LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA

PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA BIURET

Oleh:

INDAYANA RATNA SARI

NIM: 19728251019

Pendidikan Kimia C

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

2019
 PERCOBAAN VIII

PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA BIURET

I. Tujuan

Menentukan kadar protein dalam larutan sampel dengan metode Biuret

II. Dasar Teori

a. Protein
Protein berasal dari kata protos atau proteos yang berarti pertama atau
utama. Protein merupakan komponen utama penyusun sel hewan atau manusia. Sel
merupakan pembentuk tubuh, maka protein yang terdapat dalam makanan
berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh (Poedjiadi
dan Supriyanti, 2006).
Protein merupakan molekul besar dengan berat molekul bervariasi antara
5000 sampai jutaan. Protein akan menghasilkan asam-asam amino jika terhidrolisis
oleh asam atau enzim. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul
protein. Asam-asam amino ini terikat satu sama lain dengan ikatan peptida.
Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat dalam molekul protein yaitu sebagai
berikut : karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0-3%,
dan fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat
dilakukan penentuan kandungan protein dalam suatu bahan makanan (Poedjiadi dan
Supriyanti, 2006).
Penentuan kadar protein dalam suatu bahan makanan ataupun minuman
dapat diukur dengan beberapa metode yaitu metode biuret, metode lowry, metode
bradford, dan metode BCA (Purwanto, 2014).
Protein secra umum mempunyai serapan maksimal pada 214 nm karena
adanya ikatan peptida. Namun daerah ini banyak terganggu karena adanya uap air
dari udara sehingga pada praktiknya sulit dilakukan. Asam amino tyrosin,
tryptophan, dan phenylalanin memiliki absorbansi pada serapan maksimum sekitar
280 nm karena adanya cincin aromatik dalam strukturnya. Warburg Chistian
Method mengusulkan persamaan berikut untuk menghitung kadar protein,
khususnya dengan memperimbangkan kesalahan yang mungkin timbul karena
serapan asam nukleat yang secara maksimal terjadi pada 260 nm.
Persamaan Groves: (Protein) (mg/L) = 1,55 A280 – 0,76 A260.
Secara kolorimetri, protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret.
Prinsipnya adalah bahwa ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa (Carprette,
2005). Pereaksi biuret terdiri dari campuran protein dengan sodium hidroksida
(berupa larutan) dan tembaga sulfat. Hasil dari reaksi ini adalah berwarna violet.
Reaksi ini positif untuk 2 atau lebih ikatan peptida (Harrow, 1954). Spektrum
absorbansi suatu larutan protein bervariasi tergantung pH dan sesuai dengan susun
residu asam amino (Montgomery, 1993). Kekurangan dari metode ini adalah hasil
pembacaan tidak murni menunjukkan kadar protein saja, melainkan bisa saja kadar
senyawa lain seperti benzena, gugus fenol, dan gugus sulfhidrin juga terbaca
kadarnya. Selain itu, waktu pelaksanaannya metode ini kurang efisien ( Lehninger,
1982). ,
b. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrum Uv-Vis merupakan hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik
dengan molekul. Bentuk energi radiasi elektromagnetik mempunyai sifat
gelombang dan partikel (foton). (Harmita, 2006). Besarnya tenaga foton berbanding
lurus dengan frekuensi dari radiasi elektromagnetik dinyatakan dengan rumus:
E = hv
Dimana: E = Energi ( Joule.molekul-1)
h = Tetapan Planck = 6,63.10-34 Joule.S.molekul-1
v = Frekuensi (S-1)

Pengukuran serapan dapat dilakukan pada panjang gelombang daerah

ultraviolet ( panjang gelombang 190 nm – 380 nm) atau pada daerah cahaya tampak
(panjang gelombang 380 nm – 780 nm).

