LAPORAN PRAKTIKUM

BPS3202
LABORATORIUM TEKNOLOGI BIOPROSES

Modul Praktikum:
Konversi Enzimatis (ENZ)
Dosen: Roga Florida Kembaren, M.Sc
Adrianto Prihartantyo, S.Si, M.T

Asisten : Putry Yosefa Siboro

Kelompok : LABTEK/1819/06
Fernanda Siallagan (31S16027)
Nehemia Hutajulu (31S16022)
Romauli N. Pangaribuan (31S14007)

Tanggal Praktikum:
11-12 Maret 2019

PROGRAM STUDI TEKNIK BIOPROSES

FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
INSTITUT TEKNOLOGI DEL
MARET 2019
 LEMBAR PENGESAHAN
LAPORAN PRAKTIKUM
JUDUL PRAKTIKUM

BPS3202 Laboratorium Teknik Bioproses

Tahun Ajaran 2018/2019

Catatan Pengampu Modul

Telah diperiksa oleh

Dosen Pengampu Modul

Roga Florida Kembaren, M.Sc Adrianto Prihartantyo, S.Si, M.T

Tanggal :________________ Tanggal :________________
LEMBAR PENUGASAN
 ABSTRAK

Enzim merupakan molekul protein kompleks yang dihasilkan dalam tubuh mahluk hidup dan
berfungsi dalam mengkatalisa reaksi biokimia. Konversi enzim adalah pengubahan substrat
menjadi produk oleh enzim. Dalam praktikum konversi enzim ini digunakan enzim selulase.
Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler yang berfungsi untuk mengurai selulosa
menjadi glukosa dengan cara memutuskan ikatan  -1,4-glikosidik. Substrat yang digunakan
dalam percobaan ini adalah kertas whatman dengan kandungan selulosa dalam kertas adalah
97%. Dalam praktikum digunakan variasi jumlah substrat yaitu 50 mg, 100 mg, dan 150 mg.
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk membuat kurva baku glukosa, kurva Michaelis-
Menten, kurva Linewaver-Burk dan kurva Hanes-Woolf. Serta untuk menentukan nilai Filter
Paper Unit (FPU), V0, Km, Vmax dan %yield. Praktikum ini terdiri dari tiga bagian besar
yaitu pembuatan kurva baku glukosa, pengujian aktivitas enzim selulase dan reaksi enzimatis
enzim selulase. Pada pembuatan kurva baku glukosa, dibuat larutan glukosa dengan
konsentrasi tertentu kemudian diukur absorbansinya. Plot antara konsentrasi glukosa dan
absorbansi akan mengasilkan grafik. Melalui grafik tersebut diperoleh persamaan kurva baku
glukosa. Pada pengujian aktivitas enzim selulase, dibuat variasi dilusi enzim. Pada masing-
masing dilusi enzim dimasukkan substrat sebanyak 50 mg. Produk (glukosa) yang dihasilkan
dianalisa dengan metode DNS. Melalui plot antara dilusi enzim dan produk (mg) diperoleh
grafik. Dengan menggunakan grafik dapat diketahui nilai dilusi enzim untuk mengasilkan 2
mg glukosa/0,5 mL. Substitusi nilai dilusi enzim ke persamaan FPU akan menghasilkan nilai
FPU. Pada percobaan reaksi enzimatis, digunakan 3 variasi konsentrasi substrat yaitu 50,100
dan 150 mg. Ketiga variasi subsrat ini diberi perlakuan yang sama. Konsentrasi enzim yang
digunakan didasarkan pada nilai FPU yang diperoleh. Reaksi dilakukan selama 60 menit dan
pengambilan sampel dilakukan pada selang waktu 10 menit. Vo ditentukan dengan memplot
jumlah glukosa terhadap waktu. Nilai Vo yang diperoleh digunakan untuk menentukan nilai
Vmax dan Km melalui persamaan Michaelis-Menten. Untuk membuat kurva Michaelis Menten,
Lineweaver-Burk dan Hanes-Woolf dimisalkan beberapa konsentrasi subsrat kemudian nilai
tersebut disubstitusi ke persamaan Vo sehingga dihasilkan nilai Vo untuk masing-masing
konsentrasi substrat. Data konsentrasi substrat dan kecepatan awal (Vo) digunakan untuk
membuat Kurva Michaelis Menten, Lineweaver-burk dan Hanes-Woolf. Nilai % yield
diperoleh dengan membagi konsentrasi produk yang terbentuk dengan konsentrasi substrat
yang terkonversi dikali 100%. Berdasarkan hasil praktikum, diperoleh persamaan kurva baku
glukosa y = 0,019x + 0,021; nilai FPU sebesar 92.5 unit/ml; nilai V0 untuk substrat 50, 100
dan 150 mg masing-masing sebesar 0,526 , 0,537 , 0,544 mg/menit ; nilai Vmax dan Km
masing-masing sebesar -0,3623 mg/menit dan -0,2004 mg; nilai % yield untuk substrat 50,
100, 150 mg masing-masing sebesar 75,77%, 29,7% dan 20,5% serta telah dibuat kurva
Michaelis menten, Lineweaver-burk, dan Hanes-Woolf.

Keyword : Enzim, konversi enzim, kurva baku glukosa, Filter Paper Unit (FPU), V0, Km,
Vmax, kurva Michaelis-Menten, kurva Linewaver-burk, kurva Hanes-Woolf dan
%yield
 BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Tujuan Umum Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk meningkatkan keterampilan praktikan dalam
melaksanakan proses konversi enzimatis menggunakan enzim bebas atau enzim terimobilisasi.

