A. JUDUL PERCOBAAN Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret B. TANGGAL PERCOBAAN 22 Oktober 2013 C.

TUJUAN PERCOBAAN Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret D. DASAR TEORI Protein dan Metode Biuret Protein adalah salah satu biomolekul raksasa yang berperan sebagai komponen utama penyusun makhluk hidup. Protein memba a kode!kode geneti" berupa #$% dan &$%. Beberapa makanan yang dapat men'adi sumber protein adalah( daging) telur) ikan) susu) bi'i!bi'ian) kentang) ka"ang) dan polong! polongan. Protein merupakan polimer alam yang tersusun dari asam!asam amino melalui ikatan peptide) sehingga protein 'uga disebut sebagai polipeptida. #i dalam tubuh kita protein ber*ungsi sebagai +at pembangun) pengatur pertahanan) dan sebagai sumber energy setelah karbohidrat dan lemak. Protein dapat digolongkan berdasarkan struktur) bentuk) dan *ungsinya. Protein menun'ukkan berbagai *ungsi biologi. #eret asam amino dari ber'enis!'enis protein memungkinkan molekul ini men'alankan berbagai *ungsi) antara lain ( ! ! ! ! ! ,n+im Protein transport Protein nutrient dan penyimpanan Protein kontraktil atau motil Protein stru"tural

! ! !

Protein pertahanan Protein pengatur Protein lain Metode Biuret merupakan salah satu "ara yang terbaik untuk menentukan

kadar protein suatu larutan. #alam larutan basa) -u2. akan membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein) sehingga menghasilkan arna ungu yang dapat diidenti*ikasi dengan spektro*otometer pada pan'ang gelombang /20nm. %bsorbansi ini berbanding langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung 'enis protein karena seluruh protein pada dasrnya mempunyai 'umlah ikatan peptida yang sama persatuan berat. 0al!hal yang mengganggu per"obaan ini adalahadanya urea 1mengandung gugus !-O!$0!2 dan gula preduksi yang bereaksi dengan -32.. 4ntensitas arna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera.

Penentuan protein "ara biuret adalah dengan mengukur opti"al density 1O#2 pada pan'ang gelombang /50 6 /70 nm. %gar dapat menghitung banyaknya protein maka perlu lebih dahulu dibuat kur8a baku9standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi protein dengan O# pada pan'ang gelombang terpilih. #ibandingkan dengan "ara K'eldahl maka biuret lebih baik karena hanya protein atau senya a peptida yang bereaksi dengan biuret) ke"uali urea. :arutan protein dibuat alkalis dengan $aO0 kemudian ditambahkan larutan -u;O< en"er. 3'i ini untuk menun'ukkan adanya senya asenya a yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. 3'i ini memberikan reaksi positi* yaitu ditandai dengan timbulnya atau biru 8iolet. Prinsip metode biuret ikatan peptide dapat membentuk senya a kompleks ber arna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa. &eaksi biuret terdiri dari "ampuran protein dengan natrium hidroksida berupa larutan dan tembaga sul*at. =arna 8iolet adalah hasil dari reaksi ini. &eaksi ini positi* untuk 2 atau lebih ikatan peptida. Kerugian dari metode ini adalah hasil penetapannya arna merah 8iolet

tidak murni menun'ukkan kadar protein ) melainkan bisa sa'a kadar senya a) yang mengandung ben+ene)gugus *enol) gugus sulhidrin ikut terba"a kadarnya. ;elain itu aktu penetapan yang dipergunakan 'uga lama) sehingga dinilai kurang e*ekti*. Spektrofoto etri U!"!IS ;pektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan si*at!si*at yang berbeda. Ka asan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra lembayung 13>) 170!3/0 nm2 dan tampak 1>4;) 3/0!700 nm2. -ahaya di dalam ka asan ini mempunyai energi yang "ukup untuk mengeluarkan elektron 8alensi di dalam molekul tersebut 1Keenan 1??22. Penyerapan sinar 3>!>is dibatasi pada se'umlah gugus *ungsional atau gugus kromo*or yang mengandung elektron 8alensi dengan tingkat eksutasi rendah. @iga 'enis elektron yang terlibat adalah sigma) phi) dan elektron bebas. Kromo*or!kromo*or organik seperto karbonil) alkena) a+o) nitrat) dan karboksil mampu menyerap sinar ultra8iolet dan sinar tampak. Pan'ang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. %uksokrom adalah gugus *ungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil) metoksi) dan amina. @erkaitnya gugus kromo*or akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menu'u ke pan'ang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas 10art 20032. Ketika "ahaya mele ati suatu larutan biomolekul) ter'adi dua

kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah "ahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah "ahaya dis"attering. Bila energi dari "ahaya 1*oton2 harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang men'adi dasar pengukuran absorbansi dalam spektro*otometer 1%isyah 200?2. -ara ker'a spektro*otometer dimulai dengan dihasilkannya "ahaya monokromatik dari sumber sinar. -ahaya tersebut kemudian menu'u ke ku8et 1tempat sampel9sel2. Banyaknya "ahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan diba"a oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar

pemba"a

10adi

200?2

0asil pengukuran yang baik dari suatu parameter kuantitas kimia) dapat dilihat berdasarkan tingkat presisi dan akurasi yang dihasilkan.%kurasi menun'ukkan kedekatan nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. 3ntuk menentukan tingkat akurasi perlu diketahui nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan kemudian dapat diketahui seberapa besar tingkat akurasinya. Presisi menun'ukkan tingkat reliabilitas dari data yang diperoleh. 0al ini dapat dilihat dari standar de8iasi yang diperoleh dari pengukuran) presisi yang baik akan memberikan standar de8iasi yang ke"il dan bias yang rendah. Aika diinginkan hasil pengukuran yang 8alid) maka perlu dilakukan pengulangan) misalnya dalam penentuan nilai konsentrasi suatu +at dalam larutan larutan dilakukan pengulangan sebanyak n kali. #ari data tersebut dapat diperoleh ukuran harga nilai terukur adalah rata!rata dari hasil yang diperoleh dan standar de8iasi. @ipe kesalahan dalam pengukuran analitik dapat dibagi men'adi tiga) yaitu( 1. Kesalahan serius 1Bross error2 2. Kesalahan a"ak 1&andom error2 3. Kesalahan sistematik 1;ystemati" error2 0al ini dapat diatasi dengan( ! ! ! ;tandarisasi prosedur ;tandarisasi bahan Kalibrasi instrument

E. ALAT DAN BA#AN ! ! ! ! @abung reaksi :arutan standar protein :arutan sampel protein ;pektro*otometer 3>!>4;

&eagen biuret

$. ALUR %ERJA 1. Pembuatan :arutan ;tandar

1 m: lar. Protein kadar 1 mg9m: 1 m: lar. Protein kadar 2 mg9m: 1 m: lar. Protein kadar < mg9m: 1 m: lar. Protein kadar / mg9m:

1 m: lar. Protein kadar 3 mg9m:

Pada masing2 tabung ( . < m: reagen biuret #iko"ok #i inkubasi pd suhu 3C0- D 10 menit sampai arna ungu stabil #iukur absorbansinya pada pan'ang gelombang /20 nm dgn 3>!>4; %bsorbansi larutan standar

2. Penetapan %bsorbansi :arutan Blanko

1 m: aEuades . 1 m: reagen biuret #iko"ok #i inkubasi pd suhu 3C0- D 10 menit sampai arna ungu stabil #iukur absorbansinya pada pan'ang gelombang /20 nm dgn 3>!>4; %bsorbansi blanko

3. Penetapan %bsorbansi :arutan ;ampel

1 m: sampel . 1 m: reagen biuret #iko"ok #i inkubasi pd suhu 3C0- D 10 menit sampai arna ungu stabil #iukur absorbansinya pada pan'ang gelombang /20 nm dgn 3>!>4; %bsorbansi sampel #i ulang 3G

G. #ASIL PENGAMATAN No Per&o'aan #a(i) pen*a atan Du*aan Reak(i 1. Pembuatan :arutan ;tandar ;ebelum larutan protein tidak ber arna ;esudah ! :ar. Protein 1 &eagen biuret Baris membentuk kompleks suatu 0)0<0<0G 0)0<0/3. y F . Maka + Si pu)an

mg9m: dengan ikatan konsentrasi ;ampel 1 F !0)0525 ;ampel 2 F 0)0115 ;ampel 3 F !0)0131 protein mg9m: sehingga kompleks ungu mg9m: dengan

ber arna ungu 1.2) dan peptida absorbansi F 0)0/7 ! :ar. Protein 2

ber arna ungu 1..2) dan menghasilkan absorbansi F 0)107 ! :ar. Protein 3

ber arna ungu 1...2) dan absorbansi dari

absorbansi F 0)21? ! :ar. Protein <

pan'ang mg9m: gelombang nm. mg9m:

ber arna ungu 1....2) dan maksimal /<0 absorbansi F 0)221 ! :ar. Protein / ber arna ungu 1.....2) 2. Penetapan %bsorbansi :arutan Blanko dan absorbansi F 0)20< ;ebelum ! ! ! 3. Penetapan %bsorbansi :arutan ;ampel ! %Euades tidak ber arna Biuret ber arna biru %Euades . biuret ber arna

