LAPORAN PRAKTIKUM KROMATOGRAFI

ANALISIS ASAM AMINO DENGAN KCKT

( KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI )

Disusun Oleh :
Nama : Ennita Lusiana Sinaga
NPM : 062118050
Hari/tanggal : Kamis, 20 Mei 2021

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGTAHUAN
UNIVERSITAS PAKUAN
BOGOR
2021
 1. Tujuan Percobaan
Tujuan percobaan pada praktikum ini adalah untuk mengidentifikasi dan menganalisis asam
amino dengan teknik kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

2. Tinjauan Pustaka
Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50%
atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein
juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein,
baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi,
dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen
dalam urutan yang khas (Lehninger, 1982).
Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang
memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini
dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat
merangkai ke-20 asam amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan
protein yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme
yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon,
lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya (Lehninger, 1982).
Asam amino adalah sembarang senyawa organik yang memiliki gugus fungsional
karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali pengertiannya
dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut atom C
"alfa" atau α). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan
sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi
asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena
asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang
paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme,
yaitu sebagai penyusun protein (Poedijadi & Supryanti, 2009).
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan
enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan
untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu
diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).
 Jika protein dimasak dengan asam atau basa kuat, asam amino unit pembangunnya
dibebaskan dari ikatan kovalen yang menghubungkan molekul-molekul ini menjadi rantai. Asam
amino bebas yang terbentuk merupakan molekul yang relatif kecil, dan struktur masing-masing
telah diketahui. Asam amino yang pertama kali ditemukan adalah aspargin, pada tahun 1806 dan
yang paling terakhir adalah treonin, yang belum teridentifikasi sampai tahun 1983 (Lehninger,
1982).
Semua asam amino mempunyai nama biasa atau umum, yang kadang-kadang diturunkan
dari sumber pertama nama molekul ini diisolasi. Semua asam amino yang ditemukan pada
protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan gugus amino diikiat pada atom karbon
yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada rantai sampingnya, atau gugus
R, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan di dalam air (Lehninger,
1982).
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri,
mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh
pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi
kertas, krometografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994). Kromatografi
melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang
dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam
berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stasioner)
dan fase gerak (fase mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase
diam, dan fse diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-
beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua
jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan denganpompa melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkanke dari gumaliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam
kolom terjadipemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuataninteraksi antara
salut-salut terhadap fase diam akan keluar dari kolomlebih dahulu dan sebaliknya. Setiap
komponen campuran yang keluardari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam
bentukkromatogram. Senyawa yang keluar dari dari kolom atas dasarkepolaran yang berbeda
akan mempengaruhi kekuatan.
 HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan darikebutuhan, keinginan manusia
untuk meminimalis pekerjaan,kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu
pengembanganpada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modernbahwa LC
(Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahanyang sangat ampuh, bahkan untuk
komponen-komponen yangberhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan
kecepatannya,diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yanglebih kecil, waktu
elusi yang beberapa jam (Underwood, 2002).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa jugadisebut dengan HPLC
(Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an.Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secaraluas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatusampel dalam sebidang, antara lain :
farmasi, lingkungan,bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa
perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT,penggunaan KCKT untuk
analisis asam-asam nukleat, analisisprotein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa
kiral(Rohman, 2013).
Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatucairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media porustersebut, yang berupa partikel- partikel yang ”diam“ (tidak
bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen daricampuran tersebut akan
terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak(bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda (differential migration) dandengan demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebutpada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilahpemisahan
diantara komponen-komponen yang ada (Hendayana,2006).

