PRAKTIKUM ANALISIS PROTEIN DAN PIGMEN (ANTIOKSIDAN)

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

UNIVERSITAS PADJADJARAN
Gavrila Olivia C (240210140013)
Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor
Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022) 7798844, 779570 Fax.
(022) 7795780 Email: gebbyolivia@yahoo.com

ABSTRACT
Protein is a source of energy in the body as well as builder substances and regulators. Biuret
protein assay method, determination of protein content based on measurement of light absorption by
bonding a purple colored complex. Anthocyanins have the ability to react either with acids or with bases.
Both test methods biuret and anthocyanins using a spectrophotometer. Spectrophotometri is a
measurement of the absorption of light energy by a molecule at a particular wavelength. Purpose of this
lab is to determine levels of anthocyanin and protein samples. Average anthocyanins duplo content of 0
% is 6.3815, 10 % is 5.06375 %, and 20 % is 4.9468 %. Average protein content koro benguk peanut is
27,67%.
Keywords: Anthocyanins, Biuret, Protein, Spectrophotometer

PENDAHULUAN
Protein merupakan suatu zat makanan
yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini
berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh
serta sebagai zat pembangun dan pengatur.
Protein adalah polimer dari asam amino yang
dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul
protein mengandung unsur-unsur C, H, O, N, P,
S, dan terkadang mengandung unsur logam
seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).
Protein merupakan suatu polipeptida
dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000
sampai lebih dari satu juta karena molekul
protein yang besar, protein sangat mudah
mengalami perubahan fisis dan aktivitas
biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan
perubahan sifat alamiah dari protein seperti
panas, asam, basa, solven organik, garam, logam
berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji,
1996).
Oleh adanya kedua gugus tersebut asam
amino dalam larutan dapat membentuk ion yang
bermuatan positif dan juga bermuatan negatif
atau disebut juga ion amfoter (zwitterion).
Keadaan ion ini sangat tergantung pada pH

larutan. Apabila asam amino dalam air ditambah

dengan basa, maka asam amino akan terdapat
dalam bentuk (I) karena konsentrasi ion OH yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+ pada
gugus NH3+. Sebaliknya bila ditambahkan asam
ke dalam larutan asam amino, maka konsentrasi
ion H+ yang tinggi mampu berikatan dengan ion
COO- sehingga terbentuk gugus COOH
sehingga asam amino akan terdapat dalam
bentuk (II) (Anna Poedjiadi, 1994).
Protein yang terdapat dalam bahan pangan
mudah mengalami perubahan-perubahan, antara
lain:
1. Dapat terdenaturasi oleh perlakuan
pemanasan.
2. Dapat terkoagulasi atau mengendap oleh
perlakuan pengasaman.
3. Dapat mengalami dekomposisi atau
pemecahan
oleh
enzim-enzim
proteolitik.
4. Dapat bereaksi dengan gula reduksi,
sehingga menyebabkan terjadinya warna
coklat.
Analisis protein dapat dilakukan dengan
dua metode, yaitu: Secara kualitatif terdiri atas
reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi

Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi

Sakaguchi. Secara kuantitatif terdiri dari;
metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode
Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret),
dan metode spektrofotometri UV.
Komponen utama dari spektrofotometer
yang digunakan pada praktikum analisis pangan
kali ini yaitu:
1. Sumber cahaya
Untuk radisi kontinyu :
Untuk daerah UV dan daerah tampak :
Lampu
wolfram
(lampu
pijar)
menghasilkan spektrum kontiniu pada
gelombang 320-2500 nm.
Lampu hidrogen atau deutrium (160-375
nm)
Lampu gas xenon (250-600 nm)
2. Pengatur Intensitas
Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang
dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang
masuk tetap konstan.
3. Monokromator
Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis
menjadi sinar monokromatis sesuai yang
dibutuhkan oleh pengukuran.Macam-macam
monokromator yaitu sebagai berikut :
- Prisma
- kaca untuk daerah sinar tampak
- kuarsa untuk daerah UV
- Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR dan
Kisi difraksi
4. Kuvet
Pada pengukuran di daerah sinar tampak
digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan
kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah
IR.
5. Detektor
Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi
listrik yang sebanding dengan besaran yang
dapat diukur.
6. Penguat (amplifier)