;esudah biru 1.2 ;ebelum ! :arutan ber arna Biuret ber arna biru ;esudah ;ampel . biuret ber arna biru 1..2 ;ampel 0)037 ;ampel ;ampel 2 ( konsentrasi 0)01<dan absorbansi ( 0)0<1 3 ( konsentrasi 1 ( konsentrasi sampel tidak

!0)05< dan absorbansi (

!0)00< dan absorbansi ( 0)0< #. ANALISIS DAN PEMBA#ASAN Pada per"obaan ini dilakukan analisis kuantitati* protein dengan tu'uan menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret. @erdapat tiga prosedur ker'a dalam per"obaa ini) dimana prosedur pertama

dengan tu'uan Pembuatan :arutan ;tandar) dan selan'utnya prosedur kedua dengan tu'uan Penetapan %bsorbansi :arutan Blanko dan prosedur ketiga yaitu dengan Penetapan %bsorbansi :arutan ;ampel. Pro(edur perta a. :angkah!langkah yang dilakukan adalah dengan meyiapkan lima tabung reaksi kemudian memasukkan ke dalam masing!masing tabung reaksi. Pada tabung reaksi pertama) dimasukkan 10 m: larutan protein standar a al 10 ppm untuk membuat larutan protein / ppm) 15 m: dari larutan standar / ppm ke dalam tabung reaksi kedua untuk membuat larutan protein < ppm) 1/ m: dari larutan standar protein < ppm ke dalam tabung reaksi ketiga untuk membuat larutan protein 3 ppm) 13)33 m: dari larutan standar protein 3 ppm ke dalam tabung reaksi ke empat untuk membuat larutan standar 2 ppm dan pada tabung reaksi terakhir dimasukkan 10 m: dari larutan standar 2 ppm untuk membuat larutan standar 1 ppm. :arutan protein ber arna putih kekuningan. :angkah ker'a selan'utnya yaitu pada setiap tabung reaksi dilakukan penambahan < m: reagen biuret yang ber arna biru) dan dilakukan pengo"okan setelah penambahan reagen. #ari kelima tabung reaksi dihasilkan arna ungu 1.2 pada tabung pertama) ungu 1..2 pada tabung kedua) ungu 1...2 pada tabung ketiga) ungu 1....2 pada tabung keempat dan ungu 1.....2. =arna ungu ter'adi dikarenakan biuret bereaksi dengan ikatan peptida yang ada pada protein yaitu berikatan dengan gugus 6-FO dan $0) sehingga terbentuk kompleks koordinasi antara -u dengan al*a amino) dimana %l*a amino menggantikan posisi air. ;ehingga reagen biuret dapat digunakan sebagai indikator adanya ikatan peptida) dan akan memberikan hasil positi* dengan menun'ukkan arna ungu. ;edangkan arna ungu yang berbeda pada setiap perbedaan konsentrasi dikarenakan 'umlah molaritas 1konsentrasi2 me akili banyak protein yang ada. ;ehingga semakin tinggi konsentrasi larutan protein) pekat. &eaksi yang ter'adi adalah arna ungu yang dihasilkan akan semakin

O H N H C R C H N H C R

O C H N

-u2.

n
R N C H O C N R C H O C H N

R H N C H

O C

H N

H C R

C O

H C R

C O

H C R

C OH

H N

:angkah selan'utnya yaitu larutan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 3C0-. 4nkubasi dilakukan pada suhu 3C H- ini dikarenakan protein yang terdapat pada he an memiliki suhu optimum seperti di atas. Aika terlalu tinggi akan mengakibatkan ter'adinya denaturasi protein. 4katan inkubasi ini untuk menga"aukan ikatan hidrogen dan interaksi hidro*obik non polar pada protein sehingga protein albumin kemampuan mengikat airnya menurun. 0al ini karena dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergetar atau bergerak sangat "epat sehingga menga"aukan ikatan molekul dan mengakibatkan terputusnya interaksi nonko8alen yang ada pada struktur alami protein tetapi tidak memutus ikatan ko8alen yang berupa ikatan peptida. ;etelah inkubasi dilakukan selan'utnnya yaitu #iukur absorbansinya pada pan'ang gelombang /20 nm dgn 3>!>4;) absorbansi yang dihasilkan pada larutan standar protein 1 mg9m: absorbansi F 0)0/7) larutan standar protein 2 mg9m: absorbansi F 0)107) larutan standar protein 3 mg9m: absorbansi F 0)21?) larutan standar protein < mg9m: absorbansi F 0)221) larutan standar protein / mg9m: absorbansi F 0)20<. #engan hasil absorbansi ini maka dapat diketahui bah a konsentrasi sebanding dengan absorbansi) dimana semakin tinggi konsentrasi maka absorbansi 'uga akan semakin banyak. #iperoleh dari u'i 3>!>4; dengan persamaan garis y F 0)0<0<0G . 0)0<0/3 dengan regresinya yaitu &2 F 0)C3C33.

