A. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret B. Mulai Percobaan : Senin, 28 Oktober 2013 C.

Selesai Percobaan : Senin, 28 Oktober 2013 D. Tujuan : Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode Biuret.

E. Dasar Teori : Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa selain polisakarida, lipid dan polinukleotida yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein itu sendiri mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitroge dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein dirumuskan oleh Jons Jakob Berzelius pada tahun 1938. Struktur protein ada 4 tingkatan yaitu : 1. Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis, dan urutan asam amino dalam molekul protein (rentetan asam amino dalam suatu molekul protein) 2. Struktur sekunder menunjukkan banyak sifat suatu protein, ditentukan oleh orientasi molekul sebagai suatu keseluruhan, bentuk suatu molekul protein (misalnya spiral) dan penataan ruang kerangkanya (ikatan hidrogen antara gugus N-H, salah satu residu asam amino dengan gugus karbonil C=O residu asam yang lain) 3. Struktur tersier menunjukkan keadaan kecenderungan polipeptida membentuk lipatan tali gabungan (interaksi lebih lanjut seperti terlipatnya kerangka untuk membentuk suatu bulatan) 4. Struktur kuartener menunjukkan derajat persekutuan unit-unit protein.

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu: 1. Protein sederhana yang merupakan protein yang hanya terdiri atas molekul-molekul asam amino

2.

Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas karbohidrat, lipid atau asam nukleat.

Protein sederhana menurut bentuk molekulnya dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu: 1. Protein fiber. Molekul protein ini terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang memanjang dan dihubungkan satu sama lain oleh beberapa ikatan silang hingga merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Protein fiber tidak larut dalam pelarut-pelarut encer, baik larutan garam, asam, basa ataupun alkohol. Berat molekulnya yang besar belum dapat ditentukan dengan pati dan sukar dimurnikan. Kegunaan protein ini hanya untuk membentuk struktur jaringan dan bahan, contohnya adalah keratin pada rambut. 2. Protein globular. rotein globular pada umumnya berbentuk bulat atau elips dan terdiri atas rantai polipeptida yang terlibat. Protein globular/speroprotein berbentuk bola, protein ini larut dalam larutan garam dan asam encer, juga lebih mudah berubah di bawah pengaruh suhu, konsentrasi asam dan asam encer. Protein ini mudah terdenaturasi. Banyak terdapat pada susu, telur dan daging. Reaksi-reaksi kahas pada protein (uji kualitatif) 1. Reaksi Ninhidrin. Ninhidrin beraksi dengan asam amino bebas da protein menghasilkan warna biru. Reaksi ini termasuk yang paling umum dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya. Reaksi ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein oleh cairan tubuh. 2. Reaksi Biuret. Bila larutan protein dalam suasana basa kuat direaksikan dengan larutan CuSO4 pekat, akan dihasilkan warna ungu. Warna yang dihasilkan dari reaksi tersebut disebabkan oleh ikatan koordinasi antara ion Cu2+ dengan pasangan elektron bebas dari N yang berasal dari

protein dan pasangan elektron bebas dari O molekul air. Reaksi ini tidak berlaku untuk peptida. 3. Reaksi Uji Millon untuk Tirosin. Reagen Millon adalah larutan asam nitrat yang mangandung raksa (I) nitrat dan raksa (II) nitrat. Bila reagn millon dicampurkan dengan larutan yang mengandung protein akan terbentuk endapan putih yang akan berubah merah bila dipanaskan. 4. Uji Penetralan Titik Isoelektrik. Titik isoelektrik adalah daereah pH tertentu dimana protein mempunyai selisih muatan, sehingga tidak bergerak dalam muatan listrik Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua mulekul urea. Ion Cu2+ dari preaksi Biuret dalam suasana basa akan berekasi dengan polipeptida atau ikatan-ikatn peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida. Isi dari pereaksi biuret adalah Kalium hidroksida (KOH), Tembaga (II) sulfat (CuSO4), Kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6). Pembuatan reagen biuret: Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda.