I.2 Tujuan Khusus Percobaan

Adapun tujuan khusus dari percobaan konversi enzimatis adalah sebagai berikut:
a. Pembuatan kurva baku glukosa (duplo)
b. Penentuan FPU enzim selulase
c. Reaksi enzimatis konversi selulosa dengan variasi jumlah substrat
d. Penentuan V0, Vmax , K m , kurva Michaelis Menten serta kurva Lineweaver Burk
e. Analisa data dengan Hanes-Woolf
f. Penentuan yield
 BAB II
TEORI DASAR
II.1 Enzim
Enzim adalah makromolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis biologi. Enzim
mengkatalisa hamper semua reaksi kimia di dalam sel. Sebagian besar enzim merupakan
protein, kecuali enzim ribozyme. Enzim dapat meningkatkan laju reaksi dengan menurunkan
energy aktivasi. Di dalam reaksi, enzim tidak dikonsumsi (tidak turut bereaksi) sehingga dapat
digunakan kembali (renewable). Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivasi enzim antara lain:

1. Suhu
Setiap enzim memiliki suhu dimana enzim bekerja maksimal yang disebut sebagai suhu
optimum. Enzim bekerja dengan lambat pada suhu rendah namun akan terdenaturasi
pada suhu tinggi.
2. pH
pH dimana aktivasi enzim maksimal disebut pH optimum. Pada pH yang lebih tinggi,
atau lebih rendah dari pH optimumnya aktivitas enzim akan menurun. pH menentukan
struktur tiga dimensi enzim. Pada pH yang tidak sesuai, struktur tiga dimensi bias
berubah sehingga tidak dapat berfungsi sebagai biokatalis.
3. Konsentrasi substrat.
Kenaikan konsentrasi substrat akan berbanding lurus dengan kenaikan jumlah produk
yang
terbentuk namun akan mencapai suatu titik dimana sisi aktif enzim akan penuh ( enzim
menjadi jenuh) sehingga tidak dapat membentuk kompleks enzim substrat. Pada
kondisi ini, kecepatan reaksi enzim tidak bergantung pada konsentrasi substrat.
4. Inhibitor
Merupakan senyawa yang dapat menghambat kerja enzim. Inhibitor bekerja bersifat
spesifik dan bekerja pada konsentrasi rendah.
5. Kofaktor
Kofaktor merupakan molekul atau ion yang dapat berikatan dengan apoenzim (enzim
yang tidak aktif). Sehingga apoenzim dapat berubah menjadi holoenzim. Contoh
kofaktor adalah Mn2+ ,Mg2+, Fe2+, Cu2+.

Enzim dapat membentuk kompleks enzim substrat. Substrat berikatan dengan enzim pada sisi
aktif. Enzim memiliki bentuk sisi aktif yang spesifik dan hanya berikatan dengan substrat
spesifik. Oleh karena itu, enzim dapat menghasilkan produk murni yang bebas dari produk
samping yang tidak diinginkan. Model kinetika reaksi enzim yang paling sederhana adalah
model Michaelis Menten/Model Kinetika Saturasi.

𝑑[𝑃]
• 𝑉= = 𝑘2 [𝐸𝑆]
𝑑𝑡
𝑑 [𝐸𝑆 ]
• = 𝑘1 [𝐸][𝑆] − 𝑘−1 [𝐸𝑆] − 𝑘2 [𝐸𝑆]
𝑑𝑡

Michaelis menten menggunakan pendekatan kesetimbangan cepat(rapid equilibrium) sehingga

[ES] dapat dinyatakan dalam [S] dengan pernyataan:

𝑘1 [𝐸][𝑆]
𝐾𝑚 = =
𝑘−1 [𝐸𝑆]

Karena enzim tidak terkonsumsi maka:

[𝐸] = [𝐸0 ] − [𝐸𝑆 ]

[𝐸0 ] − [𝑆]
[𝐸𝑆] =
𝐾𝑚 + [𝑆]

Sehingga,

𝑑𝑃 [𝐸0 ]𝑥[𝑆] 𝑉𝑚 [𝑆]

𝑉= = 𝑘2 =
𝑑𝑡 𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆]

Nilai konstanta Michaelis Menten yaitu 𝐾𝑚 dan 𝑉𝑚sulit ditentukan secara eksperimen sehingga
dapat dicari dengan data pendekatan laju awal (initial rate) pada konsentrasi substrat awal dan
enzim awal yang diketahui.

II.2 Kinetika Reaksi Enzim

Kinetika enzim adalah salah satu cabang enzimologi yang membahas tentang pengaruh
konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi enzimatis. Model kinetika reaksi enzimatis yang
paling sederhana disebut juga model Michaelis-Menten. Berdasarkan postulat Michaelis-
Menten pada suatu reaksi enzimatis terdiri dari beberapa fase yaitu pembentukan kompleks ES,
dimana E adalah enzim dan S adalah substrat, modifikasi dari substrat membentuk produk (P)
yang masih terikat dengan enzim (EP), pelepasan produk dari molekul enzim. Paramaeter
dalam kinetika reaksi enzim adalah konstanta Michaelis-Mentan (K m ) dan laju reaksi
maksimum (Vmax ). Nilai 𝐾𝑚 didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat
enzim mencapai kecepatan setengah kecepatan maksimum. Setiap enzim memiliki nilai K m
dan Vmax yang khas dengan substrat spesifik pada suhu dan pH tertentu. Nilai K m yang kecil
menunjukkan bahwa kompleks enzim substrat memiliki afinitas tinggi terhadap substrat, jika
nilai K m suatu enzim besar, maka enzim tersebut memiliki afinitas yang rendah terhadap suatu
substrat (Poliana, 2007).

Persamaan Michaelis-Menten secara matematika dinyatakan dalam persamaan berikut.

Vmax[S]
V0 =
K m + [S]

dengan V0 = kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S]

Vmax = kecepatan maksimum

K m = tetapan Michaelis-Menten enzim bagi substrat tertentu

Hubungan konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik dijelaskan pada
Gambar II.1 berikut.