Pro(edur kedua. Pada tahap ini dilakukan Penetapan %bsorbansi :arutan Blanko) langkah ker'a yang dilakukan adalah menyiapkan tabung reaksi dan memasukkan ke dalamnya 1 m: aEuades) yaitu "airan yang tidak ber arna. :angkah selan'utnya yaitu menambahkan < m: reagen biuret yang ber arna biru sambil diko"ok. 0asil yang diperoleh adalah larutan ber arna biru. :angkah selan'utnya yaitu dilakukan inkubasi dan memperoleh larutan yang sesuai. 4nkubasi dilakukan pada suhu sama seperti prosedur pertama yaitu 3C 0-. ;etelah 10 menit diambil larutatan dari inkubator dan diu'i 3>!>4;. Pengukuran +at dengan spekto*otometri selalu melibatkan analat blanko dan standar. Blanko adalah larutan yang mempunyai perlakuan yang sama dengan analat tetapi tidak mengandung komponen analat. @u'uan pembuatan larutan blanko ini adalah untuk mengetahui besarnya serapan oleh +at yang bukan analat. :arutan analat adalah larutan yang dianalisis. :arutan standar adalah larutan yang mendapat perlakuan yang sama dengan analat dan mengandung kkomponen analat dengan konsentrasi yang sudah diketahui. Pro(edur ti*a. :angkah yang dilakukan adalah dengan menyiapkan tiga tabung reaksi kemudian dimasukkan kedalamnya masing!masing 1 m: larutan sampel yang ber arna putih kekuningan. ;etelah itu dilakukan penambahan reagen biuret yang ber arna biru) maka dari sampel akan ter'adi perubahan arna yaitu untuk semua larutan pada tabung reaksi ber arna biru. ;elan'unya larutan sampel tersebut di u'i spertro*otometri 3>!>4; dan menghasilkan serapan 0)037 pada sampel pertama) 0)0<1 pada sampel kedua dan 0)0< pada sampel ketiga. ;ehingga dengan menggunakan persamaan garis linear yang didapatkan dari kur8a larutan standar yang besarnya y F 0)0<0<0G . 0)0<0/3 maka didapatkan konsentrasi sampel 1 sebesar !0)0525) konsentrasi sampel 2 sebesar 0)0115) dan konsentrasi sampel 3 sebesar !0)0131. #ari perhitungan konsentrasi larutan sampel yang diperoleh) konsentrasi dari sample ternyata ada yang bernilai negati*) ini disebabkan karena nilai absorbansi sampel lebih ke"il dari nilai absorbansi larutan standar yang paling ke"il. Batas rentangan absorbansi larutan sampel seharusnya tidak kurang dari absorbansi minimum larutan standar yang besarnya 0)0/7 dan tidak lebih besar dari absorbansi maksimum larutan standar yang besarnya 0)221. Kesalahan yang ter'adi dapat disebabkan karena kesalahan dalam

proses penger'aan yakni pengen"eran larutan standar yang kurang sempurna) sensiti*itas alat) ku8et yang kurang bersih)adanya serapan oleh pelarut dimana hal ini sebenarnya dapat diatasi dengan penggunaan larutan blanko yakni larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk +at pembentuk arna) serapan oleh ku8et) adanya pengotor yang ikut terabsorbsi dan kesalahan pada saat pen"ampuran larutan) dan adanya gelembung udara atau gas dalam lintasan radiasi gelombang yang dihasilkan sudah tidak "o"ok dengan yang tertera pada instrumen. I. SIMPULAN #ari analisis kuantitati* yang telah dilakukan) maka didapatkan kadar protein pada masing!masing sampel yang diu'i dengan menggunakan spektro*otometri 3>!>4; yaitu sebesar( !0)0525 mg9m: untuk sampel 1 I 0)0115 mg9m: untuk sampel 2 I !0)0131 mg9m: untuk sampel 3 J. DA$TAR PUSTA%A %nonim. 2011. Penentuan Kadar Protein dengan Biuret. http(99 ikipedia.org. diakses pada 21 Oktober 2013. :ehninger) %l. 1?72. Dasar-Dasar Biokimia 1. Maggy @hena i'aya. Pener'emah). Aakarta( ,rlangga. @er'emahan dari( Principle of Biochemistry. Murray &obert K) et all. 200?. Biokimia Harper. Brahm 3. PenditI alih bahasa. Aakarta ( ,B-. @er'emahan dari( Harpers Ilustrated Biochemistry. @im #osen Biokimia 1. 2013. Petunjuk Praktikum Biokimia. ;urabaya( Aurusan Kimia JM4P% 3$,;%. =idya) ,ka. 2012. Spektrofotometri. Oktober 2013. . ikipedia.org. diakses pada 27