F. Alat Dan Bahan: Tabung reaksi Larutan standar protein Larutan sampel protein Spektrofotometer UV-VIS Reagen biuret

G. Alur Percobaan 1. Pembuatan standar

1 ml larutan standar protein Dimasukkan dalam tabung reaksi I,II,III,IV,V dengan kadar protein

1 mg/ ml

2 mg/ ml

3 mg /m l

4 mg /ml

5 mg/ ml

+ 4 ml reagen biuret pada masing masing tabung reaksi Dikocok Diinkubasikan 30 menit pada suhu ruangan Diukur absorbansinya pada optimum dengan alat spektronik

hasil

2. Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

1 ml aquades hasil Dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar Diukur absorbansinya pada optimum

3. Penetapan absorbansi larutan sampel

1 ml sampel Dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar Diukur absorbansinya pada optimum hasil

H. Hasil Pengamatan
No. 1. Prosedur kerja Pembuatan standar 1 ml larutan standar protein Dimasukkan dalam tabung reaksi I,II,III,IV,V dengan kadar protein Hasil pengamatan Sebelum Sesudah Larutan Larutan standar standar protein 1 mg/ml + protein : reagen biuret : Cair, jernih, jernih ungu(+) tidak Larutan standar berwarna protein 2 mg/ml + Reagen reagen biuret : biuret : jernih ungu (++) Cair,jernih , Larutan standar biru (+++) protein 3 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (+++) Larutan standar protein 4 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (++++) Larutan standar protein 5 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (+++++) Dugaan reaksi Larutan basa Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghasilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang 520 nm. Kesimpulan Konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi panjang gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi maka semakin ungu warna larutannya. Persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein : Y = 0,0503x 0,0281 Konsentrasi rata-rata sampel: 0,8171 mg/mL

1 mg/ ml

2 mg/ ml

3 mg /m l

4 mg /ml

5 mg/ ml

+ 4 ml reagen biuret pada masing masing tabung reaksi Dikocok Diinkubasikan 30 menit pada suhu ruangan Diukur absorbansinya pada optimum dengan alat spektronik

hasil

Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

2. 1 ml aquades Dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar Diukur absorbansinya pada optimum Aquades : jernih tak berwarna Reagen biuret : jernih biru (+++)

Blanko = biru Melalui excel, didapatkan persamaan Y = 0,0503x 0,0281 R2 = 0,936 Persamaan berdasarkan kurva Y = 0,0503x 0,0281 Konsentrasi sampel 1 = 1,0358 2 = 0,7376 3 = 0,6779 Konsentrasi rata-rata sampel = 0,8171 mg/mL

hasil

3.

Penetapan absorbansi larutan sampel 1 ml sampel Dimasukkan ke dalam tabung reaksi + 4 ml reagen biuret Dikocok Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar Diukur absorbansinya pada optimum hasil

Sampel : jernih tak berwarna Reagen biuret : jernih biru

I. Analisis Data Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret. Dengan adanya ikatan peptida, ion tembaga (II) pada reagen biuret membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dalam larutan alkali. Penentuan protein secara biuret didasarkan atas pengukuran serapan cahaya (absorbansi) oleh oleh senyawa kompleks yang berwarna ungu menggunakan prinsip spektrofotometri UV-VIS. Reaksi biuret dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi protein karena ikatan peptida muncul dengan frekuensi yang sama per asam amino dalam peptida. Sesuai dengan hukum Lambert-beer, konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang maksimum. 1. Pembuatan Standar Pembuatan serta penetapan absorbansi larutan standard bertujuan untuk membuat kurva standar dimana diperlukan larutan standar protein dengan konsentrasi 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml dan 5 mg/ml.. Larutan standar dibuat dari pengenceran larutan awal 10 mg/ml yang berupa larutan jernih tidak berwarna. Pengenceran didasarkan pada persamaan: M1 x V1 = M2 x V2 Labu ukur yang digunakan untuk pengenceran adalah labu ukur 20 ml. Konsentrasi awal (M1) 10 mg/ml 5 mg/ml 4 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml Volume yang diencerkan (V1) 10 ml 16 ml 15 ml 13,3 ml 10 ml Konsentrasi hasil pengenceran (M2) 5 mg/ml 4 mg/ml 3 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml Volume hasil pengenceran (V2) 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml

