NUKLEASE

Dalam melakukan purifikasi protein dan asam nukleat spesifik terkadang membutuhkan digesti dari DNA, RNA atau keduanya. Masalah viskositas yang dihasilkan karena tingginya konsentrasi DNA dan metoda disosiasi enzimatik sel terkadang menunjukkan adanya peranan DNase. Adapun beberapa DNase yang sering digunakan, di antaranya: 1. Benzonase Merupakan endonuklease, rekombinan dari Serratia marcescens yang diekspresikan oleh E.coli. Enzim ini menghidrolisa untai ganda maupun tunggal DNA dan RNA yang menghasilkan produk ujung 5-fosfomononukleotida dan 5-fosfooligonukleotida. Temperatur optimum dari enzim ini adalah 37C dengan kisaran operasi 0-40C. Enzim ini aktif bersamaan dengan adanya deterjen ionik dan non-ionik, agen reduksi dan urea. Enzim ini digunakan untuk menghilangkan asam nukleat dari sampel protein dan untuk menurunkan viskositas karena asam nukleat.

Gambar 1. Mode of Action dari Benzonase

2. Deoxyribonuclease I atau Dnase I Deoksiribonuklease I atau DNase I berasal dari pankreas Bovine. Enzim ini mengkatalis endonukleolitik untai ganda maupun tunggal DNA dengan produk ujung 5-fosfonukleotida dan 5-fosfooligonukleotida dalam bentuk campuran yang komplekx. Adanya ion magnesium (mg), DNase I bereaksi dengan masing-masing untai DNA secara terpisah pada lokasi yang acak. Selain itu, keberadaan manganese(II) menyebabkan DNase I bereaksi pada kedua untai hampir pada tempat yang sama. Kebanyakan protokol menggunakan ion magnesium dengan DNase I, namun untuk tujuan tertentu, kebanyakan menggunakan manganese. Enzim ini memiliki berat molekul 30,072 yang dihitung dari sekuennya. Secara struktural, enzim ini berbentuk polipeptida tunggal yang tersusun atas dua jembatan disulfida dan satu karbohidrat dari monosakarida. pH optimum bagi aktivitas enzimatiknya berkisar 7-8, namun DNase yang bebas protease ini stabil pada kisaran pH 5-7 pada suhu 60 C hingga 5 jam, lebih spesifik lagi pada suhu C, 1 mg/mL larutan akan kehilangan aktivitasnya sebanyak 6%perjam baik pada buffer asetat (pH5) atau pada buffer Tris pH 7.2. Aktivitas enzim akan rusak pada suhu 68 C.

Gambar 2. Mode of Action DNase I

3. Deoxyribonuclease II (DNase II) Deoksiribosanuklease II atau DNase II merupakan enzim yang mengkatalis reaksi endonukleolitik untai ganda maupun untai tunggal DNA menjadi nukleotida unjung 3-fosfat dan 3-fosfatoligonukleotida. Enzim ini memiliki berat molekul sekitar 38,000 Dalton dengan aktivitas pada kisaran pH antara 4.0 sampai 6.5, namun pada pH 6.5, hanya sekitar 15% enzim yang bereaksi. Namun secara keseluruhan, aktivitas enzim ini sangat baik (optimum) pada pH 5.0. Stabilitas aktivitas enzim secara optimum dapat terjadi pada kondisi pH antara 5 5.5, dan dapat diinaktifkan dengan cepat pada pH 8.5 dan suhu 30 C.

Gambar 3. Mode of Action DNase II

4. Eksonuklease III
Enzim ini mengkatalis reaksi eksonukleolitik pada ujung 3- ke arah ujung 5- menjadi nukleotida 5fosfat. Enzim ini sangat efektif pada untai ganda DNA dan kemungkinan bersar dapat menghambat aktivitas endonukleolitik DNA pada lokasi APURINIK (apurinic = lokasi dimana tidak terdapat basa purin (Adenin dan Guanin).

Gambar 4. Mode of Action Eksonuklease II

5. Nuklease S1 Enzim nuklease S1 berasal dari Aspergillus oryzae merupakan enzim yang mengkatalis reaksi Catalyzes the nonspecific endo- and exonucleolytic cleavage of single stranded DNA and RNA to yield nucleoside 5-phosphates and 5-phosphooligonucleotides. It is used to digest nonannealed polynucleotide tails and hairpin loops in RNA and DNA duplexes and can be used to convert super-helical DNA to the linear form. Molecular weight: approximately 34 kDa and exists as a monomer.

The optimal pH range is 4.0 to 4.6 and it is activated by Zn2+ and/or Ca2+ ions. It is inhibited by chelators, such as EDTA and citrate, and by high concentrations of SDS. Nuclease S1 may exhibit some nickase activity at high concentrations. This nickase activity can be inhibited by including a high concentration of NaCl (approximately 200 mM) in the reaction buffer. Sumber:
Lee et al, 1995. Cloning, characterization and overproduction of nuclease S1 gene (nucS ) from Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol 44:425-431.

Warner et al., 2005. Exonuclease I Hydrolyzes DNA with a Distribution of Rates. Biophysical Journal 88 (2)1403-1412.

http://tophotnews.wordpress.com/2009/12/25/nuklease/