Gambar II.1 Kurva Michaelis-Menten (Pearson Education, 2003)

Persamaan Michaelis-Menten dapat ditransformasi secara aljabar menjadi bentuk lain

yang lebih umum dengan membuat kebalikan dari kedua persamaan Michaelis-Menten,
sehingga diperoleh persamaan Lineweaver-Burk berikut.

1 Km 1 1
= +
V0 Vmax [S] V0
Bagi enzim yang mengikuti hubungan Michaelis-Menten secara bemar, pemetaan 1/V0
terhadap 1/[S] menghasilkan garis lurus yang memiliki sudut Km/Vmax, perpotongan garis
terhadap sumbu y sebesar 1/Vmax (pada sumbu 1/V0) dan perpotongan -1/Km pada sumbu 1/[S].
Grafik pemetaan Lineweaver-Burk dijelaskan dalam Gambar II.2 berikut.

Gambar II.2 Kurva Linewiever-Burk (Suhartono, 1989)

Persamaan Michaelis-Menten dapat juga diturunkan menjadi persamaan Hanes-Woolf

yang dapat memberikan nilai 𝑉𝑚𝑎𝑥 yang lebih akurat. Adapun penurunan persamaan Michaelis-
Menten menjadi persamaan Hanes-Woolf adalah sebagai berikut.

1 Km 1 1
= +
V0 Vmax [S] V0

V (K m + [s]) = Vmax [S]

[S] K m + [S]
=
V Vmax

[S] Km 1
= + . [S]
V Vmax Vmax

Grafik pemetaan persamaan Hanes-Woolf ditunjukkan pada Gambar II.3 berikut.

 Gambar II.3. Kurva Persamaan Hanes-Woolf (Shuler and Kargi,1992)

II.3 Selulosa

Selulosa tersusun atas D-glukosa yang terikat melalui ikatan β(1→4). Selulosa adalah
polimer yang tidak bercabang yang terdiri dari 100-14.000 monosakarida atau lebih. Ikatan
β(1→4) tidak dapat diputuskan oleh enzim α-amilase (Lehninger,1997). Selulosa bersifat
kristalin, tidak mudah larut di dalam air, dan biasanya berasosiasi dengan polisakarida lain
seperti hemiselulosa atau lignin membentuk kerangka utama dinding sel tumbuhan. Struktur
dari selulosa ditunjukkan oleh gambar II.4 berikut.

Gambar II.4 Struktur Selulosa (Zugenmaier, 2008)

II.4 Enzim Selulase

Enzim selulase termasuk ke dalam enzim ekstraseluler yaitu enzim yang akan bekerja
di luar sel untuk mendegradasi senyawa polimer. Enzim ini akan menguraikan selulosa menjadi
glukosa. Menurut Chasanah (2013), untuk menghidrolisis selulosa diperlukan 3 komponen
enzim sebagai berikut.

a. Ekso- 𝛽-(1,4)-glukanase berfungsi untuk menghidrolisis selulosa dalam bentuk

kristal menjadi selulosa amorf
b. Endo- 𝛽-(1,4)-glukanase berfungsi untuk menghidrolisis ikatan 𝛽-(1,4)-glukosida
pada selulosa amorf menjadi selobiosa
 c. 𝛽-(1,4)-glukosidase berfungsi untuk menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa.

Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase dapat dilihat dalam gambar II.5 berikut.

Gambar II.5 Mekanisme hidrolisis selulosa melalui enzim selulase (Chasanah, 2013)

II.5 Metode DNS

DNS atau dinitrosalicylic acid merupakan senyawa aromatis yang akan bereaksi
dengan gula reduksi yang membentuk asam 3-amino-5-dinitrosalisilat yang merupakan
senyawa yang mampu menyerap kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada panjang
gelombang 540 nm. Reaksi antara gula reduksi dengan DNS merupakan reaksi redoks pada
gugus aldehid dan teroksidasi menjadi gugus karboksil. Bila terdapat gula reduksi dalam
sampel, maka larutan DNS yang awalnya berwarna kuning akan berubah menjadi warna jingga
kemerahan. Semakin tinggi intensitas warna DNS maka jumlah gula yang tereduksi semakin
banyak (Rasul, 2015). Reaksi Glukosa dengan DNS ditunjukkan oleh gambar II.6 berikut.

Gambar II.6 Reaksi Glukosa dengan DNS

 BAB III
LANGKAH-LANGKAH PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini adalah sebagai berikut:
Tabel III.1 Daftar alat yang digunakan
No. Alat Ukuran Jumlah (buah)
1 Gelas kimia 100 mL 4
500 mL 4
1000 mL 1
2000 mL 1
2 Mikropipet 100-1000 μL 2
3 Tip 1 mL 36
4 Mikrotube 1,5 mL 48
5 Kuvet 8
6 Termometer 2
7 Hot plate 2
8 Pipet volume 10 mL 1
9 Stopwatch 2
10 Tabung reaksi 24
11 Penjepit tabung 2
12 Alat sentrifugal 1
13 Spektrometer UV-Vis 1
14 Pipet tetes 2
15 Kaca arloji 2
16 pH meter 1
17 Magnetic stirrer 2
18 Batang pengaduk 2
19 Gelas ukur 25 mL 2
1000 mL 1
20 Pinset 2
21 Spatula 2

Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah sebagai berikut:
Tabel III.2 Daftar bahan yang digunakan
No. Bahan Jumlah
1 Aquadest Secukupnya
2 DNS 1,497 g
3 NaOH 68 g
4 Garam Rochelle 43,22 g
5 Asam sitrat anhidrat 140 g
6 Enzim selulase 2 mL
7 Kertas saring whatman 4 gram
8 Glukosa 0,5 g
9 Air keran Secukupnya
III.2 Tahapan-Tahapan Percobaan
Reaksi enzimatis substrat selulosa dengan pengambilan sampel setiap 10 menit mulai
dari t=0 menit sampai t=60 menit. Reaksi enzim dilakukan tanpa inhibitor.
III.2.1. Pembuatan Larutan Buffer
Larutan buffer digunakan untuk pembuatan larutan standar dan pengujian aktivitas
enzim selulase. Adapun langkah pembuatannya dijelaskan pada diagram alir di bawah ini:

Mulai

210 gram asam sitrat

monohidrat di dalam gelas kimia

Dimasukkan 750 mL absorben

Ditambahkan padatan NaOH

bertahap hingga pH 4,8

Diperiksa pH dengan pH meter

Disimpan pada wadah (botol) tertutup Larutan buffer

Selesai

III.2.2. Pembuatan Reagen DNS

Reagen DNS ditambahkan sebelum pengukuran absorbansi. Reagen DNS berguna
untuk pengujian aktivitas enzim selulasedan reaksi enzimatis tanpa inhibitor. Pembuatan
reagen DNS dapat dilakukan seperti langkah-langkah di bawah ini:

Mulai

5,3 g DNS + 9,9 g NaOH + 153 g Garam Rochelle

Dimasukkan ke dalam gelas kimia

.
A
 A

Ditambahkan 60 mL aquades

Dihomogenkan

Disimpan pada wadah (botol) tertutup Reagen DNS

Selesai

III.2.3. Pembuatan Kurva Baku Glukosa

III.2.3.1. Pembuatan Larutan Baku/Larutan Induk

Pada pembuatan kurva baku glukosa dibutuhkan larutan induk. Larutan induk
digunakan untuk pembuatan larutan standar. Langkah-langkah pembuatan larutan induk
adalah sebagai berikut:

Mulai

0,5 g glukosa di dalam gelas kimia

Dimasukkan 50 mL aquades

Dihomogenkan larutan

Larutan induk glukosa Larutan induk

glukosa

Selesai

III.2.3.1. Pembuatan Larutan Standar

Larutan standar digunakan untuk pembuatan kurva baku glukosa dengan data yang
diperoleh yaitu data absorbansi. Langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut:
 Mulai

1 mL larutan 1 mL larutan 1 mL larutan 1 mL larutan 1 mL larutan 1 mL larutan

induk I induk II induk III induk IV induk V induk V
dalam tabung dalam tabung dalam tabung dalam tabung dalam tabung dalam tabung
reaksi reaksi reaksi reaksi reaksi reaksi

Ditambah 0,5 Ditambah 1 Ditambah 2 Ditambah 4 Ditambah 6 Ditambah 8

mL buffer mL buffer mL buffer mL buffer mL buffer mL buffer

Dimasukkan 1 mL sitrat dan 50

mL substrat (kertas Whatman)

Diinkubasi selama 1 jam, T=50℃

Ditambahkan 3 mL DNS

Dipindahkan campuran ke penangas air 100℃ selama 5 menit

Disentrifugasi campuran selama 5 menit, 3000 rpm

Diambil supernatan 200 mL

Data
Diperiksa absorbansi dengan UV-Vis, λ=540 nm (duplo)
absorbansi

Dibuat kurva baku dengan

X=konsentrasi glukosa
Y=absorbansi (R²≥0,95)

Dianalisis data

Selesai
III.2.4. Pengujian Aktivitas Enzim Selulase

III.2.4.1. Pembuatan Larutan Stok Enzim

Saat pengujian aktivitas enzim selulase dibutuhkan larutan enzim yang dapat dibuat
melalui cara-cara berikut:

Mulai

19 mL buffer sitrat pH 4,8 di dalam gelas kimia

Ditambahkan 1 mL enzim selulase

Dihomogenkan Larutan stok enzim

Selesai

III.2.4.2. Variasi Pengenceran Stok Enzim

Hal ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim selulase. Langkah-langkah yang
dilakukan adalah sebagai berikut:

Mulai

(Pengenceran 1) (Pengenceran 2) (Pengenceran 3) (Pengenceran 4) (Pengenceran 2)

1650 μL buffer 1700 μL buffer 1800 μL buffer 1850 μL buffer 1900 μL buffer
sitrat dalam sitrat dalam sitrat dalam sitrat dalam sitrat dalam
tabung reaksi tabung reaksi tabung reaksi tabung reaksi tabung reaksi

Ditambah Ditambah Ditambah Ditambah Ditambah

350 μL buffer 300 μL buffer 200 μL buffer 150 μL buffer 100 μL buffer

A
 A

Diinkubasi pada penangas air 50℃ selama 10 menit

Ditambah 1 mL buffer sitrat

Dipindahkan ke 3 tabung reaksi (masing-masing larutan)

lalu ditambahkan substrat (kertas Whatman 30 mg)

Diinkubasi selama 1 jam pada T=50℃

Ditambahkan 3 mL DNS

Dipindahkan campuran ke penangas air 100℃ selama 5 menit

Disentrifugasi selama 5 menit (3000 rpm)

Diambil supernatan 200 mL

Data
Diperiksa absorbansi dengan UV-Vis, λ=540 nm
absorbansi

Dihitung aktivitas enzim selulase menggunakan FPU

Dianalisis data

Selesai
III.2.5. Reaksi Enzimatis tanpa Inhibitor

Reaksi enzimatis tanpa inhibitor dapat dilakukan dengan cara di bawah ini yaitu:

Mulai

1 g selulosa (kertas whatman) dalam

gelas kimia 250 mL+90 mL buffer

Dipanaskan campuran pada penangas

air selama 50℃ selama 10 menit

Ditambahkan enzim selulase

Dipindahkan ke tabung reaksi

Diinkubasi pada penangas air 50℃,

sambil dihomogenkan dengan
magnetic stirrer selama 10 menit

Diambil secukupnya (2mL) sampel

setiap 0,10,20,30,40,50,60 menit

Dipanaskan sampel dengan penangas

air selama 100℃ selama 5 menit

Dicampurkan 1 mL sampel dengan 3 mL DNS

Dipanaskan sampel dengan penangas

air selama 100℃ selama 5 menit

Didinginkan campuran dengan air

mengalir (15 menit) / ice bath 5 menit

A
 A

Disentrifugasi selama 5 menit (3000 rpm)

Data
Diperiksa absorbansi dengan UV-Vis, λ=540 nm
absorbansi

Dihitung konsentrasi glukosa

pada kurva baku glukosa

Dianalisis data

Selesai
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam praktikum ini, praktikan memperoleh hasil berupa kurva baku glukosa, kurva
Michaelis-Menten, kurva Linewaveburk dan kurva Hanes-Woolf. Serta ditentukan nilai Filter
Paper Unit (FPU), V0, Km, Vmax dan %yield.