Hasil pengenceran berupa larutan tidak berwarna. Sebanyak 5 tabung reaksi diisi masing-masing 1 mL larutan standar protein dengan kadar 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, dan 5 mg/ml. Setelah

itu ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam masing-masing tabung. Reagen biuret ini berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Reagen ini mengandung NaOH dan CuSO4. Secara teori pada penambahan reagen biuret akan menghasilkan warna ungu dimana warna ungu dihasilkan dari reaksi antara reagen biuret dengan protein yang menghasilkan suatu senyawa kompleks. Warna dari larutan protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi. Semakin besar konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat warna yang terbentuk, dan begitu juga sebaliknya. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:

Hasil penambahan tabung dengan reagen biuret: Tabung 1 (1 mg/ml): ungu Tabung 2 (2 mg/ml): ungu (+) Tabung 3 (3 mg/ml): ungu (++) Tabung 4 (4 mg/ml): ungu (+++) Tabung 5 (5 mg/ml): ungu (++++) Setelah penambahan biuret, larutan dikocok dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC, kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil reaksi larutan protein dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi masing-masing

larutan pada masing-masing larutan pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-VIS.

Tabel hasil absorbansi masing-masing larutan standart: konsentrasi (mg/ml) 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 absorbansi 0,000 0,009 0,034 0,124 0,197 0,221

Kurva standar

KURVA STANDART BIURET

0.250 0.200 konsentrasi (mg/ml) 0.150 0.100 0.050 0.000 0.000 -0.050 y = 0.0503x - 0.0281 R = 0.936

1.000

2.000

3.000 absorbansi

4.000

5.000

6.000

Kurva ini menunjukkan bahwa hasil percobaan sesuai dengan teori bahwa konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin ungu warna larutan, hal ini mengakibatkan cahaya yang diserap lebih tinggi yang menyebabkan nilai absorbansinya lebih tinggi. Dan didapatkan persamaan y = 0,0503x 0,0281, dengan nilai regresi kelinearan = 0,936. Seharusnya didapatkan

hasil regresi 0,99 untuk mendapatkan hasil absorbansi yang maksimal. Hal ini akan dibahas dalam diskusi.

2. Penetapan absorbansi larutan blanko Penetapan absorbansi larutan blanko berfungsi sebagai faktor pengurang dari absorbansi standar dan sampel karena standar dan sampel tidak murni namun hasil dari pengenceran yang ditambah aquades. Tabung reaksi diisi 1 ml aquades, kemudian ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam tabung. Reagen biuret ini berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Aquades tidak mengandung protein jadi warna larutan menjadi seperti reagen biuret, yaitu biru muda. Lalu diinkubasikan pada suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC, kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil reaksi larutan dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi aquades pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-VIS. Hasil absorbansi ini sebagai faktor pengurang dari absorbansi standar dan sampel karena standar dan sampel tidak murni namun hasil dari pengenceran yang ditambah aquades.

3. Penetapan absorbansi larutan sampel Penetapan hasil absorbansi ini digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel. Tabung reaksi diisi 1 ml sampel, kemudian ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam tabung. Warnanya menjadi biru. Reagen biuret ini berfungsi untuk

mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Lalu diinkubasikan pada suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC, kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil

reaksi larutan dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi aquades pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-VIS. Perlakuan ini diulangi tiga kali. Hasil absorbansi yang didapat: 0,024, 0,009, dan 0,006. Dengan menggunakan persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein y = 0,0503x 0,0281. Didapatkan konsentrasi sampel berturut-turut 1,0358; 0,7376; dan 0,6779. Konsntrasi rata-rata pada sampel = 0,8171 mg/ml.

