampai 10 mL, dan larutan standar
protein 400 ppm dibuat dengan cara larutan standar protein 800 ppm diambil sebanyak 5
ml dan diencerkan sebanyak 10 mL. Larutan sampel protein (pepton dan gelatin) dibuat
dengan konsentrasi 1200 ppm dengan cara 0,012 gram sampel dilarutkan dalam 10 mL
aquadest. Kemudian masing – masing larutan standar dipipet sebanyak 1 mL dimasukkan
ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 4 mL reagent biuret, perlakuan yang
sama dilakukan pada larutan sampel protein. kemudian dibuat blanko dengan perlakuan
yang sama. Kemudian larutan ini dikocok dan didiamkan selama 30 menit dalam suhu
kamar. Kemudian dibaca serapannya pada panjang gelombang 540 nm.
VI. DATA PENGAMATAN
Setelah dilakukan percobaan didapatkan hasil sebagai berikut:

No Sampel Warna larutan Keterangan

Sebelum ditambah Setelah ditambah reagent
reagen biuret biuret
1 Blanko Bening Bening Uji negatif
2 Gelatin Bening Ungu bening Uji positif
3 Pepton Bening Abu- abu Uji negatif
4 Albumin Bening Ungu tua Uji positif
5 Kasein Putih susu Ungu muda Uji positif
Tabel 1. Uji protein secara kualitatif dengan reagent biuret
VII. PERHITUNGAN
 1. CuSO4.5H2O =
5. Larutan standar protein 2000 ppm

2. Sampel = 6. Larutan standar protein 1600 ppm

7. Larutan standar protein 1200 ppm

3. Larutan NaOH 10% 50 mL

8. Larutan standar 800 ppm

9. Larutan standar 400 ppm

4. Pengenceran larutan NaOH 10%
menjadi 3% 10 mL

VIII. ANALISIS DATA

1. Konsentrasi protei dalam sampel pepton

2. Konsentrasi protein dalam sampel gelatin

IX. PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan uji protein secara kualitatif dengan menggunakan
reagent biuret yang ditandai dengan perubahan warna setelah ditambahkan reagent biuret
serta menentukan kadar protein pada sampel dengan menggunkan metode biuret. Reagen
biuret yang mengandung Ion Cu2+ dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida
atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu atau violet. Sampel yang digunakan pada praktikum ini yaitu gelatin,
pepton, albumin (putih telur) dan kasein (susu kental manis).
Uji biuret adalah uji yang digunakan untuk menguji adanya dua/lebih ikatan
peptida dalam suatu sampel. Hasil positif akan ditunjukkan dengan terbentuknya cincin
berwarna ungu pada permukaan larutan. Hal ini terjadi karena Cu masuk dalam struktur
asam amino, mengikat empat asam amino pada ikatan N-H nya dengan tangannya untuk
kemudian membentuk kompleks warna ungu. Sedangkan hasil negatif akan ditunjukkan
dengan terbentuknya kompleks warna biru.
Langkah awal dalam melakukan pengujian adalah memasukkan sebanyak 2 ml
sampel ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan sebanyak 2 mL NaOH. Tabung
reaksi dikocok. Penambahan NaOH yang bersifat alkali bertujuan untuk menciptakan
suasana basa pada pengujian protein. Selain itu, penambahan basa juga berfungsi untuk
menjaga struktur protein dan katalisator. Penambahan NaOH belum menentukan hasil
positif atau negatif dari sampel, karena seharusnya tidak terjadi perubahan warna pada
sampel. Sebelum ditambahkan larutan CuSO4 sampel gelatin, pepton dan albumin
berwarna bening sedangkan sampel kasein berwarna putih susu (gambar 1). Langkah
selanjutnya adalah menambahkan 5 tetes CuSO4 ke dalam tabung reaksi. Pada saat
perubahan warna mulai terbentuk sampel tidak perlu dilakukan pengocokan. Warna ungu
akan muncul dan menyebar jika CuSO4 bereaksi dengan ikatan peptida pada sampel.
Semakin pekat warna ungu yang muncul menandakan semakin banyak jumlah ikatan
peptida pada sampel.
Sampel pertama diujikan pada gelatin. Hasil pengujian dinyatakan positif pada
pada gelatin karena terjadi perubahan warna dari bening menjadi ungu bening (gambar
2). Hasil tersebut juga sudah sesuai dengan literatur. Gelatin merupakan bagian dari
kolagen, protein kompleks penyusun jaringan ikat pada hewan, sehingga ikatan peptida
yang dimilikinya pasti berjumlah banyak.Gelatin memiliki ikatan peptida karena gelatin
tersusun dari beberapa asam amino yaitu prolin, hidroksiprolin, sistein dan triptofan.
Pembentukan ikatan peptida terbentuk karena sifat amfoternya, maka dua molekul asam
amino atau lebih dapat bersenyawa satu sama lain.
 Sampel yang kedua yaitu pepton, hasil pengujian dikatakan negatif karena terjadi
perubahan warna larutan dari bening menjadi abu – abu setelah ditambah reagent biuret,
hal ini tidak sesuai dengan teori (gambar 3). Seharusnya perubahan warna yang terjadi
adalah warna ungu. Kesalahan ini terjadi karena sampel kasein yang digunakan sudah
kadaluwarsa.
Sampel ketiga yaitu albumin (putih telur). Pada sampel putih telur, ketika putih
telur di tambahkan dengan NaOH putih telur akan berubah menjadi sedikit kental. Hal ini
dikarenakan adanya ikatan peptide dalam putih telur yang menandakan adanya protein.
Setelah ditambahkan CuSO4 putih telur yang sebelumnya berwarna bening kemudian
berubah menjadi warna ungu tua (gambar 4). Hal ini terjadi karena warna ungu yang
terbentuk berasal dari kompleks koordinasi antara Cu 2+ dengan gugus amida karboksil
dari ikatan peptida dalam larutan basa.
Sampel kempat yaitu kasein dari susu kental manis. Hasil pengujian menunjukkan
susu kental manis positif mengandung dua atau lebih ikatan peptida dengan perubahan
warna yang awalnya berwarna putih susu menjadi ungu muda (gambar 5). Susu kental
manis memiliki ikatan peptida didalamnya meskipun susu kental manis tersusun dari
asam-asam amino yang membentuk ikatan peptida yang tidak begitu panjang. Hal
tersebut sudah cukup untuk dapat diidentifikasi dengan menggunakan uji biuret. Hal ini
sudah sesuai dengan literatur. Susu kental manis merupakan salah satu jenis protein
kompleks, sehingga di dalamnya terdapat lebih dari 2 ikatan peptida. Karena memiliki
lebih dari dua ikatan peptida, maka dihasilkan cincin berwarna ungu.
Berdasarkan hasil pengamatan yang kami dapatkan, larutan yang memiliki warna
ungu paling pekat adalah sampel larutan albumin (putih telur). Yang kedua yaitu kasein
(susu kental manis) dan yang ketiga yaitu gelatin. Hal ini sesuai dengan dasar teori yang
ada, dimana sampel yang memiliki lebih banyak kandungan protein maka warnanya akan
semakin pekat. Dimana dari ketiga sampel larutan yang memiliki protein paling banyak
yaitu albumin (putih telur), kemudian kasein (susu kental manis) dan terakhir adalah
gelatin.
Setelah dilakukan uji protein secara kualitatif selanjutkan dilakukan uji kuantitatif
yaitu penentuan konsentrasi protein cara biuret dengan menggunakan alat
spektrofotometer UV-Visibel. Adapun prinsip kerja dari spektrofotometer adalah bila
cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian
dari sinar yang masuk akan dipantulkan dan sebagian diserap dalam medium itu. Dan
sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai
absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.
Pada penentuan konsentrasi protein cara biuret dengan menggunakan alat
spektrofotometer. Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur
absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada
suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut cuvet.
Adapun prinsip kerja dari spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik
maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar yang masuk
akan dipantulkan dan sebagian diserap dalam medium itu. Dan sisanya diteruskan. Nilai
yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena
memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.
Nilai absorbansi suatu larutan dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi protein.
Pada sampel pepton dan gelatin bantuan kurva standar dengan menggunakan rumus