Berfungsi untuk
memperbesar arus
yang dihasilkan oleh
detektor agar dapat
dibaca
oleh
indikator.
7. Indikator
Indikator
yang
digunakan
dapat
berupa
Recorder
ataupun Komputer.
Uji protein menggunakan metode
Biuret, penentuan kadar protein didasarkan pada
pengukuran serapan cahaya oleh ikatan
kompleks yang bewarna ungu. Hal ini terjadi
apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam
suasana basa alkali. Reaksi ini dilakukan pada
suasana basa alkali, dalam hal ini digunakan
NaOH, basa kuat memiliki ion OH - yang tinggi
dalam larutan sehingga mampu mengikat ion H +
pada larutan tersebut. Ion H+ yang lebih reaktif
tersebut. Ion H+ yang lebih reaktif tersebut dapat
diikat dan takakan bereaksi dengan gugus
amino, dan ion Cu+2 dapat bereaksi dengan 4
gugus amino dari ikatan peptida protein.
Warna dari larutan protein berbeda-beda
dari berbagai konsentrasi. Semakin besar
konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat
warna yang terbentuk, dan sebaliknya. Panjang
gelombang pada daerah 540 nm, maka radiasi
sinar yang kita pakai adalah sinar UV-Visual.
Secara kimia antosianin merupakan
turunan struktur aromatik tunggal, yaitu
sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen
sianidin dengan penambahan atau pengurangan
gugus hidroksil, metilasi dan glikosilasi
(Harborne 2005). Antosianin adalah senyawa
yang bersifat amfoter, yaitu memiliki
kemampuan untuk bereaksi baik dengan asam
maupun dengan basa. Dalam media asam
antosianin berwarna merah, dan pada media basa
berubah menjadi ungu dan biru (Man 1997).
Gambar 1. Rumus Struktur Antosianin
Spektrofotometri adalah pengukuran
absorbsi energi cahaya oleh suatu molekul pada
suatu panjang gelombang tertentu untuk tujuan
analisa kualitatif dan kuantitatif. Spektrofometri
sinar tampak mempunyai panjang gelombang

400 750 nm (Rohman, 2007). Prinsip kerja

spektrofotometri bila cahaya (monokromatik
maupun campuran) (I0) jatuh pada suatu
medium homogen, sebagian dari sinar masuk
akan dipantulkan (Ir), sebagian di serap (Ia)
dalam medium itu, dan sisanya diteruskan (It).
Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan
dinyatakan dalam nilai absorbansi karena
memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.
Studi spektrofotometri dianggap sebagai
perluasan suatu pemeriksaan visual yang lebih
mendalam dari absorbsi energi. Hukum Beer
menyatakan absorbansi cahaya berbanding lurus
dengan dengan konsentrasi dan ketebalan
bahan/medium (Miller J.N 2000). Keuntungan
utama metode spektrofotometri adalah bahwa
metode ini memberikan cara yang sederhana
untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat
kecil (Basset, dkk., 1994).
Bovine serum albumin (BSA) adalah
protein albumin yang berasal dari sapi. Bovine
serum albumin merupakan salah satu protein
sederhana yang berbentuk globular. Protein
mempunyai struktur dan bentuk yang berbeda
antara satu dengan lainnya, sehingga pengikatan
antara tanin dan protein.

METODOLOGI
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian
adalah minuman serbuk bunga telang, kacang
koro benguk, larutan TCA 10%, pereaksi biuret,
etil eter, akuades, CuSO4.5 H2O, NaK, KI,
NaOH 0,2 N, BSA 5 mg/ml, KCl, HCl, Na
Asetat, dan HCl pH 1. Sedangkan alat-alat yang
digunakan adalah labu ukur, gelas kimia, tabung
sentrifugasi, sentrifugator, sfektrofotometer,
tabung reaksi, batang pengaduk, kuvet, dan
neraca analitik.
Preparasi Sampel
Disiapkan 1-2 gram sampel dalam 25ml
akuades lalu aliquot sebanyak 0,5 ml ditepatkan
menjadi 1 ml
dalam tabung reaksi.
Ditambahkan 1 ml TCA 10% dan dilakukan
sentrifugasi 3000 ppm selama 10 menit. Tujuan
penambahan TCA yaitu untuk menghilangkan
residu-residu komponen lain selain protein,

