LAPORAN PRAKTIKUM

ENZIMOLOGI

ACARA PRAKTIKUM KE: 10

PENENTUAN NILAI KM

Nama : Imam Arifin

NIM : 24020219120015

Kelompok :1

Hari, tanggal : Senin, 30 November 2020

Asisten : Romario Dion

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

2020
 ACARA X
PENENTUAN NILAI KM

I. Tujuan
Mahasiswa mampu menentukan nilai Km dan Vmaks dari enzim amilase
II. Tinjauan Pustaka
2.1. Nilai KM
Konstanta Michaelis-menten merupakan parameter dalam kinetika
reaksi enzim. Hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi
enzimatik dinyatakan sebagai KM (tetapan Michaelis-Menten). Nilai KM
merupakan konsentrasi substrat yang dibutuhkan oleh suatu enzim agar
menghasilkan kecepatan reaksi setengah dari kecepatan maksimumnya (V 0 =
1/2 Vmaks) penguraian atau reaksi katalisasi lain yang disebut velocity (V).
Kecepatan reaksi (V) yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya
konsentrasi substrat [S], hingga dicapai keadaan dimana penambahan
konsentrasi substrat [S] tidak lagi meningkatkan laju awal reaksi dan bila
semua enzim dalam keadaan jenuh oleh substrat [ES] maka laju reaksi akan
mencapai keadaan maksimum (Vmaks). Konsentrasi substrat mempengaruhi
kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Pada konsentrasi substrat yang
amat rendah, kecepatan reaksipun amat rendah, tetapi kecepatan ini akan
meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Pada batas kecepatan
maksimum (Vmaks), enzim menjadi jenuh oleh substratnya, dan tidak dapat
berfungsi lebih cepat. Guna mengendalikan aktivitas enzim dalam proses
desizing, maka perlu dipahami kemampuan enzim sebagai katalis dengan
pengujian kinetika enzim (Noviendri, et al. 2008)
2.2. Laju Reaksi Enzim Maksimal (Vmaks)
Vmaks adalah kecepatan maksimum enzim dalam menghidrolisis
substrat mewakili laju maksimum yang diterima sistem pada konsentrasi
substrat jenuh. Sedangkan Km adalah konsentrasi substrat yang separuh dari
lokasi aktifnya telah terisi, yaitu bila kecepatan reaksi enzim telah mencapai ½
Vmaks. Kinetika hidrolisis secara enzimatis dipelajari untuk mengetahui Vmaks
dan Km dari enzim selulase yang digunakan. Selain itu tahap praperlakuan
sampel juga dilakukan agar hidrolisis lebih optimal. Nilai KM dapat
 digunakan afinitas enzim substrat (E-S) yang merupakan suatu indikator
kekuatan ikatan kompleks E-S. Selain digunakan sebagai ukuran
keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjadi E dan S. Apabila nilai Km
kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap substrat tinggi,
sedangkan bila nilai Km besar afinitasnya menajdi rendah. Harga Km enzim
sangat tergantung dari jenis substrat, lingkungan turunannya (Putra, 2009).
2.3. Hubungan konsentrasi substrat dengan aktivitas enzim
Konsentrasi substrat dapat mempengaruhi kecepatan reaksi enzim.
Semakin tinggi nilai substrat maka semakin cepat suatu reaksi. Meskipun
begitu, laju reaksi enzimatik akan mencapai titik konstan dimana konsentrasi
substrat sampai pada titik jenuh. Hal ini dikarenakan kompleks ES sudah
mencapat pada titik yang maksimal. Hubungan konsentrasi substrat dengan
reaksi menggambarkan afinitas enzim terhadap substrat menggunakan nilai
KM. Semakin besar nilai KM menunjukkan semakin kecil afinitas enzim
terhadap substrat, sebaliknya jika semakin kecil nilai KM maka afinitas enzim
terhadap substrat semakin besar (Putra, 2009).
2.4. Line-Weaver Burk