Pengukuran serapan dari suatu sampel dapat dilakukan dengan perhitungan

Lambert-Beer sebagai berikut :
 𝐿𝑜𝑔 𝐼𝑜
A= = ɛ. b.c = a. b. c
𝐿𝑜𝑔 𝐼𝑡

Dimana : A= serapan; a = daya serap; b = tebal lapisan zat yang menyerap sinar
(kuvet) (cm); c = kadar (g/L); ɛ = absorbsivitas molekuler (mol.cm.L-1); Io =
intensitas sinar datang; It = intensitas sinar yang diteruskan.

Senyawa atau zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometer Uv-

Vis adalah senyawa yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang lebih dikenal
dengan istilah kromofor. Senyawa yang mengandung gugus kromofor akan
mengabsorbsi radiasi sinar ultraviolet dan cahaya tampak jika diikat oleh senyawa
–senyawa bukan pengabsorbsi (auksokrom). Gugus auksokrom yaitu gugus yang
mempunyai elektron tidak berikatan dan tidak menyerap radiasi UV jauh.
Contohnya –OH, -NH2, - NO2, -X, (Harmita, 2006).

Spektrum serapan adalah hubungan antara serapan dengan panjang

gelombang dan digambarkan dalam bentuk grafik. Identifikasi suatu zat pada
daerah ultraviolet pada umumnya dilakukan dengan menggambarkan spektrum
serapan larutan zat dalam pelarut dan dengan kadar yang tertera seperti pada
monografi, untuk menetapkan serapan maksimum atau minimum. Spektrum
serapan dari zat yang diperiksa kadang-kadang perlu dibandingkan dengan
pembanding kimia yang sesuai. Pembanding kimia tersebut dikerjakan dengan cara
yang sama dan kondisi yang sama dengan zat yag diperiksa. Blanko digunakan
untuk koreksi serapan yang disebabkan pelarut, pereaksi, sel ataupun pengaturan
alat. Pengukuran serapan biasanya dilakukan pada panjang gelombang serapan
maksimum atau yang tercantum dalam monografi (Departemen Kesehatan, 2000
dalam Mely Mailandari, 2012)

Jenis spektrofotometer UV-Vis ada dua yaitu single beam dan double beam.
Pada single beam celah keluar sinar monokromatis hanya satu, wadah kuvet yang
dapat dilalui sinar hanya satu dan setiap perubahan panjang gelombang alat harus
dinolkan. Pada double beam celah keluar sinar monokromais ada dua, wadah
melalui dua kuvet sekaligus dan cukup satu kali dinolkan dengan cara mengisi
kedua kuvet dengan larutan blanko dan sampel (Harmita, 2006 dalam Mely
Mailandari, 2012).

III. Metode Penelitian

3.1 Alat dan Bahan
Adapun alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah gelas beker,
pipet ukur 1 mL dan 2 mL, tabung reaksi, labu takar 10 mL, pipet tetes, pro
pipet, stopwatch, vortex mixer dan spektrofotometer UV VIS Single beam.
Sedangkan bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah reagen
Biuret, larutan standar protein 10 mg/mL, NaOH 3%, sampel minuman susu
merk ultramilk, dan akuades.
3.2 Cara Kerja
a. Pembuatan larutan standar protein untuk kurva standar
Pembuatan larutan standar konsentrasi 0,2 mg/mL; 0,4 mg/mL; 0,6
mg/mL; 0,8 mg/mL dan 1 mg/mL dibuat secara berturut-berturut dengan
memipet sebanyak 0,2 mL; 0,4 mL; 0,6 mL; 0,8 mL dan 1 mL larutan standar
protein 10 mg/mL. Kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan
diencerkan dengan akuades hingga tanda batas. Lalu dihomogenkan.
b. Persiapan sampel
Sebanyak 1 mL sampel minuman susu merk ultramilk diencerkan ke
dalam labu ukur 10 mL, ditera hingga tanda batas dan dihomogenkan.
Kemudian untuk membuat sampel 50x pengenceran diambil sebanyak 2 mL
larutan hasil pengenceran pertama, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL,
ditera hingga tanda batas dan dihomogenkan.
c. Pengukuran Sampel dan Larutan Standar
Larutan standar yang telah dibuat, sampel yang telah dipreparasi dan
blanko yang berisi akuades diambil masing-masingnya sebanyak 1 mL,
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 4 mL reagen Biuret,
dihomogenkan dengan vortex, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar,
Setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum.
IV. Data Pengamatan
a. Waktu Kestabilan
Tabel 1. Waktu Kestabilan
No Waktu (menit) Absorbansi
1 0 0,340
2 5 0,338
3 10 0,349
4 15 0,324
5 20 0,313
6 25 0,332
7 30 0,349
8 35 0,373
Rata-rata Absorbansi 0,339