sedangkan tujuan dilakukannya sentrifugasi

ini untuk memisahkan partikel partikel yang
lebih kecil sehingga menghasilkan fasa padatan
atau endapan, fasa cair diambil untuk
dilakukan
uji
penetapan
kadar dengan
metode
instrumental
atau
dengan
spektrofotometri UV. Supernatan dibuang dan
ditambahkan 2 ml etil eter, lalu dilakukan
sentrifugasi kembali dan divortex selama 1
menit. Fungsi penambahan dietil eter adalah
untuk melarutkan lemak sampel, sedangkan
tujuan vortex yaitu untuk menghomogenkan
sampel. Ditambahkan 4 ml akuades dan
dilkukan vortex kembali selama 1 menit. Setelah
itu ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 6 ml
dan diinkubasi selama 30 menit setelah itu
dibaca absorbansi x 520 nm.
Penentuan Kadar Protein Metode Biuret
Pereaksi Biuret
Disiapkan 0,3 gram CuSO4.5 H2O, 0,9
gram NaK, 0,5 gram KI, dalam 100 ml NaOH
0,2 N.
Kurva Standar
Disiapkan 5 mg/ml BSA kemudian
dimasukan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan
4 ml akuades dan 6 ml pereaksi biuret kemudian
dihomogenkan. Diamkan dalam suhu ruang
kemudian lakukan penyaringan.
Diukur
absorbansi 520 nm dan plotkan dalam grafik.
Penentuan Kadar Protein Sampel
Disiapkan 0,2 ml sampel kedalam
tabung sentrifugasi kemudian ditambahkan
akuades hingga volume bertambah menjadi 1 ml
dan 1 ml TCA 10% lalu lakukan sentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit.
Pisahkan supernatan dan ditambahkan 2 ml etil
eter lalu dilakukan senrifugasi kembali selama
30 menit. Ditambahkan 4 ml akuades dan 6 ml
pereaksi biuret lalu didiamkan dalam suhu ruang
dan dilakukan penyaringan. Diukur absorbansi
dengan panjang gelombang 520 nm.
Penentuan Kadar Antosianin
Persiapan Buffer: HCL 0,1.
a) KCl 0,0025 M (pH 1)
Pertama-tama
sampel
ditimbang
sebanyak 1,86 gram KCl dengan akuades 980
ml, lalu pH diatur hingga 1 dengan HCl pekat.
Kemudian ditepatkan menjadi 1 L.
Buffer Na-asetat (CH3COONa.3H2O)
Ditimbang 54,43 gram Na-asetat dan
larutkan dengan akuades 960 ml. Atur pH

sampai 4,5 dengan HCl pekat. Kemudian

ditepatkan menjadi 1 L.
b) Prosedur Pengujian dan Perhitungan
Konstanta Antosianin
Disiapkan 1 gram sampel untuk
dilarutkan dengan menggunakan HCl pH 1 ke
dalam labu ukur 25 ml lalu tepatkan
menggunakan akuades. Suspensi sampel
dimasukan kedalam kuvet untuk diukur
absorbansnya dengan panjang gelombang 510
nm dan 700 nm.
c) Prosedur Penetapan
Sampel bubuk bunga telang dilarutkan
ke dalam buffer pH 1 dan PH 4,5, pH 1 inkubasi
selama 15 menit sedangkan pH 4,5 inkubasi
selama 5 menit. Masing-masing buffer
masukkan kedalam kuvet untuk blanko setelah
itu tekan absorbansi menjadi 0,000 lalu
masukkan sampel dengan buffer pH tertentu.
Lakukan perhitungan kadar antosianin dengan
rumus:
A = (A510-A700) pH1- (A510-A700) pH 4,5
Kadar A (M) (%b/b) =
A

A x BM x FP x 1000
xb

= Absorbansi

b
BM
FP

= Absoprivitas molar sianidin 3glukosida

= tebal kuvet (1 cm)
= 448,8 gram/mol
= faktor pengenceran

HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisis Kadar Antosianin
Berdasarkan hasil praktikum, data yang
diperoleh tersaji dalam bentuk tabel sebagai
berikut.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Kadar Antosianin
Kel