IV.1 Pembuatan Kurva Baku Glukosa

Kurva baku glukosa dibuat dengan memplot konsentrasi glukosa yang telah diketahui
(sumbu y) dan absorbansi (sumbu x). Melalui kurva baku glukosa dapat diperoleh persamaan
kurva baku glukosa. Persamaan ini dapat digunakan untuk mengkonversi absorbansi menjadi
konsentrasi glukosa. Melalui praktikum diperoleh persamaan kurva baku glukosa y = 0,019x
+ 0,021.
y = 0,0199x + 0,021
0,18 R² = 0,92
0,16
0,14
Absorbansi

0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 2 4 6 8
Konsentrasi glukosa (mg/ml)

Gambar IV.1 Kurva baku glukosa

IV.2 Penentuan Nilai FPU (Filter Paper Unit)

FPU merupakan unit aktivitas enzim selulase. Nilai FPU dapat didefinisikan sebagai
kuantitas enzim yang digunakan untuk menghasilkan 2 mg glukosa dari substrat dengan berat
50 mg kertas saring Whatman No.1. Untuk menentukan nilai FPU, dilakukan plot antara dilusi
enzim terhadap data konsentrasi glukosa.
 0,01

0,008

0,006

konsentrasi enzim
0,004

0,002

0
0 1 2 3 4 5 6 7
konsentrasi glukosa (mg/0,5 ml)

Gambar IV.2 Grafik penentuan FPU

Melalui grafik penetuan nilai FPU diatas diperoleh bahwa factor dilusi enzim yang diperlukan
untuk menghasilkan 2 mg glukosa/0.5 ml larutan adalah 0,004. Setelah mensubstitusi nilai
faktor dilusi enzim diperoleh nilai FPU sebesar 92.5 unit/ml.

IV.3. Penentuan Nilai Kecepatan Awal (Vo)

Dalam menentukan nilai kecepatan awal (V0) dari sebuah reaksi enzimatis, terlebih
dahulu dilakukan plot antara konsentrasi produk terhadap waktu. Melalui bagian grafik yang
linear ditentukan d[P] dan dt. Nilai V0 diperoleh dengan mensubstitusikan nilai d[P] dan dt ke
persamaan :
𝑑[𝑃]
V0 =
𝑑𝑡

Gambar IV.3 Grafik perubahan konsentrasi produk terhadap waktu untuk konsentrasi substrat
50 mg
Gambar IV.4 Grafik perubahan konsentrasi produk terhadap waktu untuk konsentrasi substrat
100 mg

Gambar IV.5 Grafik perubahan konsentrasi produk terhadap waktu untuk konsentrasi substrat
150 mg

Contoh perhitungan dapat dilihat pada di lampiran B2. Nilai d[P], dt dan V 0 untuk konsentrasi
substrat 50,100, dan 150 mg dapat diliat pada tabel dibawah ini.

Tabel IV.1 Nilai d[P], dt dan V0 untuk konsentrasi substrat 50,100, dan 150 mg
[S](mg) d[P] Dt V0 (mg/menit)
50 10,52 20 0,526
100 5,369 10 0,537
150 8,272 15,2 0,544

Berdasarkan Tabel IV.1 dapat disimpulkan bahwa nilai V 0 (Initial rate) meningkat seiring
dengan bertambahnya konsentrasi substrat. Hal ini sesuai dengan hukum Michaelis Menten
yang menyatakan bahwa kecepatan reaksi berbanding lurus terhadap konsentrasi substrat pada
saat konsentrasi substrat rendah.

IV.4. Penentuan Nilai Vmax dan Km

Vmax merupakan kecepatan maksimum yang dapat dicapai enzim. Sedangkan Km
merupakan konsentrasi substrat saat setengah kecepatan maksimum. Km menyatakan seberapa
erat pengikatan enzim oleh substrat. Dalam penentuan nilai Vmax dan Km digunakan
persamaan Michaelis Menten serta nilai V0 masing-masing konsentrasi substrat.

𝑉𝑚𝑎𝑥.[𝑠]
V0 =
𝐾𝑚+[𝑠]

Persamaan Michaelis Menten untuk konsentrasi substrat 50 mg :

𝑉𝑚𝑎𝑥.[𝑠]
V0 =
𝐾𝑚+[𝑠]

𝑉𝑚𝑎𝑥.50 𝑚𝑔
0,526 mg/menit =
𝐾𝑚+50 𝑚𝑔

0,526 mg/menit Km + 26,3 mg2/menit = 50 mg.Vmax ............................. (1)

Persamaan Michaelis Menten untuk konsentrasi substrat 100 mg :

𝑉𝑚𝑎𝑥.[𝑠]
V0 =
𝐾𝑚+[𝑠]

𝑉𝑚𝑎𝑥.100 𝑚𝑔
0,537 mg/menit =
𝐾𝑚+100 𝑚𝑔

0,537 mg/menit Km + 53,7 mg2/menit = 100 mg.Vmax ............................ (2)

Melalui eliminasi dan substitusi persamaan 1 dan 2 diperoleh nilai Km sebesar 2,136 mg dan
Vmax = 0,548 mg/menit. Dengan mensubstitusikan nilai Km dan Vmax ke persamaan
Michaelis Menten diperoleh persamaan untuk kecepatan reaksi enzimatis enzim selulase yaitu
:

0,548.[𝑠]
V0 = ........................................................ (3)
2,136+[𝑠]
IV.5. Penentuan Kurva Michaelis Menten
Untuk membuat kurva Michaelis Menten, dipilih beberapa konsentrasi substrat yaitu
25, 50, 75, 100, 125 dan 150 mg. Kemudian data konsentrasi substrat di substitusikan ke
persamaan kecepatan reaksi enzim selulase maka diperoleh nilai kecepatan untuk masing-
masing konsentrasi substrat yang dipilih. Data konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzim
dapat dilihat dalam tabel dibawah ini.

