Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
IV.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil pengamatan Pengamatan Konstanta Michaelis Pada Hidrolisis

Sukrosa Oleh Beta-fruktofuranosidase Dari Yeast
1
1
[S ]
[V ]
Kel Tabung
A
[S]3,5
V
KM
1
1
2,076 0,525 5,767 x 10-3
2
2
2,102 0,420 5,839 x 10-3
3
3
2,057 0,315 5,714 x 10-3
4
4
2,110 0,210 5,861 x 10-3
5
5
2,045 0,105 5,681 x 10-3
6
1
2,102 0,525 5,839 x 10-3
7
2
2,049 0,420 5,692 x 10-3
8
3
2,057 0,315 5,714 x 10-3
9
4
2,055 0,210 5,708 x 10-3
10
5
2,053 0,105 5,703 x 10-3
(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2015)
4.2

(x)
1,905
2,381
3,175
4,762
9,524
1,905
2,381
3,175
4,762
9,524

(y)
173,400
171,262
175,009
170,619
176,025
171,262
175,685
175,009
179,193
175,346

2,2525 x
10-3

1,7011 x
10-3

Pembahasan
Praktikum kali ini adalah mengenai penentuan konstanta Michaelis pada

hidrolisis

sukrosa

oleh

betafruktofuranosidase

dari

yeast

(beta-D-

fructofuranosidase fructihydrolase). Aktivitas enzim dapat dikontrol dengan

menggunakan beberapa cara. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim
biasanya proporsional dengan konsentrasi enzim aktif, dan tergantung (secara
kompleks) pada substrat, inhibitor, dan konsentrasi kofaktor, serta pada pH dan
suhu (Fennema, 1996).
Aktivitas enzim tergantung pada konsentrasi enzim dan subtrat, suhu, pH,
dan inhibitor. Jika jumlah enzim dalam suatu reaksi dinaikkan dua kali lipat
maka jumlah substrat yang diubah menjadi produk meningkat dua kali lipatnya.
Hal ini bisa dipahami dengan mengasumsikan bahwa dua molekul enzim dapat
menangkap sebanyak 2x5 molekul substrat dalam waktu tertentu. Dengan
bertambahnya jumlah molekul (kenaikan konsentrasi enzim) maka jumlah
molekul substrat yang dapat ditangkap oleh enzim menjadi 4x5 (Tensiska dkk,
2010).
Konsentrasi enzim juga dapat mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis.
Jika jumlah substrat sangat terbatas maka kecepatan reaksi maksimum untuk suatu

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
jumlah enzim tidak dapat dicapai sebelum ditambahkan substrat lagi ke dalam
sistem reaksinya. Keterkaitan jumlah enzim dan substrat sangat penting dalam
usaha untuk mencapai kecepatan reaksi enzimatis maksimum, dengan demikian
konsentrasi substrat pada kecepatan reaksi enzimatis juga merupakan faktor
penting (Tranggono dan Sutardi, 1990).
Dalam reaksi enzim dikenal kecepatan reaksi hidrolisis, penguraian, atau
reaksi katalisasi lain yang disebut velocity (V). Nilai V dari suatu reaksi enzimatik
pada umumnya sangat tergantung pada konsentrasi substrat. Semakin tinggi
konsentrasi substrat reaksi enzim semakin cepat, sampai mencapai kecepatan
tetap. Pada konsentrasi enzim tetap (tertentu) harga V hampir linier dengan
konsentrasi substrat [S]. Pada konsentrasi substrat yang tinggi (berlebihan),
kecepatan reaksi V akhirnya mencapai maksimum. Hubungan konsentrasi substrat
dengan kecepatan reaksi dapat dilihat pada grafik berikut ini.