Sampel
%

pH

A510

A700

1,2

20%

1
4,
5

0,670
0,364

0,007
0,024

Kadar
antosianin
%
5,3889

1
3,5

0%

4,7,8

10%

9,10

20%

14,16

0%

15,20

10%

4,
5
1
4,
5
1
4,
5
1
4,
5
1
4,
5

1,122
0
0,632

0,019
0
0,032

0,850
0,459

0,009
0,021

6,724

0,668
0,399

0,016
0,017

4,5047

0,569
0,321

0,003
0,017

4,371

0,241
0,45

0,021
0,017

3,4035

8,3920

Berdasarkan hasil pengamatan didapat

rata-rata kadar antosianin pada sampel minuman
serbuk dengan konsentrasi gula 20% yaitu
5,3889% dan 4,5047%. Hasil duplo ini
menujukan angka yang tidak jauh berbeda. Pada
sampel dengan konsentrasi 0% didapat rata-rata
kadar antosianin sebesar 8,3920% dan 4,371%.
Hasil duplo ini menunjukan jumlah yang jauh
berbeda. Pada konsentrasi 10%, rata-rata kadar
antosianin yang didapat yaitu 6,724% dan
3,4035%. Hasil duplo ini menunjukan angka
yang jauh berbeda. Menurut literatur, Kadar
antosianin pada bunga telang tanpa penambahan
gula adalah 6,35 mg/ml (Zussiya, 2012).
Terdapat perbedaan literatur dengan praktikum
yang dilakukan.
Penurunan kadar antosianin berbanding
terbalik dengan penambahan kadar gula.
Semakin tinggi kadar gula yang ditambahkan
dalam sari buah, semakin rendah kadar
antosianin yang terkandung. Efek penurunan
antosianin terjadi sebagai akibat adanya
degradasi gula menjadi furfural dan 5hydroxymethyl-furfural yang terbentuk pada
kondisi asam dan gula dipanaskan secara
bersamaan dan bereaksi dengan antosianin
membentuk produk berwarna coklat (Cao, S.,
2009).
Hal ini kemungkinan karena dengan
adanya kadar gula yang tinggi akan
menyebabkan degradasi warna merah sehingga
warna merah terlihat makin pudar. Menurut
deMan (1997), konsentrasi gula yang lebih
tinggi dan adanya oksigen akan mengakibatkan

kerusakan pigmen yang lebih besar. Hal ini

didukung juga oleh Sudarmanto dkk. (1990)
bahwa beberapa faktor yang mempengaruhi laju
kerusakan antosianin selain lama penyimpanan
dan suhu yang tinggi, peningkatan kadar gula
juga akan mengurangi kandungan pigmen.
DPPH atau 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(,-difenil- pikrilhidrazil) merupakan suatu
radikal bebas yang stabil dan tidak membentuk
dimer akibat delokalisasi dari elektron bebas
pada seluruh molekul. Delokalisasi elektron
bebas ini juga mengakibatkan terbentuknya
warna ungu pada larutan DPPH sehingga bisa
diukur absorbansinya pada panjang gelombang
sekitar 520 nm. Ketika larutan DPPH dicampur
dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom
hidrogen, maka warna ungu dari larutan akan
hilang seiring dengan tereduksinya DPPH
(Larson, 1988).
Uji aktivitas antioksidan dengan
menggunakan metode ini berdasarkan dari
hilangnya warna ungu akibat tereduksinya
DPPH oleh antioksidan. Intensitas warna dari
larutan uji diukur melalui spektrofotometri UVVis pada panjang gelombang sekitar 520 nm.
Hasil dari uji ini diinterpretasikan sebagai EC50,
yaitu jumlah antioksidan yang diperlukan untuk
menurunkan konsentrasi awal DPPH sebesar
50%. Pada metode ini tidak diperlukan substrat
sehingga memiliki keuntungan, yaitu lebih
sederhana dan waktu analisis yang lebih cepat.