Lineweaver-Burk dari data kinetik menghasilkan suatu garis lurus dan

suatu lereng = KM/Vmaks dan pintasan 1/[S] dan 1/V masing – masing = -1/KM
dan 1/Vmaks. Plot ini mempunyai keuntungan karena tidak perlu mengukur v pada
konsentrasi substrat yang sangat tinggi karena [S] dapat diramalkan
kemungkinannya dari nilai 1/[S] = 0. Plot ini menyediakan metode grafis yang
berguna untuk analisis persamaan Michaelis-Menten, karena sulit untuk
menentukan secara tepat Vmax dari reaksi yang dikatalisis oleh enzim:

1) 2)

dimana V adalah kecepatan reaksi (laju reaksi), Km adalah konstanta Michaelis-

Menten, Vmax adalah kecepatan reaksi maksimum, dan [S] adalah konsentrasi
substrat (Srinivasan, 2020).
III. Metode
3.1 Alat
1. spektrofotometer UV-Vis
2. mesin stenter
3. timbangan digital
4. gelas piala 250 ml
5. gelas ukur 100 ml
6. pipet tetes
7. pipet volume 10 ml
8. pipet volume 1 ml
9. labu ukur 100 ml
10. labu ukur 25 ml
11. pengaduk

3.2 Bahan
1. Enzim α- Amilase (aquazym 240l)
2. 0,25 mL/L Buffer Fosfat
3. 0,25 mL/L NaCl : 0,25 mL/L
4. Air Suling : x ml/L
5. Kanji 2 % : 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL/L
6. Reagen DNS : 1 mL/L

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Membuat Larutan Standar
1. Buatlah larutan glukosa dengan konsentrasi 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50
mg, 60 mg, sebanyak 50 ml.
2. Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 ml.
3. Tambahkan DNS 1,5 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37ᵒC selama 5 menit.
4. Didinginkan dengan air mengalir.
5. Diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm.
6. Hasil absorbansi dibuat kurva standar, sehingga menghasilkan persamaan
linier.
3.3.2 Uji Kecepatan reaksi enzimatik
1. Siapkan larutan kanji 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, sebanyak
50 ml aquades.
2. Siapkan larutan enzim α-amilase dengan konsentrasi tertentu dalam buffer
fosfat pH 6,9
3. Ambil sebanyak 1 ml larutan kanji 0,5%, masukkan ke dalam tabung reaksi
baru lalu tambahkan sebanyak 0,5 ml enzim α-amilase.
4. Inkubasi selama 10 menit pada suhu 37°C. Lakukan reaksi di atas untuk
larutan substrat tanpa enzim.
5. Setelah inkubasi selama 10 menit, reaksi dihentikan dengan menambahkan 2
ml pereaksi asam dinitrosalisilat (DNS) ke dalam tabung reaksi tadi.
6. Kemudian panaskan campuran reaksi tadi menggunakan penangas selama 5
menit.
7. Ukur nilai absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540.
IV. Hasil
Berdasarkan jurnal yang berjudul STUDI KINETIKA REAKSI DARI ENZIM α-
AMILASE PADA PROSES PENGHILANGAN KANJI KAIN KAPAS oleh
Puspitasari, et al. (2019), bahwa hasil pengamatan sebagai berikut:

Gambar 1. Grafik Lineaweaver Burk

Persamaan garis linier Lineaweaver Burk (y= bx + a) dari penelitian ini adalah
y = 16,676x + 1,8791, dari pengalihan persamaan Michaelis Menten (1/V =
[(Km/Vmaks)(1/S)+ 1/Vmaks). Persamaan tersebut menunjukkan bahwa nilai a =
1/Vmaks dan nilai b = Km/ Vmaks, didapat nilai Vmaks sebesar 0,53217 mg/menit
dan nilai Km 8,874461.
V. Pembahasan
Praktikum Enzimologi Acara ke IX yang berjudul “Penentuan Nilai KM”
memiliki tujuan mampu menentukan nilai Km dan Vmaks dari enzim amilase, Praktikum ini
dilaksanakan secara daring menggunakan aplikasi Ms. Teams Pada Senin, 30 November
2020.
5.1 Enzim Amilase
Amilase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis pati menjadi
oligosakardia dan monosakarida. Hal ini sesuai dengan pendapat Wang
(2009), bahwa Amilase (Alpha-amylase) adalah enzim yang mengkatalisis
hidrolisis dari alpha-1, 4- glikosidik amilosa pati menghasilkan glukosa
(dekstrin, oligosakardia, maltose, dan D-glukosa.
Enzim ini terdapat pada tubuh yaitu pada sistem pencernaan pada
pancreas dan kelenjar ludah. Hal ini sesuai dengan pendapat Wang (2009),
bahwa Enzim ini terletak pada kelenjar ludah dan pancreas sehingga
merupakan enzim pencernaan. Selain dari hewan babi enzim ini dapat berasal
dari jamur dan tanaman. Contohnya malt barley dan jamur Aspergillus oryzae.
Enzim ini dapat menghidrolisis pati dikarenakan enzim ini memiliki gugus
karboksil yang dapat berikatan dengan gugus karbon 1 pada pati (glukosidik).
Kemudian kelompok imidazol memisahkan komponen air pada posisi C. Hal
ini sesuai dengan pendapat Ariandi (2016), bahwa Enzim α-amilase memiliki
gugus karboksil dan nitrogen pada sisi aktifnya. Substrat membentuk komplek
adsorpsi dengan enzim dimana posisi ikatan glukosidik dalam posisi saling
berhadapan dengan gugus karboksil dan kelompok imidazol. Karboksil anion
menyerang bagian nukleofil C (1) dari substrat yang bertujuan untuk
menetralkan rantai ion amidazol. Pada reaksi deglukosilasi, kelompok
imidazol menjadi dasar untuk memisahkan komponen air pada posisi C.
5.2 Konstanta Michaelis-Menten
Konstanta Michaelis-Menten (KM) merupakan nilai konsentrasi
substrat yang menduduki enzim yang dapat membuat laju reaksi enzimatik ½
dari laju maksimalnya (Vmaks). Hal ini sesuai dengan pendapat Anam (2010),
bahwa konstanta Michaelis-menten merupakan parameter dalam kinetika
reaksi enzim. Hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi
enzimatik dinyatakan sebagai KM (tetapan Michaelis-Menten).
 Dalam uji terhadap enzim, data mengenai KM pada suatu enzim
diperlukan untuk mengetahui tingkat afinitas enzim terhadap substrat. Menurut
Putra (2009), bahwa Nilai KM dapat digunakan afinitas enzim substrat (E-S)
yang merupakan suatu indikator kekuatan ikatan kompleks E-S. Selain
digunakan sebagai ukuran keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjadi E
dan S.
Percobaan ini dilakukan pembuatan larutan standard dan sampel
dengan menggunakan variasi konsentrasi substrat, yaitu masing-masing pada
konsentrasi substrat 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg dan 70 mg.
Banyaknya kanji yang dapat dikonversi oleh enzim per satuan waktu, dideteksi
oleh reagen DNS karena ujung gugus pereduksi tersebut mampu mereduksi
asam dinitrosalisilat yang berwarna kuning menjadi spesi pereduksinya
berwarna jingga. Hal ini sesuai dengan pendapat (Sonia dan Joni, 2015),