Gambar 1. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Kecepatan Reaksi

Pada grafik tersebut dapat dilihat bahwa hingga konsentrasi substrat
tertentu kecepatan reaksi naik sebanding dengan peningkatan konsentrasi substrat.
Namun pada batas konsntrasi substrat tertentu (pada grafik disebut daerah
plateau) maka kecepatan reaksi menjadi tidak sebanding dengan peningkatan
konsentrasi substrat. Pada daerah ini kecepatan cenderung tidak mengalami
perubahan. Adapun kecepatan absolute (Vmax) akan tercapai saat konsentrasi
substrat memenuhi kapasitas enzim dalam merubah substrat per detik (Tensiska,
2009).
Pada konsentrasi substrat rendah reaksinya adalah kinetika order satu
terhadap substrat, selanjutnya menjadi orde nol apabila kecepatan reaksinya tidak
lagi tergantung pada konsentrasi substrat, oleh sebab itu substrat konsentrasi
rendah menyebabkan tidak semua enzim berikatan dengan substratnya. Hal ini

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
menyebabkan kecepatan maksimum tidak dapat dicapai untuk sejumlah enzim
tertentu. Sifat ikatan antara enzim dan substrat adalah dua arah membentuk
kompleks enzim substrat. Oleh sebab itu, substrat konsentrasi rendah
menyebabkan tidak semua enzim berikatan dengan substratnya, dengan demikian
kecepatan maksimum tidak dapat dicapai untuk sejumlah enzim tertentu. Pada
substrat konsentrasi tinggi, semua molekul enzim dapat membentuk kompleks
dengan substrat (E-S) yang selanjuynya dengan menaikkan konsentrasi substrat
tidak berpengaruh terhadap konsentrasi substrat tidak berpengaruh pada kecepatan
reaksinya (Tranggono, 1990).
Konsentrasi maksimum absolut (Vmax) akan tercapai saat konsentrasi
substrat memenuhi kapasitas enzim dalam merubah susbtrat per detik. Sementara
itu substrat pada Vmax tidak bergantung pada konsentrasi enzim karena setiap
molekul dalam larutan bekerja secara bebas. Kinetika reaksi enzim-substrat
pertama kali dikemukakan oleh Michaelis dan Menten (1931) yang mengajukan
teori bahwa sifat ikatan antara enzim dan substrat adalah dua arah (bolak-balik)
membentuk kompleks enzim-substrat. Dari teori tersebut daapt diperoleh suatu
persamaan reaksi sbb :
v=

Vmax [ S]
Km+[S ]
Konstanta michaelis (Km) merupakan parameter yang ditentukan secara

percobaan yang kebalikannya menyatakan keaktifan enzim terhadap substratnya,

untuk kadar enzim yang tetap, tetapan/konstanta Michaelis adalah kadar substrat
yang laju reaksinya setengah laju maksimumnya. Umumnya konstanta Michaelis
setara dengan tetapan disosiasi kompleks enzim-substrat. Konstanta Michaelis
merupakan suatu tetapan kinetik untuk substrat tertentu dari reaksi enzimatik
(Pudjaatmaka, 2002).
Nilai Km merupakan ciri khusus untuk setiap reaksi enzim. Semakin kecil
nilai Km, maka semakin besar afinitas enzim terhadap substrat. Km enzim tertentu
bersifat konstan dan tidak tergantung pada konsentrasi. Jika enzim mempunyai
lebih dari 2 substrat, maka enzim tersebut akan memiliki nilai Km lebih dari dua.

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
Menurut Tensiska (2010), nilai konstanta Michaelis (Km) mempunyai
beberapa fungsi, diantaranya adalah :
1.
2.
3.
4.

Salah satu ciri enzim.

Menggambarkan afinitas enzim terhadap substrat.
Enzim dengan nilai Km rendah, berarti afinitasnya tinggi.
Enzim dengan Km (<10-6 M) sangat penting dalam metabolisme,
sedangkan enzim dengan nilai Km lebih dari atau sama dengan 10 -2 M

dianggap kurang penting.