Tabel IV.2 Data konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatis

[S] (mg) V (mg/menit)

25 0.504864
50 0.525549
75 0.532825
100 0.53654
125 0.538793
150 0.540306

Dilakukan plot antara konsentrasi substrat (sumbu x) dan kecepatan reaksi (sumbu y). Sehingga
dihasilkan kurva Michaelis Menten seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini.

0,55
Kecepatan (mg/menit)

0,54
0,53
0,52
0,51
0,5
0 50 100 150 200
Konsentrasi substrat (mg)

Gambar IV.6 Kurva Michaelis Menten untuk enzim selulase

IV.6. Penentuan Kurva Linewaver-Burk

Untuk membuat Kurva Linewaver-Burk dibutuhkan data 1/V dan 1/[S]. Dengan
menggunakan pada tabel IV.2 dapat diperoleh nilai 1/V dan 1/[S] yang dapat dilihat pada tabel
dibawah ini.
 Tabel IV.3 Data 1/konsentrasi substrat dan 1/kecepatan

1/[S] (1/mg) 1/V (menit/mg)

0.04 1.98073
0.02 1.902774
0.013333 1.876788
0.01 1.863796
0.008 1.856
0.006667 1.850803

Dilakukan plot antara 1/konsentrasi substrat (sumbu x) dan 1/kecepatan reaksi (sumbu y).
Sehingga dihasilkan kurva Linewaver-Burk seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini.

2
1/Kecepatan (menit/mg)

1,98
1,96
1,94
1,92
1,9
1,88
1,86
1,84
0 0,02 0,04 0,06
1/Konsentrasi substrat(1/mg)

Gambar IV.7 Kurva Linewaver-Burk untuk enzim selulase

Bentuk kurva Lineweaver-Burk yang diperoleh tidak sesuai dengan bentuk kurva
Lineweaver-Burk pada literatur. Kesalahan ini terjadi karena ketidakakuratan saat menentukan
posisi linear pada grafik, yang digunakan untuk menentukan nilai d[P] dan dt. Hal ini
menyebabkan nilai Vo yang dihasilkan kurang tepat. Nilai Vo digunakan untuk mencari nilai
Km. Nilai Vo dan Km digunakan untuk menentukan persamaan Vo untuk enzim selulase. Nilai
Vm dan Km yang tidak tepat menyebabkan ketidakakuratan pada persamaan kecepatan yang
diperoleh. Dalam pembuatan kurva Lineweaver-Burk pada gambar di atas dipilih beberapa
konsentrasi substrat yaitu 25, 50, 75, 100, 125, dan 150 mg. Persamaan kecepatan digunakan
untuk mencari nilai kecepatan untuk masing-masing konsentrasi substrat. Ketidakakuratan
pada persamaan kecepatan tersebut menyebabkan nilai kecepatan yang diperoleh tidak akurat.
Nilai konsentrasi substrat dan kecepatan tersebut digunakan untuk plot kurva Lineweaver-
Burk. Nilai kecepatan yang tidak akurat menyebabkan kurva Lineweaver-Burk yang dihasilkan
tidak sesuai dengan literatur.
IV.7. Penentuan Kurva Hanes-Woolf
Metode Hanes Woolf digunakan untuk menentukan nilai Km dan Vmax. Kurva Hanes
Woolf dibuat melalui plot antara [S]/V (sumbu y) dan [S] (sumbu x). Melalui data [S] dan V
pada tabel IV.3.1 diperoleh data [S]/V dan [S] yang dapat dilihat pada tabel IV.7.1.

Tabel IV.4 Data konsentrasi substrat/kecepatan dan konsentrasi substrat

[S]/V (menit) [S](mg)

95.05703 50
186.2197 100
275.7353 150

Dengan menggunakan data pada tabel IV.4 dihasilkan kurva Hanes-Woolf seperti yang
terlihat pada gambar dibawah ini.

160
substrat/kecepatan(menit)

140 y = 0,5535x - 2,7603

120 R² = 1
Konsentrasi

100
80
60 Series1
40
20
0
0 100 200 300
Konsentrasi subsrat(mg)

Gambar IV.8 Kurva Hanes-Woolf untuk enzim selulase

Melalui grafik Hanes-Woolf diperoleh persamaan y = 0,553x - 2,760. Nilai persamaan

ini dihubungkan dengan persamaan Hanes-Woolf :

1 𝐾𝑚 1 1
𝑉0
=
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥
.

1
= -2,760
𝑉𝑚𝑎𝑥

Vmax = -0,3623

𝐾𝑚
=0,553
𝑉𝑚𝑎𝑥
 𝐾𝑚
=0,553
−0,3623

Km= -0,2004

Sehingga dihasilkan nilai Vmax sebesar 1,808 mg/menit dan nilai Km sebesar -4,99
mg. Hasil ini tidak sesuai dengan nilai Vmax dan Km yang diperoleh pada sub bab IV.4 yaitu
Vmax sebesar 0,548 mg/menit dan Km sebesar 2,136 mg. Penyimpangan ini mungkin terjadi
karena dalam mencari nilai Km dan Vmax pada sub bab IV.4 hanya mempergunakan data dari
substrat 50 m dan 100 mg. Sedangkan penghitungan Km dan Vmax dengan Hanes Woolf
mempergunakan data dari substrat 50 mg, 100 mg dan 150 mg. Hasil dari Hanes Woolf lebih
akurat karena mempertimbangkan data dari ketiga konsentrasi substrat.