persamaan garis lurus yaitu .Pengukuran konsentrasi dengan spektrofotometer

didasarkan pada hukum Lambert-Beer, yang menyatakan bahwa pengukuran intensitas
cahaya yang masuk dibandingkan dengan banyaknya atom-atom dan panjang medium
serapan.
Hasil pengamatan yang telah kami lakukan yaitu menggunakan larutan standar
protein dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu dengan konsentrasi 400 ppm, 800
ppm, 1200 ppm, 1600 ppm dan 2000 ppm yang kemudian di tambahkan dengan 4 mL
reagen biuret di dapatka hasil berturut-turut 0,026 nm, 0,035 nm, 0,037 nm, 0,046 nm
dan 0,086 nm. Hal ini sesuai dengan Hukum Beer menyatakan absorbansi cahaya
berbanding lurus dengan dengan konsentrasi dan ketebalan bahan/medium. Dari data ini
dibuat kurva kalibrasi sebagai berikut:
 Nilai regresi yang diperoleh adalah. Nilai regresi yang baik adalah mendekati 1 sehinga
kurva kalibrasi linear (garis lurus) sehingga hasil ini dapat dijadukan acuan. Fungsi
pembuatan kurva standar adalah untuk menunjukkan besarnya konsentrasi larutan sampel
dari hasil pengukuran sehingga konsentrasi sampel larutan bisa diperoleh dengan mudah
melalui kurva standar. Kurva standar menunjukkan hubungan antara konsentrasi larutan
dengan absorbansi larutan. Dari kurva diatas diperoleh persamaan yang diregresilinierkan
yaitu y = 05x + 0,0078. sehingga dari persamaan tersebut dapat dihitung konsentrasi
sampel pepton dan gelatin dengan adsorbansi berturut – turut 0,010 nm dan 0,016 nm.
Dari hasil perhitungan didapatkan konsentrasi protein dalam pepton sebesar 0,00356 ppm
dan konsentrasi protein dalam gelatin sebesar 0,00476 ppm.
X. PERTANYAAN
Uji Kuantitatif
1. Buatlah kurva standar protein
 2. Tentukan kadar protein yang diukur
Dari hasil perhitungan kadar protein dalam sampel pepton sebesar 0.00356 ppm dan
kadar protein dalam gelatin sebesar 0,00476 ppm.
XI. KESIMPULAN
Dari pembahasan sebelummnya dapat disimpulkan bahwa uji protein secara
kualitatif dengan reagent biuret sangat efektif untuk menentukan ikatan petida di dalam
sampel melalui perubahan warna yang ditimbulkan. Pada percobaan sampel gelatin,
albumin (putih susu) dan kasein (susu kental manis) menunjukkan uji positif karena
membentuk warna ungu setelah ditambahkan reagent biuret. Sedangkan untuk sampel
pepton menunjukkan uji negatif dengan menimbulkan warna abu – abu karena memang
sampel pepton yang digunakan telah kadaluwarsa.
Hasil uji kuantitatif protein dengan menggunakan alat spektrofometer UV-Vis
didapatkan konsentrasi (kadar) protein dalam sampel pepton dan gelatin berturut – turut
yaitu 0,00356 ppm dan 0,00476 ppm.
DAFTAR PUSTAKA