Kadar Protein
Penentuan
kadar
protein
ini
menggunakan
metode
biuret.
Sebelum
mengukur absorbansi sampe terlebih dahulu
dibuat kurva standar dengan menggunakan
larutan BSA (Bovine serum albumin) sebagai
protein yang telah diketahui konsentrasinya.
Tabel 2. Hasil Pengamatan Kurva Standar
BSA
Ppm (x)
Absorbansi (y)
0
0
250
0,044
500
0,118
750
0,185
1000
0,234
1250
0,303

1500
1750

0,386
0,439

Gambar 2. Kurva Standar BSA

Tabel 3. Hasil Pengamatan Kadar Protein

Kacang Koro Benguk
Ppm (x) Absorbansi (y) % Protein
0,175
27,83
0,173
27,52
0,174
27,67
Kurva standar menunjukkan persamaan
y = 2,589.10-4x - 0,0192 dengan R2 = 0,9866.
Nilai R menguji sejauh mana hubungan sebab
akibat antara variabel faktor penyebab (x)
terhadap Variabel Akibatnya (y). Semakin nilai
R mendekati nilai 1, maka semakin baik kurva
yang dibuat. Hasil kadar protein ppm sampel
didapat dengan memasukkan absorbansi yang
didapat
dari
spektrofotometer
kedalam
persamaan y = 2,589.10-4x - 0,0192 dan akan
didapat x sebagai kadar protein dalam ppm.
Hasil menunjukkan rata-rata kadar
protein kacang koro benguk sebesar 27,67%.
Menurut Poerwo Soedarmo dan Achmad Djaeni
Sediaoetama (1996), kadar protein koro benguk
24,0 g/100 g bahan atau sebesar 24%.

KESIMPULAN
Semakin banyaknya kandungan gula
pada sampel, maka persen kadar antosianin pada
sampel akan semakin menurun. Sedangkan
semakin sedikit kandungan gula pada sampel,
maka persen kadar antosianin pada sampel akan
semakin meningkat. Rata-rata kadar protein
kacang koro benguk sebesar 27,67%.

DAFTAR PUSTAKA

Anna Poedjiadi, 1994. Dasar-Dasar Biokimia.

Penerbit UI-Press: Jakarta.

Man, J. M. de. 1997. Kimia Makanan. ITB.

Bandung.

Basset. J, dkk, 1994, Buku Ajar Vogel Kimia

Analisis
Kuantitatif
Anorganik,
Penerbit: Buku Kedokteran EGC,
jakarta, hal: 809 866.

Miller, J.N and Miller, J.C. 2000. Statistics and

Chemometrics for Analytical Chemistry,
4th ed, Prentice Hall : Harlow.

Cao, S. Liang, L. Qi Lu, Yuan Xu, Siyi Pan,

Kexin Wang. Integrated Effects of
Ascprbic Acid, Flavonoids and Sugars
on
Thermal
Degradation
of
Anhocyanins in Blood Orange Juice.
Eur Foof Res Technol. 2009. 2(28) 9758983.
deMan, M.J. 1997. Kimia Makanan. Penerjemah
K. Padmawinata. ITB-Press. Bandung.
Harborne. 2005. Encyclopedia of Food and
Color Additives. CRC Press, Inc. New
York.
Larson,

Mildred L. 1988. Penerjemahan

Berdasarkan Makna: Pedoman untuk
Pemadanan Antarbahasa (Diterjemahkan
oleh
Kencanawati
Taniran
dari
Meaning-based Translation: A Guide to
Cross Language Equivalence). Jakarta:
Penerbit Arcan.

Rohman. 2007. Kimia Farmasi

Yogyakarta : Pustaka Pelajar.

Analisis.

Sediaoetama, A. D. 1996. Ilmu Gizi untuk

Mahasiswa dan Profesi. Jilid I. Dian
Rakyat, Jakarta.
Sudarmadji, Slamet et al. 1996. Prosedur
Analisis Bahan Makanan dan Pertanian.
Yogyakarta: Penerbit Liberty.
Sudarmanto. 1990. Bahan Pewarna Alami dalam
Tanaman Pangan. PAU Pangan dan Gizi.
UGM. Yogyakarta.
Winarno, F. G. 1992. Kimia Pangan dan Gizi.
Gramedia. Jakarta.
Zussiya, A. et al.2012.Ekstraksi dan Analisis Zat
Warna Biru (Anthosianin) dan Bunga
Telang (Clitoria Ternatea) sebagai
Pewarna Alami.Jurnal teknologi Kimia
dan Industri. 1(1).356-365.