5. Pengukuran aktivitas enzim dalam IU selain pada kondisi pH optimum,
suhu standar (250C), juga harus dilakukan pada (S) jenuh.
6. Kerja penghambatan enzim dapat diketahui berdasarkan pengaruhnya pada
nilai Km.
Beta-Frukrofuranosidase adalah suatu glukosidase yang terdapat dalam
yeast dan memacu hidrolisis sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa. Enzim ini
dikenal juga sebagai invertase atau sukrase. Sukrosa bukan merupakan gula
pereduksi, sedangkan fruktosa dan glukosa merupakan gula pereduksi. Berhasil
tidaknya hidrolisis sukrosa oleh enzim ini dapat dilihat dengan melakukan uji
benedict. Jika warna larutan setelah uji benedict berwarna hijau, maka hidrolisis
sukrosa berhasil.
Enzim Beta-Frukrofuranosidase dalam praktikum ini digunakan untuk
menghidrolisis sukrosa. Sebelum digunakan untuk hidrolisis sukrosa, enzim ini
dimurnikan terlebih dahulu. Menurut Page (1989), hal ini bertujuan untuk
mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstra sel mentah (crude) yang mengandung
banyak komponen lain. Sebanyak 0,8 gram yeast dihaluskan, kemudian
ditambahkan dengan larutan buffer pH 4,5 sebanyak 80 ml. Penambahan larutan
buffer ini dilakukan untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan pH. Yeast tersebut
selanjutnya disentrifuge, dan diambil filtratnya yang merupakan hasil dari
pemurnian enzim Beta-Frukrofuranosidase.
Hidrolisis sukrosa dengan enzim ini terdapat 5 perlakuan berbeda, yaitu
masing-masing tabung reaksi dimasukkan larutan sesuai dengan prosedur, lalu
kelima tabung reaksi yang telah diisi masing-masing larutan dipanaskan pada
suhu 370C selama 5 menit. Pemanasan ini dilakukan untuk mempercepat reaksi.
Tabung yang sudah dipanaskan kemudian ditambahkan 4 ml suspensi yeast yang
telah dibuat kedalamnya. Tabung tersebut diinkubasi selama 6 menit. Inkubasi ini
dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis sukrosa oleh enzim yang terdapat

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
dalam yeast. Setelah diinkubasi, ke dalam tabung tersebut ditambahkan larutan
NaOH 1% sebanyak 2 ml. Penambahan NaOH ini dilakukan untuk membantu
enzim dalam menghidrolisis sukrosa. Larutan pada tabung tersebut selanjutnya
diuji dengan pereaksi benedict untuk membuktikan keberhasilan hidrolisis sukrosa
oleh enzim dalam yeast.
Uji Benedict merupakan uji untuk membedakan gula reduksi berdasarkan
reduksi ion kupri dalam suasana alkalis. Menurut Winarno (1991), Benedict
merupakan pereaksi yang terdiri dari kupri sulfat, natrium sitrat, dan natrium
karbonat. Timbulnya endapan warna merah, hijau, kuning, atau merah oranye
menunjukkan adanya gula pereduksi dalam sampel.
Glukosa merupakan gula pereduksi. Glukosa dapat mereduksi ion Cu 2+
dari tembaga (II) sulfat menjadi Cu+, selanjutnya diendapkan sebagai Cu2O.
Endapan yang terbentuk dapat berwarna hijau, kuning, atau merah bata,
tergantung dari konsentrasi karbohidrat (Sunarya dan Setiabudi, 2007). Fruktosa
juga merupakan gula pereduksi. Hal ini disebabkan oleh fruktosa memiliki gugus
OH bebas yang reaktif.
Uji benedict ini dilakukan dengan memasukkan larutan sampel sebanyak
1 ml ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 5 ml larutan
benedict. Larutan tersebut selanjutnya dipanaskan selama 2 menit. Pemanasan
karbohidrat pereduksi dengan pereaksi benerdict akan menyebabkan terjadinya
perubahan warna dari biru