IV.8. Penentuan Yield

Yield atau rendemen dalam praktikum ini dinyatakan sebagai P/S, yaitu jumlah glukosa
yang terbentuk (dalam satuan massa) terhadap jumlah selulosa yang terkonversi. Contoh
perhitungan untuk yield dapat dilihat di lampiran B.5. Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh
yield untuk konsentrasi substrat 50, 100, dan 150 mg secara berurutan adalah 75,77%, 29,7%
dan 20,5%.
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan
Dari hasil percobaan yang telah dilakukan maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
• Diperoleh kurva baku glukosa dengan persamaan linear y = 0,0199x + 0,021 dengan R²
= 0,92
• Diperoleh nilai FPU enzim selulase sebesar 92,5 unit/mL
• Diperoleh nilai V₀ untuk konsentrasi substrat 50 mg, 100 mg, dan 150 mg masing –
masing sebesar 0,526; 0,537; dan 0,544 mg/menit
• Diperoleh nilai Vm enzim selulase sebesar 0,548 mg/menit dan nilai Km sebesar 2,136
mg
0,548.[𝑠]
• Diperoleh persamaan untuk V₀ enzim selulase yaitu V₀ = 2,136+[𝑠]

• Diperoleh kurva Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, dan Hanes-Woolf

• Dilakukan analisis dengan Hanes-Woolf dan diperoleh nilai Vmax sebesar -0,3623
mg/menit dan Km sebesar -0,2004 mg
• Dari hasil perhitungan % yield dapat disimpulkan bahwa reaksi enzim dengan selulase
paling baik dilakukan dengan konsentrasi selulosa 50 mg karena % yield yang diperoleh
paling tinggi yaitu 75,77%

V.2 Saran
Adapun saran yang perlu diperhatikan adalah:

• Sebaiknya praktikum mensentrifugasi lebih lama sehingga diperoleh supernatan yang

murni (tidak terdapat endapan) maka kesalahan dalam pengukuran absorbansi lebih
kecil
• Pembuatan larutan yang digunakan dalam praktikum harus lebih akurat agar
konsentrasi setiap larutan yang diinginkan sesuai dengan yang diharapkan
• Praktikan harus mampu memperkirakan jumlah larutan yang dibutuhkan agar bahan
yang dibutuhkan untuk praktikum cukup
• Saat praktikum disarankan bagi praktikan untuk membuat larutan buffer baru dan
ditempatkan pada wadah yang baru dan berisih
 DAFTAR PUSTAKA

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & L, L. S. (2003). Biochemistry (5 ed.). New York, USA:
Freeman Company.
Chasanah, E., Dini, I. R., & Mubarik, N. R. (2013). Karakterisasi Enzim Selulase PMP
0126Y dari Limbah Pengolahan Agar.
Copeland, R. A. (2000). Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and
Data Analysis (2 ed.). Canada: Wiley-VCH.
J, P., & CAP, M. (2007). Industrial enzymes: structure, function, and applications.
Lehninger, A. L. (1997). Dasar - Dasar Biokimia (I ed.). Jakarta: Erlangga.
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2013). Lehninger: Principles of Biochemistry (6 ed.). New
York, USA: Freeman Company.
Shuler, M. L., & Kargi, F. (1992). Bioprocess Engineering. USA: Prentice Hall Inc.
Suhartono, M. T. (1989). Enzim dan Bioteknologi. Bogor: IPB Press.
Zugenmaier, P. (2008). Crystalline Cellulose and Derivatives. Jerman: Springer-Verlag.
 LAMPIRAN A
DATA LITERATUR

A.1 Kondisi Optimum Enzim Selulase

Adapun kondisi optimum kerja enzim selulase adalah: (Ghose, 1987)
Suhu optimum : 50oC
pH optimum : 5,16
 LAMPIRAN B
CONTOH PERHITUNGAN

B.1 Perhitungan Filter Paper Unit (FPU)

Filter Paper Unit (FPU) merupakan besaran aktivitas enzim selulase yang dapat
ditentukan menggunakan rumus sebagai berikut:
0,37
Filter Paper Activity = units/mL
[𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚]𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑚𝑒𝑛𝑔ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙𝑘𝑎𝑛 2,0 𝑚𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎

Untuk aktivitas enzimatis :

0,37
Filter Paper Activity= = 92,5 unit/mL
0,004

B.2 Perhitungan Vo

Pada reaksi enzimatis dengan konsentrasi substrat 50 mg diperoleh nilai d[P] sebesar
10,52 mg dan dt sebesar 20 menit maka ditentukan nilai V0 untuk konsentrasi substrat 50 mg :

𝑑[𝑃]
V0 =
𝑑𝑡
10,52 𝑚𝑔
V0 =
20 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡

V0= 0,526 mg/menit

B.3 Perhitungan Vmax dan Km

𝑉𝑚𝑎𝑥.[𝑠]
Digunakan persamaan Michaelis Menten V0 = . Dicari persamaan V0 dengan
𝐾𝑚+[𝑠]

menggunakan nilai V0 untuk konsentrasi substrat 50 mg dan 100 mg.