bahwa penggunaan metode DNS bertujuan untuk menghitung jumlah gula
pereduksi yang mampu menyerap cahaya sebagai indicator aktivitas enzim.
Nilai absorbansi merupakan nilai seberapa banyak materi yang dapat
menyerap cahaya dengan panjang gelombang tertentu. Semakin tinggi
absorbansinya maka semakin tinggi konsentrasi gula pereduksi yang
terkandung di dalam suatu larutan. Absorbansi Kadar glukosa murni yang
terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva standar glukosa. Setelah 10
menit, dilakukan spektrofotometri terhadap sampel dan standar pada panjang
gelombang 540nm. Hasil hubungan konsentrasi substrat dengan kecepatan
reaksi digambar pada grafik Lineaweaver Burk untuk dilakukan perhitungan
nilai KM dan Vmaks.
5.3 Penentuan nilai laju maksimum (Vmaks) dan nilai Konstanta Michaelis-
Menten (KM)
Pengukuran absorbansi gula pereduksi yang dihasilkan oleh reaksi
enzimatik didapat nilai molekul yang dapat dihidrolisis yang merupakan laju
reaksi pada suatu konsentrasi. Penentuan nilai Vmaks dan KM adalah
berdasarkan rumus persamaan garis linier Lineaweaver Burk (y = bx + a) dari
penelitian ini adalah y = 16,676x + 1,8791, dari pengalihan persamaan
Michaelis Menten (1/V = [(Km/Vmaks)(1/S)+ 1/Vmaks). Persamaan tersebut
menunjukkan bahwa nilai a = 1/Vmaks dan nilai b = Km/ Vmaks, sehingga
didapat nilai Vmaks sebesar 0,53217 mg/menit dan nilai Km 8,874461. Nilai
KM enzim α-Amilase yang diuji cukup besar artinya enzim mempunyai
afinitas yang rendah terhadap substrat kanji. Hal ini sesuai dengan pendapat
Putra (2009), bahwa Nilai KM dapat digunakan afinitas enzim substrat (E-S)
yang merupakan suatu indikator kekuatan ikatan kompleks E-S.
VI. Kesimpulan
Berdasarkan pengamatan nilai KM dan Vmaks suatu enzim didapat dari perhitungan
data pada grafik Lineweaver burk. Berdasarkan grafik Lineweaver Burk hasil uji afinitas
enzim α- Amilase, dapat diketahui nilai KM enzim α- Amilase adalah 8,874461 dan
Vmaks 0,53217 mg/menit.
VII. DAFTAR PUSTAKA
Anam, Khairul.(2010). Kinetika Reaksi Enzimatis. Bioteknologi. IPB.
Ariandi. 2016. Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi Enzimatisnya
Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa. Jurnal Dinamika. Vol. 07. No.
1
Nguyen HQ, Quyen DT, Nguyen SLT, Vu VH (2015) an extracellular antifungal
chitinase from Lecanicillium lecanii: purification, properties, and application
in biocontrol against plant pathogenic fungi. Turk J Biol 39:6-14.Doi:
10.3906/biy-1402-28
Noviendri D, Fawzya YN, Chasanah E (2008) Karakteristik dan sifat kinetika enzim
kitinase dari isolat bakteri T5a1 asal terasi. J Pasca panen Bioteknol Kelautan
dan Perikanan 3:123-129.
Putra, G. G. 2009. Penentuan Kinetika enzim Poligalakturonase (PG) Endogenous
dari Pulp biji Kakao. Jurnal biologi: 13 (1): 21-24.
Srinivasan, B. 2020. Words of advice: teaching enzyme kinetics. FEBS Press Journal,
Cambridge.
Sonia, N. M. O., Joni, K. 2015. ISOLASI DAN KARAKTERISASI PARSIAL
ENZIM SELULASE DARI ISOLAT BAKTERI OS-16 ASAL PADANG
PASIR TENGGER-BROMO. Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 4
p.11-19
Wang, Nam Sun. 2009. Experiment no. 5: Starch Hydrolysis by Amylase. Department
of Chemical & Biomolecular Engineering. University of Maryland
 LEMBAR PENGESAHAN

Mengetahui, Semarang, Desember 2020

Asisten Praktikan

Romario Dion Imam Arifin

(24020218140033) (24020219120015)