hijau

kuning

kemerah-merahan dan

akhirnya terbentuk endapan merah bata kupro oksida apabila konsentrasi

karbohidrat pereduksi cukup tinggi. Pemanasan dilakukan untuk mempercepat
reaksi yang terjadi. Karbohidrat pereduksi akan teroksidasi menjadi asam onat,
sedangkan pereaksi Benedict (Cu2+) akan tereduksi menjadi kupro oksida,
sehingga dalam uji ini terjadi reaksi okidasi dan reduksi (Sumardjo, 2009).
Larutan yang telah dipanaskan tersebut selanjutnya dipindahkan ke dalam kuvet,
kemudian dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer ( = 630
nm).

Gambar 2. Hasil Pengamatan Larutan pada Uji Benedict

(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2015)

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2

Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh, larutan setelah dilakukan

uji benedict menghasilkan larutan yang berwarna hijau, yang menunjukkan hasil
positif gula pereduksi dengan uji benedict. Larutan berwarna hijau karena
konsentrasi sukrosa yang digunakan tidak terlalu tinggi, sehingga konsentrasi gula
pereduksi hasil hidrolisis juga tidak terlalu tinggi. Positifnya hasil uji benedict
terhadap larutan menunjukkan bahwa terdapat gula pereduksi dalam larutan
tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa hidrolisis sukrosa oleh enzim BetaFrukrofuranosidase yang berasal dari yeast berhasil.
Nilai absorbansi larutan yang telah diperoleh selanjutnya digunakan untuk
menghitung konstanta Michaelis. Nilai Km diperoleh dari hasil regresi yang
dilakukan. Berikut ini adalah hasil yang diperoleh :
Contoh perhitungan kelompok 2 :
V=

[S] =

A
t (s)

2,102
360

= 5,839 x 10-3 m/s2

kadar sukrosa
x 3,5
= 0,420
1000

1
1
=
=2,381
[S ] 0,420

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
1
1
=
=171,262
[V ] 0,005,839

Hasil regresi kalkulator :

Kelompok 1-5

Kelompok 6-10

b = 171,582

b = 174,012

a = 0,3865

a = 0,296

r = 0,5127

r = 0,3248

Vmax
1
Vmax

b=

171,582 =

Vmax
1
Vmax

b=
1
Vmax

174,012 =

1
Vmax

Vmax = 5,828 x 10-3

Vmax = 5,747 x 10-3

KM

a=

Km
Vmax

0,3865 =

KM

a=
Km
5, 8 28 x 103

Km
Vmax

0,296 =

Km= 2,2525 x 10-3

Km
5,747 x 103

Km= 1,7011 x 10-3

Jadi rata-rata nilai konstanta Michaelis dari kedua data yang didapat yaitu :
3

Km=

2,2525 x 10 +1,7011 x 10
=1,9768 x 103
2
Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh tersebut, didapatkan nilai

Km sebesar

1,9768 x 103 . Nilai Km yang rendah ini menunjukkan bahwa

afinitas enzim terhadap substrat cukup tinggi, yang menunjukkan bahwa kerja
enzim tidak terlalu efektif. Kerja enzim dikatakan efektif jika memiliki nilai
afinitas yang rendah, dengan kata lain memiliki Km yang tinggi. Hal ini tidak

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
sesuai dengan pendapat Acosta dkk (2000) yang menyatakan bahwa nilai
absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin besarnya konsentrasi larutan
gula.