J. Diskusi Nilai regresi kelinearan yang didapat dari hasil percobaan = 0,936. Seharusnya didapatkan hasil regresi 0,99 untuk mendapatkan hasil absorbansi yang maksimal. Hasil ini dikarenakan kekurangtelitian kami dalam melakukan pengenceran larutan standar, kurang teliti dalam mengambil volume larutan yang tidak tepat. Selain itu juga dapat dikarenakan proses inkubasi yang dilakukan belum maksimal dan warna belum mengembang.

K. Kesimpulan Dari hasil percobaan dapat kami simpulkan sebagai berikut : Konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin ungu warna larutan, hal ini mengakibatkan cahaya yang diserap lebih tinggi yang menyebabkan nilai absorbansinya lebih tinggi. Hasil absorbansi larutan blanko digunakan sebagai faktor pengurang dari absorbansi standar dan sampel. Persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein y = 0,0503x 0,0281. Konsentrasi rata-rata sampel = 0,8171 mg/ml.

L. Daftar Pustaka Fesenden, J Ralp, dan Joan S. Fessenden. 2006. Kimia Organik Jilid 2. Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Erlangga. Lehninger, Albert L. 1992. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga. Tim. 2013. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya : Universitas Negeri Surabaya.

M.

Jawaban Pertanyaan

1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standar tersebut tentukan kadar protein sampel! Tabel konsentrasi (mg/ml) 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 absorbansi 0,000 0,009 0,034 0,124 0,197 0,221

Kurva standar

KURVA STANDART BIURET

0.250 0.200 konsentrasi (mg/ml) 0.150 0.100 0.050 0.000 0.000 -0.050 y = 0.0503x - 0.0281 R = 0.936

1.000

2.000

3.000 absorbansi

4.000

5.000

6.000

2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi Biuret? Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang tercampur dengan peptida? Peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret, hal ini dibuktikan dengan terbentuknya larutan berwarna ungu jika peptida direaksikan dengan reagen biuret. Cara penentuan kadarnya juga seperti cara penentuan kadar protein seperti yang dilakukan pada analisis diatas yaitu dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-VIS. Karena ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu yang dapat dibaca oleh alat tersebut.

LAMPIRAN PERHITUNGAN

Untuk 5 mg/ml

Untuk 4 mg/ml

Untuk 3 mg/ml

Untuk 2 mg/ml

 Untuk 1 mg/ml

Lampiran tabel konsentrasi terhadap absorbansi

konsentrasi (mg/ml) 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000

absorbansi 0,000 0,009 0,034 0,124 0,197 0,221

KURVA STANDART BIURET

0.250 0.200 konsentrasi (mg/ml) 0.150 0.100 0.050 0.000 0.000 -0.050 y = 0.0503x - 0.0281 R = 0.936

1.000

2.000

3.000 absorbansi

4.000

5.000

6.000

Konsentrasi pada sampel: Sampel 1 y = 0,0503x 0,0281 0,024 = 0,0503x 0,0281 0,0521 = 0,0503x X = 1,0358 Sampel 2 y = 0,0503x 0,0281 0,009 = 0,0503x 0,0281 0,0371 = 0,0503x X = 0,7376 Sampel 3 y = 0,0503x 0,0281 0,006 = 0,0503x 0,0281 0,0341 = 0,0503x X = 0,6779 Jadi konsentrasi sampel rata-rata,

LAMPIRAN FOTO

Alat yang digunakan

Proses pengenceran 1 5 ppm

Larutan yang digunakan

Penambahan Biuret

Proses Inkubasi