b. Hasil Pengamatan Kualitatif

Tabel 2. Pengamatan perlakuan
No Perlakuan Hasil Pengamatan
1 Larutan blanko ditambah dengan Larutan blanko berubah warna dari
4 mL reagen Biuret bening menjadi biru muda

2 Larutan standar protein ditambah Larutan standar protein berubah

dengan 4 mL reagen Biuret warna dari bening menjadi biru muda
(untuk semua larutan standar)

3 Larutan sampel susu ditambahkan Larutan sampel susu berubah warna

4 mL reagen biuret dari putih keruh menjadi biru muda.
c. Penentuan panjang gelombang maksimum
Tabel 3. Panjang gelombang maksimum
No Panjang gelombang (nm) Absorbansi
1 430 0,233
2 435 0,278
3 440 0,325
4 445 0,371
5 450 0,359
6 455 0,355
7 460 0,326
8 465 0,316

d. Konsentrasi larutan blanko, standar dan sampel

Tabel 4. Absorbansi larutan standar protein

Larutan Konsentrasi (mg/mL) Absorbansi

Blanko 0 0
Standar 0,2 0,002
0,4 0,012
0,6 0,023
0.8 0,043
1 0,067
Sampel 1 0,094
Sampel 2 0,124
Sampel 3 0,166
Rata-rata sampel 0,128
V. Analisa Data atau perhitungan
a. Waktu kestabilan larutan sampel

Uji Kestabilan Larutan Sampel

0,38

0,37

0,36
Absorbansi

0,35

0,34

0,33

0,32

0,31
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Waktu kestabilan (menit)

Gambar 1. Kurva Uji Kestabilan Larutan

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Panjang Gelombang Maksimum

0,08
0,07
0,06
Absorbansi

0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0 1 2 3 4 5 6

Panjang Gelombang (nm)

Gambar 2. Kurva panjang gelombang maksimum

c. Pembuatan larutan standar dari larutan standar protein 1 mg/mL
1. 0,2 mg/mL
M1 x V1 = M2 x V2
10 mg/mL x V1 = 0,2 mg/mL x 10 mL
V1 = 0,2 mL
Dipipet sebanyak 0,2 mL larutan standar protein 10 mg/mL dan diencerkan
menggunakan aquades dalam labu ukur 10 mL.
2. 0,4 mg /mL
M1 x V1 = M2 x V2
10 mg/mL x V1 = 0,4 mg/mL x 10 mL
V1 = 0,4 mL
Dipipet sebanyak 0,4 mL larutan standar protein 10 mg/mL dan diencerkan
menggunakan aquades dalam labu ukur 10 mL.
3. 0,6 mg /mL
M1 x V1 = M2 x V2
10 mg/mL x V1 = 0,6 mg/mL x 10 mL
V1 = 0,6 mL
Dipipet sebanyak 0,6 mL larutan standar protein 10 mg/mL dan diencerkan
menggunakan aquades dalam labu ukur 10 mL.
4. 0,8 mg /mL
M1 x V1 = M2 x V2
10 mg/mL x V1 = 0, 8 mg/mL x 10 mL
V1 = 0,8 mL
Dipipet sebanyak 0,8 mL larutan standar protein 10 mg/mL dan diencerkan
menggunakan aquades dalam labu ukur 10 mL.
5. 1 mg /mL
M1 x V1 = M2 x V2
10 mg/mL x V1 = 1 mg/mL x 10 mL
V1 = 1 mL
Dipipet sebanyak 1 mL larutan standar protein 10 mg/mL dan diencerkan
menggunakan aquades dalam labu ukur 10 mL.
 Kurva Standar
0,08
0,07
0,06 y = 0,0805x - 0,0189
0,05
Absorbansi
R² = 0,9625
0,04
0,03
0,02
0,01
0
-0,01 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Konsentrasi