Hubungan antara 1/V dengan 1/[S] dapat dinyatakan dalam grafik. Berikut
ini adalah grafik yang dihasilkan berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh :

Grafik Hubungan Antara 1/V dengan 1/[S]

Gambar 3. Grafik Hubungan Antara 1/V dengan 1/[S] Kelompok 1-5

(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2015)

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2

Grafik Hubungan Antara 1/V dengan 1/[S]

Gambar 4. Grafik Hubungan Antara 1/V dengan 1/[S] Kelompok 6-10

(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2015)
Berdasarkan grafik tersebut dapat terlihat hubungan antara kecepatan
dengan konsentrasi substrat. Grafik yang diperoleh menurun, yang menandakan
hubungan antara kecepatan reaksi dengan konsentrasi substrat berbanding
terbalik, yang menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi substrat maka
semakin kecil nilai kecepatan reaksinya. Hal ini tidak sesuai dengan literatur,
karena menurut literatur hingga konsentrasi substrat tertentu kecepatan reaksi naik
sebanding dengan peningkatan konsentrasi substrat, sehingga grafik yang
diperoleh akan naik. Tidak sesuainya hasil pengamatan dengan literatur dapat
disebabkan oleh terjadinya kesalahan dalam praktikum.

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
V.

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan

Hasil uji benedict terhadap sampel menunjukkan hasil yang positif, yang
menunjukkan

bahwa

enzim

Beta-Frukrofuranosidase

berhasil

menghidrolisis sukrosa.
Nilai Km yang diperoleh pada hidrolisis sukrosa oleh enzim BetaFrukrofuranosidase ini rendah, yang menunjukkan bahwa afinitas enzim

terhadap substrat tinggi.

Grafik hubungan antara kecepatan reaksi dengan konsentrasi substrat
menurun, seharusnya grafik naik karena hingga konsentrasi substrat
tertentu kecepatan reaksi naik sebanding dengan peningkatan konsentrasi
substrat.

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
DAFTAR PUSTAKA
Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000. Characterization of recombinant
invertase expressed in methylotropic yeasts. Biotechnology and Applied
Biochemistry, 32: 179-187.
Fennema, O.R. 1996. Food Chemistry. Edisi Ketiga. Marcel Dekker, Inc, New
York.
Page, D. S. 1989. Prinsip-prinsip Biokimia. Edisi kedua. Alihbahasa.
Pudjaatmaka, A.H. 2002. Kamus Kimia. Cetakan Kedua. Penerbit Balai Pustaka,
Jakarta.
Sumardjo, D. 2009. Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokterann dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Penerbit Buku
Kedokteran EGC, Jakarta.
Sunarya, Y dan A. Setiabudi. 2007. Mudah dan Aktif Belajar Kimia. PT Setia
Purna Invers, Bandung.
Tensiska, M. Miranti, dan Y. Cahyana. 2010. Biokimia Pangan-1. Widya
Padjadjaran, Bandung.
Tranggono, Setiaji B., Suhardi, Sudarmanto, Y. Marsono, Agnes Murdianti, Indah
S.U., dan Suparmo. 1990. Biokimia Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan
dan gizi, UGM.
Winarno, F.G. 1991. Kimia Pangan dan Gizi. PT Gramedia Pustaka Utama,
Jakarta.

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
Jawaban Pertanyaan
1. Bila diperoleh data sebagai berikut, tentukanlah nilai Vmax dan Km bagi
reaksi suatu enzim
[S], M
2,5 x 10-6
4,0 x 10-6
1 x 10-5
2 x 10-5
4 x 10-5
1 x 10-4
2 x 10-3
1 x 10-2

V, ml / L menit
28
40
70
95
112
128
139
140

Jawab :
[S], M
2,50E-06
4,00E-06
1,00E-05
2,00E-05
4,00E-05
1,00E-04
2,00E-03
1,00E-02

V, ml / L menit
28
40
70
95
112
128
139
140

Hasil regresi :
a = 0,0226
b = 3,677 x 10-8
y = bx + a
1/V = Km/Vmax . 1/[S] + 1/Vmax
a=

0,0226 =

Vmax = 44,248
b=

1/[S]

1/V
400000
250000
100000
50000
25000
10000
500
100

0,035714
0,025
0,014286
0,010526
0,008929
0,007813
0,007194
0,007143

Gavrila Olivia Christianto

240210140013
Kelompok 2
3,677 x 10-8 =

Km
44,248

Km = 1,623 x 10-6