Protein Mga

Merupakan protein pengikat DNA yang mengaktifkan ekspresi beberapa gen virulensi
Streptococcus pyogenes (grup A Streptococcus, GAS) dalam menanggapi perubahan
kondisi lingkungan. Mga adalah regulator yang jangkauannya luas, memengaruhi ekspresi
gen lebih dari 10 % genom S. Pyogenes.

Maltose Binding Protein (MBP)

MBP merupakan protein umum penanda ekspresi. Penggabungan protein target ke MBP
membolehkan pemurniannya dengan hanya satu langkah purifikasi menggunakan resin
amilosa. Selain itu di E. coli, MBP diketahui secara signifikan meningkatkan kelarutan
banyak protein yang telah digabungkan. pMAL TM (trademark dari New England Biolabs, Inc)
fusi protein and sistem purifikasi membuat peneliti dapat menggunakan E.coli untuk
membuat fusi antara target protein yang diekspresikan dengan MBP dan purifikasi protein
fusi dengan satu langkah. Gen yang diinginkan diklon ke vektor hilir pMAL dari gen malE
yang mengodekan MBP. Promoter Ptac dan sinyal translasi inisiasi MBP mengontrol
ekspresi gen. Selama induksi, sistem ini menggabungkan target protein sekuens dengan
seporsi MBP untuk membuat protein fusi yang diisolasi menggunakan kromatografi afinitas
amilosa. Vektor pMAL yang berbeda membuat protein fusi dapat disekresikan ke periplasma
atau diproduksi dalam sitoplasma, dan setiap vektor memicu pembelahan protease antara
MBP dan protein target untuk memfasilitasi pembuangan tanda.

Gambar proses fusi MBP dengan protein target

Kromatografi Afinitas
Kromatografi afinitas merupakan teknik pemisahan dan pemurnian sebagian besar molekul
biologi berdasarkan susunan kimia molekul tersebut. Dasar pemisahan pada kromatografi
afinitas adalah pengikatan molekul protein yang mempunyai afinitas spesifik dengan ligan
tertentu. Teknik ini berdasarkan interaksi yang spesifik antar material biologi misalnya
enzim-substrat, enzim-inhibitor, antigen-antibodi dan sebagainya (Standbury & Whitaker
1984). Molekul yang dimurnikan akan teradsorb oleh ligan yang teramobilisasi pada matrik.
Ikatan yang terjadi antara protein dan ligan tersebut biasanya merupakan ikatan multivalen.

Gambar proses pemurnian dengan Kromatografi Afinitas

SDS-PAGE
Prinsip metode ini adalah mirasi komponen akrilamida dengan N.N bisakrilamida. Kisi-kisi
tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid
dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein.
Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein selain untuk
memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker, 2000). SDS-PAGE dilakukan terhadap
protein tak larut dengan kekuatan ion rendah dan dapat menentukan apakah suatu protein
termasuk monomerik atau oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai
polipeptida sebagai subunit atau monomer.
Penggunaan SDS-PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada protein yang
akan dianalisis. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah
yang setara dengan berat molekulprotein tersebut (Dunn,1989). Denaturasi protein
dilakukan dengan mendidihkan sampel dalam buffer yang mengandung -merkaptoetanol,
gliserol dan SDS (Wilson dan Walker, 2000). Muatan asli protein akan digantikan dengan
muatan negatif dari anion yang terikat sehingga kompleks protein SDS memiliki rasio
muatan per berat molekul yang konstan (Hames,1987).
Sampel-sampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna dengan
bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk membantu memonitor
jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf
protein dengan protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,
2000).

Gambar proses SDS-PAGE

Sonikasi
Sonikasi adalah suatu cara penerapan energi ultrasuara untuk memisahkan partikel-partikel
yang menempel dalam sampel yang akan disonikasi. Ultrasuara yang digunakan dalam
sonikasi merupakan tekanan suara siklik dengan frekuensi yang lebih besar dari pada batas
teratas pendengaran manusia. Sonikasi dapat digunakan untuk mempercepat pemisahan
partikel dalam sampel, dengan cara memecah interaksi antarmolekul. Sonikasi juga dapat
berfungsi untuk menghilangkan gas-gas terlarut dari cairan sampel dengan cara
mensonikasi cairan tersebut dalam keadaan vakum. Prinsip kerjanya adalah sonikator
mengubah sinyal listrik menjadi getaran mekanis yang dapat diarahkan menuju suatu zat
yang dilakukan untuk memecahkan ikatan antar molekul atau untuk merusak sel. Getaran
yang dihasilkan dapat memecah bagian molekul dan merusak sel. Bagian utama dari
sonikator adalah generator listrik ultrasonik. Alat ini menghasilkan sinyal (sekitar 20 KHz)
yang menghidupkan transduktor. Transduktor kemudian mengkonversi sinyal elektrik degan
menggunakan kristal piezoelectric, yaitu kristal yang dapat merespon listrik dengan
menghasilkan getaran mekanis. Getaran tesebut dijaga oleh sonikator hingga melewati
probe. Probe sonikator berperan dalam menyampaikan getaran pada cairan yang disonikasi.
Pergerakan probe yang terjadi dengan cepat menghasilkan efek kavitasi yang terjadi ketika
terbentuk gelembung-gelembung mikroskopis dalam larutan akibat adanya getaran.
Pembentukan dan penghancuran gelembung tersebut menghasilkan gelombang getaran
berenergi tinggi yang dapat merusak sel (Lacoma, 2009).