Gambar 3. Kurva standar

d. Penentuan kadar protein dalam sampel minuman
1. Penentuan kadar protein dalam sampel minuman merk ultramilk
y = ax + b
= 0,0805x – 0,0189
0,128 = 0,0805x – 0,0189
0,128+0,0189
x=
0,0805
= 1,825 mg/mL
= 1,825 mg/mL x 50 mL
= 91,25 mg = 0,09125 gram dalam pengenceran (50 mL)
Jadi, kadar protein dalam minuman merk ultramilk adalah 0,09125 gram
dalam 50 mL pengenceran.
V. Pembahasan
Praktikum ini dilakukan pada hari Jum’at, 4 Oktober 2019 tentang penentuan
kadar protein dalam larutan sampel dengan metode biuret. Sampel yang digunakan
pada praktikum ini adalah sampel minuman susu merk ultramilk. Adapun alat yang
digunakan untuk menentukan kadar protein pada minuman adalah spektrofometer
UV-Vis. Prinsip pengukuran dengan spektrofotometer adalah interaksi antara
molekul dengan cahaya elektromagnetik berupa serapan sinar monokromatis oleh
suatu larutan berwarna pada panjang gelombang tertentu.
Sebelum menentukan kadar protein dalam sampel minuman, dilakukan
proses pembuatan larutan standar, preparasi sampel, penentuan panjang gelombang
maksimum kemudian pengukuran absorbansi larutan standar dan sampel,
pembuatan kurva standar kemudian menentukan kadar protein dalam sampel
minuman. Larutan standar yang dibuat sebanyak 5 konsentrasi yaitu 0,2 mg/mL;
0,4 mg/mL; 0,6 mg/mL; 0,8 mg/mL dan 1 mg/mL yang dibuat dari hasil
pengenceran larutan standar protein 10 mg/mL yang dilarutkan dalam 10 mL labu
ukur. Sedangkan preparasi sampel dilakukan dengan 50 kali pengenceran dalam
labu ukur 10 mL dari 1 mL sampel minuman susu merk ultramilk. Pengenceran ini
dilakukan supaya sampel dapat dengan mudah dianalisis dan mudah terbaca oleh
spektrofotometer UV-Vis.
Larutan standar dan sampel yang telah dibuat serta blanko yang berisi
akuades saja, masing- masingnya ditambahkan dengan 4 mL reagen Biuret.
Penambahan reagen biuret bertujuan untuk membuat larutan menjadi berwarna,
mengingat syarat sampel yang dapat diukur dengan biuret adalah berwarna. Adanya
warna pada larutan setelah penambahan reagen biuret terjadi karena adanya reaksi
reduksi antara ion kupri Cu2+ menjadi ion kupro Cu+. Setelah penambahan reagen
biuret, warna larutan akan menjadi biru. Reagen biuret terdiri dari campuran protein
dengan sodium hidroksida (berupa larutan) dan tembaga sulfat. Secara teori, larutan
akan berubah menjadi warna ungu karena terbentuknya senyawa kompleks setelah
penambahan reagen biuret dalam suasana basa dengan penambahan NaOH. Namun
pada praktikum ini tidak dilakukan penambahan larutan NaOH dikarenakan
praktikan lupa (human error). Sehingga larutan tetap berwarna biru, tidak berubah
menjadi warna ungu. Adapun reaksi yang terjadi antara protein dengan reagen
biuret dalam suasana basa adalah sebagai berikut:

Gambar 4. Reaksi pada metode biuret

Sebelum dilakukan pengukuran, semua sampel dihomogenkan dengan mixer
vortex supaya stabil. Setelah itu dilakukan uji kestabilan terhadap larutan sampel
dari 0-35 menit. Dari uji kestabilan diperoleh hasil bahwa larutan stabil pada waktu
30 menit dengan rata-rata absorbansi 0,339. Setelah uji kestabilan, ditentukan
panjang gelombang maksimum dengan mengukur salah satu larutan standar
kemudian digunakan untuk mengukur absorbansi semua larutan. Penentuan
panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang 430-465 nm dan diperoleh
panjang gelombang maksimumnya yaitu 445 nm. Setelah panjang gelombang
maksimum diperoleh, kemudian dilakukan pengukuran absorbansi larutan standar
dan sampel pada panjang gelombang maksimum tersebut.
Hasil pengukuran absorbansi larutan standar kemudian digunakan untuk
membuat kurva standar. Kurva standar perlu dibuat untuk menentukan persamaan
regresi. Sehingga dari persamaan regresi tersebut dapat ditentukan konsentrasi
sampel. Persamaan regresi yang didapat yaitu y= 0,0805x – 0,0189 dengan
R2 0,9625.

Berdasarkan persamaan regresi yang telah dibuat, dapat ditentukan kadar

protein dalam sampel minuman susu merk ultramilk. Kadar protein dalam sampel
diperoleh sebesar 0,09125 gram dalam 50 mL (pengenceran).
VI. Kesimpulan
Kadar protein dalam minuman merk ultramilk adalah 0,09125 gram dalam 50
mL (Pengenceran).

Pertanyaan dan Tugas

Pertanyaan:
1. Bolehkah kita mengukur larutan berwarna dengan perolehan absorbansi
sebesar 1,5? Apa yang harus kita lakukan jika memperoleh data yang demikian
itu?
2. Jelaskan mengapa larutan dalam percobaan ini berwarna!
Jawab:
1. Tidak boleh dalam mengukur suatu larutan berwarna menggunakan
spektrofotometer UV-Vis dengan perolehan absorbansi lebih dari 1. Absorbansi
yang diterima dan baik adalah rentang 0,2 - 0,8. Jika absorbansi yang diperoleh
lebih dari 1, maka akan diperoleh nilai linearitas yang tidak baik. Sebab nilai
linearitas yang baik adalah yang mendekati 1.
2. Larutan dalam percobaan ini menjadi berwarna karena akibat dari penambahan
reagen biuret. Interaksi yang terjadi antara regen biuret dengan sampel susu
menghasilkan warna ungu karena terjadinya reaksi antara ikatan peptida pada
protein dalam susu yaitu gugus NH2 dan gugus OH dengan ion Cu+2 pada reagen
biuret. Pada reaksi ini ion Cu2+ (kupri) berubah menjadi ion kupro Cu+.
 Daftar Pustaka

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2002. Parameter Standar Umum

Ekstrak Tumbuhan Obat. Departemen Kesehatan republik Indonesia.
Jakarta: 9-12.
Harmita, Hayun, Hariyant,, Herman S., Nelly D.L., Sabarijah W., Umar M., 2006.
Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi. Departemen
Farmasi FMIPA UI, Depok: 134-153.
Meilandari, Mely, 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Garcinia kydia
Roxb. Dengan Metode DPPH dan Identifikasi Senyawa Kimia Fraksi yang
Aktif, Skripsi, Program Studi Ekstensi Farmasi, Fakultas MIPA,
Universitas, Depok.
Poedjiadi, Anna dan F.M. Titin Supriyanti, 2006, Dasar-Dasar Biokimia, Edisi
Kedua, Jakarta: UI Press, Hal. 81-82, 91-92.
Purwanto, Maria Goretti M., 2014, Perbandingan Analisa Kadar Protein Terlarut
dengan Berbagai Metode Spektroskopi UV-Visible. Jurnal Sains dan
Teknologi, 7(2):64-71, ISSN: 0216-1540.
 Lampiran –Lampiran
Lampiran 1. Pembuatan Larutan Standar

Lampiran 2. Sampel minuman susu 50x pengenceran

Lampiran 3. Larutan standar dan sampel setelah penambahan reagen biuret
Lampiran 4. Reagen Biuret
Lapiran 5. Sampel minuman susu merk Ultramilk
Lampiran 6. Laporan sementara