Persamaan Michaelis Menten untuk konsentrasi substrat 50 mg :

𝑉𝑚𝑎𝑥.[𝑠]
V0 =
𝐾𝑚+[𝑠]

𝑉𝑚𝑎𝑥.50 𝑚𝑔
0,526 mg/menit =
𝐾𝑚+50 𝑚𝑔

0,526 mg/menit Km + 26,3 mg2/menit = 50 mg.Vmax ............................. (1)

Persamaan Michaelis Menten untuk konsentrasi substrat 100 mg :

𝑉𝑚𝑎𝑥.[𝑠]
V0 =
𝐾𝑚+[𝑠]
 𝑉𝑚𝑎𝑥.100 𝑚𝑔
0,537 mg/menit =
𝐾𝑚+100 𝑚𝑔

0,537 mg/menit Km + 53,7 mg2/menit = 100 mg.Vmax .............................. (2)

Melalui eliminasi dan substitusi persamaan 1 dan 2 diperoleh nilai Km sebesar 2,136 mg dan
Vmax = 0,548 mg/menit. Kedua nilai tersebut disubstitusi persamaan V0 sehingga diperoleh:

0,548.[𝑠]
V0 = ......................................................... (3)
2,136+[𝑠]

B.4 Pembuatan Kurva Michaelis Menten, Linewaver-burk, Hanes-Woolf

Dalam pembuatan Kurva Michaelis Menten, Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf

diperlukan data [S] dan V0. Dipilih konsentrasi substrat 25, 50, 75, 100, 125 dan 150 mg.
Kemudian nilai konsentrasi tersebut disubstitusikan ke persamaan V 0 sehingga diperoleh nilai
V0 untuk masing-masing konsentrasi.

V0 untuk konsentrasi substrat 25 mg:

0,548 . [𝑠]
V0 =
2,136+[𝑠]

0,548 . 25
V0 =
2,136+25

V0 = 0,5048 mg/menit

B.5 Perhitungan yield

%Yield untuk konsentrasi substrat 100 mg

Substrat terkonversi = 0.97 x 100 mg = 97 mg

Produk yang terbentuk setelah 60 menit = 29.7017 mg

28,8107𝑚𝑔
%Yield = 𝑥 100% = 29.7017%
97 𝑚𝑔
 LAMPIRAN C
KURVA KALIBRASI

C.1 Kurva Baku Glukosa

y = 0,0199x + 0,021
0,18 R² = 0,92
0,16
0,14
Absorbansi

0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 2 4 6 8
Konsentrasi glukosa (mg/ml)

Gambar C.1 Kurva Baku Glukosa

 LAMPIRAN D
DATA MENTAH

D.1 Tekanan dan Temperatur Laboratorium

Tabel D.1 Tekanan dan temperatur laboratorium masuk

Tanggal P (mmHg) T (oC)

11 Maret 2019 71 ± 0,05 24,5 ± 0,5
12 Maret 2019 71 ± 0,05 24,5 ± 0,5

Tabel D.2 Tekanan dan temperatur laboratorium keluar

Tanggal P (mmHg) T (oC)

11 Maret 2019 71 ± 0,05 24,5 ± 0,5
12 Maret 2019 71 ± 0,05 24,5 ± 0,5

D.2 Data Kurva Baku Glukosa

Tabel D.3 Data Kurva Baku Glukosa

Konsentrasi Absorbansi Absorbansi Absorbansi

(mg/ ml) 1 2 rata rata
6,667 0,142 0,163 0,152
5 0,098 0,130 0,114
3,333 0,086 0,100 0,093
2 0,065 0,090 0,078
1,428 0,045 0,065 0,055
1,111 0,025 0,019 0,022

D.3 Data FPU

Tabel D.4 Data FPU

Data FPU
Absorbansi Konsentrasi enzim Konsentrasi glukosa
0,772 0,00875 6,289782245
0,576 0,0075 4,648241206
0,372 0,005 2,939698492
0,25 0,00375 1,917922948
0,12 0,0025 0,829145729
D.4 Data Reaksi Enzimatis untuk Substrat 50 mg

Tabel D.5 Data Reaksi Enzimatis untuk Substrat 50 mg

Absorbansi Konsentrasi Konsentrasi
Waktu(menit) Rata produk produk
I II
rata (mg/ml) (mg)
0 0.047 0.051 0.049 1.40703518 1.876046901
10 0.056 0.066 0.061 2.01005025 2.680067002
20 0.155 0.125 0.14 5.9798995 7.97319933
30 0.213 0.311 0.262 12.1105528 16.14740369
40 0.492 0.472 0.482 23.1658291 30.88777219
50 0.555 0.615 0.585 28.3417085 37.78894472
60 0.623 0.516 0.57 27.5628141 36.75041876

D.5 Data Reaksi Enzimatis untuk Substrat 100 mg

Tabel D.6 Data Reaksi Enzimatis untuk Substrat 100 mg

Waktu(menit) Absorbansi konsentrasi konsentrasi
Rata produk produk
I II
rata mg/ml (mg)
0 0.134 0.002 0.068 2.361809045 3.149078727
10 0.183 0.113 0.148 6.381909548 8.50921273
20 0.111 0.138 0.1245 5.201005025 6.934673367
30 0.123 0.235 0.179 7.939698492 10.58626466
40 0.321 0.358 0.3395 16.00502513 21.3400335
50 0.451 0.325 0.388 18.44221106 24.58961474
60 0.511 0.391 0.451 21.6080402 28.81072027

D.6 Data Reaksi Enzimatis untuk Substrat 150 mg

Tabel D.7 Data Reaksi Enzimatis untuk Substrat 150 mg

Waktu(menit) Absorbansi Konsentrasi konsentrasi

I II Rata produk produk
rata (mg/ml) (mg)
0 0.079 0.052 0.066 2.2361809 2.981574539
10 0.112 0.125 0.119 4.89949749 6.532663317
20 0.312 0.111 0.212 9.57286432 12.7638191
30 0.421 0.455 0.438 20.9547739 27.93969849
40 0.521 0.012 0.267 12.3366834 16.44891122
50 0.176 0.625 0.401 19.0703518 25.42713568
60 0.611 0.325 0.468 22.4623116 29.94974874