%. JA,ABAN PERTAN-AAN 1. Buatlah kur8a standar konsentrasi >s %bsorbansi. #engan bantuan kur8a tersebut tentukan kadar protein sampel

%on(entra(i Larutan Standar 1 2 3 < /

A'(or'an(i 0)0/7 0)107 0)21? 0)221 0)20<

Bra*ik konsentrasi >s absorbansi pada larutan standar

#engan Persamaan y F 0)0<0<G . 0)0<0/3) maka dapat dihitung kadar protein pada sampel yaitu ( ;ampel 1 #engan absorbansi 0)037 sehingga 0)037 F 0)0<0<G . 0)0<0/3 G F !0)0525 ;ampel 2

#engan absorbansi 0)0<1 sehingga 0)0<1 F 0)0<0<G . 0)0<0/3 G F 0)0115 ;ampel 3 #engan absorbansi 0)0<0 sehingga 0)0<0 F 0)0<0<G . 0)0<0/3 G F !0)0131 2. %pakah peptida akan memberikan reaksi positi* terhadap pereaksi biuretK Aika benar demikian) bagaimana menentukan kadar protein yang ter"ampur dengan peptidaK Aa ab ( La) karena Biuret merupakan salah satu "ara yang terbaik untuk menentukan kadar protein suatu larutan. biuret bereaksi dengan ikatan peptida yang ada pada protein yaitu berikatan dengan gugus 6-FO dan $0) sehingga terbentuk kompleks koordinasi antara -u dengan al*a amino) dimana %l*a amino menggantikan posisi air. ;ehingga reagen biuret dapat digunakan sebagai indikator adanya ikatan peptida) dan akan memberikan hasil positi* dengan menun'ukkan arna ungu yang dapat didenti*ikasi dengan spektro*otometer pada pan'ang gelombang /20nm. %bsorbansi ini berbanding langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung 'enis protein karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai 'umlah ikatan peptida yang sama persatuan berat. &eaksi yang ter'adi antara biuret dan protein adalah

O H N H C R C H N H C R

O C H N

-u2.

n
R N C H O C N R C H O C H N

R H N C H

O C

H N

H C R

C O

H C R

C O

H C R

C OH

H N

3ntuk menentukan kadar protein yang ter"ampur dalam peptide yaitu dengan malakukan perhitungan se"ara kuantitati* melalui persamaan garis linear yang didapat dari kur8a kalibrasi larutan standar.

L. LAMPIRAN PER#ITUNGAN a. Per.itun*an Pen*en&eran Konsentrasi / ppm dari 10 ppm M1 G >1 F M2 G >2 10 G >1 F / G 20 >1 F 10 Konsentrasi < ppm dari / ppm M1 G >1 F M2 G >2 / G >1 F < G 20 >1 F 15

Konsentrasi 3 ppm dari < ppm M1 G >1 F M2 G >2 < G >1 F 3 G 20

Konsentrasi 2 ppm dari 3 ppm M1 G >1 F M2 G >2 3 G >1 F 2 G 20

>1 F 1/

>1 F 13)333333

Konsentrasi 1 ppm dari 2 ppm M1 G >1 F M2 G >2 2 G >1 F 2 G 20 >1 F 10

'. Per.itun*an kadar (a pe) Persamaan y F 0)0<0<G . 0)0<0/3 ;ampel 1 #engan absorbansi 0)037 sehingga 0)037 F 0)0<0<G . 0)0<0/3 G F !0)0525 ;ampel 2 #engan absorbansi 0)0<1 sehingga 0)0<1 F 0)0<0<G . 0)0<0/3 G F 0)0115 ;ampel 3 #engan absorbansi 0)0<0 sehingga 0)0<0 F 0)0<0<G . 0)0<0/3 G F !0)0131

$OTO

,arna Larutan (tandar /Lar. Protein 0 rea*en 'iuret1

,arna Larutan Sa pe) /Lar. Sa pe) 0 rea*en 'iuret1