Gambar alat sonikator

Sentrifugasi
Metode ini digunakan untuk mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya
sentrifugasi pada partikel-partikelnya.
Prinsip sentrifugasi didasarkan atas fenomena bahwa partikel yang tersuspensi di dalam
suatu wadah akan mengendap ke dasar wadah karena pengaruh garvitasi. Laju
pengendapan tersebut dapat ditingkatkan dengan cara meningkatkan pengaruh
gravitasional terhadap partikel. Hal ini dapat dilakukan dengan menempatkan tabung berisi
suspensi partikel ke dalam rotor suatu mesin sentrifugasi kemudian diputar dengan
kecepatan tinggi.

Kecepatan proses pengendapan suatu partikel atau molekul yang disentrifugasi dipengaruhi
oleh dua macam faktor yaitu berat molekulnya yang semakin tinggi nilainya maka
kecepatannya juga semakin tinggi dan bentuk partikelnya (Yuwono, 2007).

Proses Purifikasi Protein Fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes

Proses yang dilakukan untuk mempurifikasi protein fusi MBP-Mga S. Pyogenes secara
umum adalah

Overproduksi protein MBP-Mga

Pemurnian Protein Fusi Mbp-Mga dengan Teknik Kromatografi Afinitas

Overproduksi Protein MBP-Mga

Pada medium LB (tripton 1% b/v, ekstrak ragi 0,5% b/v, NaCl 1% b/v dalam
aquades) bakteri Eschericia coli yang mengandung plasmid pMALMga ditanam. Setelah itu
dilakukan induksi dengan penambahan 0,3 mM IPTG (Isopropil--D-tiogalaktosida)
selama 2 jam agar terjadi overproduksi protein fusi MBP-Mga rekombinan. Sel kemudian
disentrifugasi dan ditambah bufer sodium-tris-etilendiamintetraasetat (NaCl 5 M, EDTA 0,5
M,Tris-HCl 1 M), diresuspensi dan disentrifugasi kembali sebanyak dua kali. Dilakukan
sonikator agar pelet sel lisis dan dilakukan sentrifugasi kembali pada kecepatan tinggi untuk
memisahkan protein dari debris sel. Protein yang diambil berasal dari supernatan yang
dihasilkan.
Bakteri E.coli ditanam di medium LB

Sel diinduksi selama dua jam dengan

penambahan 0,3 mM IPTG

Sel disentrifugasi + ditambah buffer

sodium-tris-etilendiamintetraasetat
Sel diresuspesi & disentrifugasi dua kali

Sel disonikasi & disentrifugasi pada

kecepatan tinggi
Protein diambil dari supernatan

Diagram alir proses overproduksi sel

Pemurnian Protein Fusi MBP-Mga

Pemurnian dilakukan dengan teknik kromatografi afinitas menggunakan kolom resin
amilosa. Penggunaan amilosa sebagai ligan dapat dilakukan karena MBP (Maltose Binding
Protein) dapat berikatan secara spesifik dengan maltosa sebagai dimer pada amilosa.
Pemurnian terhadap protein ekstrak kasar E.coli pMALMga hasil overekspresi dilakukan
masing-masing 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100 x volume
kolom. Dalam setiap proses pemurnian, setelah dicuci dengan bufer pencuci dilanjutkan
dengan elusi menggunakan bufer pengelusi untuk mendapatkan protein fusi MBP-Mga
murni. Pada penelitian ini bufer pengelusi mengandung maltosa. Maltosa ini berfungsi untuk
memutuskan ikatan antara protein fusi MBP-Mga dengan amilosa. Jadi, maltosa ini dapat
berkompetisi tempat dengan ligan terikat (amilosa), sehingga protein fusi MBP-Mga lepas
dan selanjutnya keluar bersama eluen. Eluen hasil elusi ini ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Fraksi yang diambil setiap kali pemurnian adalah 10 fraksi, dengan volume tiap fraksi adalah
1,5 ml. Fraksi hasil elusi dimonitor dengan pengamatan absorbansi pada panjang
gelombang 280 nm.
Protein fusi yang dihasilkan diinkubasi selama 1-2 jam
di kolom amilosa
Kolom dicuci oleh buffer (Tris.Cl 20 mM pH 7,4,
NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, dan
EDTA 1 mM) 100 x volume kolom dengan 4 x
pengulangan
Protein dicampur degan buffer elusi (Tris.Cl 20 mM
pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM,
EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM)
Setiap 1,5 ml hasil elusi diamati dengan
spektrofotometer UV-Vis dengan =280 nm
Diagram alir proses pemurnian protein fusi MBP-Mga

Hasil pengukuran fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan
buffer pencuci 100 X volume kolom dengan empat kali pengulangan adalah sebagai berikut.

Pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian 3 ml protein ekstrak kasar E.coli pMALMga
dengan buffer pencuci 100 X volume kolom. Tabel a. (1,897 g/ml), b. (1,890 g/ml), c. (1,901 g/ml), d. (1,898
g/ml).

Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 100X
volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai kelima. Puncak pada grafik serapan yang
dihasilkan tergantung pada kuat lemahnya buffer pengelusi memutuskan ikatan antara
amilosa dengan protein fusi MBP-Mga. Puncak yang melebar akan dihasilkan juka bufer
pengelusi kurang kuat memutuskan ikatan. Volume matriks juga memengaruhi lebarnya
puncak karena kandungan ligan yang ada juga semakin banyak.
Analisis SDS-PAGE dilakukan untuk melihat hasil pemurnian dengan kolom resin
amilosa. Protein yang digunakan sebagai pembanding terhadap protein MBP-Mga murni
hasil pemurnian adalah protein marker, dan protein ekstrak kasar E.coli pMALMga yang
diinduksi selama 2 jam dengan IPTG 0,3 mM dalam medium LB yang mengandung 0,2%
glukosa. Elektroforegram sampel protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian memberikan satu
pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa, untuk yang dicuci dengan bufer pencuci
100X volume kolom.

Elektroforegram protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan buffer pencuci 100 x volume kolom