3. Alat dan Bahan

Alat – alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah kromatografi cair jinerja tinggi,
computer dalam mengolah data, pipet tetes, labu ukur, Erlenmeyer, timbangan analitik, kertas
saring 0,45 mikro meter, sonikator, botol akuadest dan injector. Sedangkan bahan – bahan yang
digunakan dalam percobaan ini adalah methanol, asam amino, asam asetat glasial dan akuadest.
Sampel yang dianalisis : asam amino arginine, lisyn, dan histidin
Fase gerak yang digunakan : campuran dari asam asetat glasial : methanol
 4. Prosedure Kerja
a. persiapan sampel dan fase gerak
untuk sampel dapat ditimbang sejumlah tertentu dan dilarutkan dalam fase gerak
menggunakan labu ukur. Sedangkan untuk fase geraknya disaring terlebuh dahulu dengan
penyaring nilon dengan ukuran porinya adalah 0,45 mikro meter. Setelah itu disonikasi dengan
sonikator. Setelah itu fase gerak sudah bisa dimasukkan kedalam reservoir fase gerak yang ada
didalam alat KCKT.
b. Pengoptimalisasian KCKT
Seelum digunakan KCKT harus terebih dahulu dikondisikan terhadap ketentuan ketentuan
yang sudah disepakati sebelumnya. Yaitu: harus diatur pompanya dengan aliran permenit dari
fase geraknya yang diatur pada bagian tamrau 1,5, ml/menit, diatur komposisi dari fase gerak
pada bagian solvency contrentation, lalu klik download dan klik ok untuk menyimpan hasil
pengaturan. Komponen lain yang harus diatur adalah detector ultraviolet, dinyalakn dengan cara
klik bagian lamp dan pilih 2. Diatur panjng gelombang pada 254 nm lalu diklik download.
c. Injeksi sampel
Untuk injeksi sampel, diklik proseccing lalu dinamai terlebih dahulu sampelnya, dan dipilih
method sesuai dengan metode yang disetting sebelumnya. Diatur volume injeksinya yaitu 20
mikroliter. Lalu diklik start untuk memulai injeksi sampel. Setelah muncul perintah untuk
memasukkan sampel, maka siapkan sampel dan diambil dnegan menggunakan speed injeksi.
Lalu masukkan atau suntikkan sampel pada bagian injector pada KCKT secara perlahan. Maka
otomatis alat akan membaca sampel yang sudah diinjeksikan. Lalu ditunggu sampai terbentuk
data atau gambar puncak dari sampel yang dianalisis.

5. Data dan Pengamatan

Perhitungan konsentrasi dan % asam amino :
luas puncak sampel
1. Konsentrasi asam amino : x 0,5 µmol/ml x Vtera
luas puncak standard
µ mol asam amino x Mr asamamino
2. % Asam Amino : x 100
µ gram sampel
Perhitungan 3 sampel jenis asam amino
a. Arginine
luas puncak sampel
Konsentrasi arginine : x 0,5 µmol/ml x Vtera
luas puncak standard
22008489
: x 0,5 µmol/ml x 100 ml
31932116
: 34, 4613 µmol/ Asam amino
µ mol asam amino x Mr asamamino
% Asam Amino : x 100
µ gram sampel

34,4613 x 174,2
: x 100
40.000 µg
: 0, 1501 %
b. Lysine
luas puncak sampel
Konsentrasi lysine : x 0,5 µmol/ml x Vtera
luas puncak standard
12353460
: x 0,5 µmol/ml x 100 ml
36132759
: 17,0945 µmol/ Asam amino
µ mol asam amino x Mr asamamino
% Asam Amino : x 100
µ gram sampel
17,0945 x 146,19
: x 100
40.000 µg
: 0,06247 %
c. Histidin
luas puncak sampel
Konsentrasi histidine : x 0,5 µmol/ml x Vtera
luas puncak standard
7044686
: x 0,5 µmol/ml x 100 ml
36059293
: 9,7681 µmol/ Asam amino
µ mol asam amino x Mr asamamino
% Asam Amino : x 100
µ gram sampel
9,7681 x 55,16
: x 100
40.000 µg
: 0,03789 %
 6. Pembahasan
Pada percobaan dalam praktikum kali ini adalah tentang kromatografi cair kinerja tinggi
dengan tujuan menganalisis asam amino yaitu menentukan konsentrasi dan kadar asam amino
dam sebuah sampel. Asam amino adalah sembarang senyawa organik yang memiliki
gugus fungsional karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Kromatografi yang
digunakan pada pengukuran ini adalah kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT merupakan
tekhnik pemisahan yang diterima secaraluas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu
dalam suatusampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan,bioteknologi, polimer dan
industri-industri makanan. Fungsi dari HPLC atau KCKT adalah untuk mengukur senyawa –
senyawa kualitatif dan kuantitatif.
Prinsip pada analisis dengan menggunakan KCKT adalah adsorpsi dan partisi. Adsorpsi yaitu
penyerapan senyawa – senyawa menggunakan fase diam, dimana kemampuan suatu senyawa
untuk terikat pada siliaka gel dan partisi yaitu pemisahan berdasarkan polaritas menggunakan
fase gerak. Sampel yang akan dianalisis pada percobaan ini adalah asam amino jenis histidin,
lysine, arginine. Adapun fase gerak yang digunakan adalah methanol ; asam asetat glasial.
Campuran atau eluen ini mmiliki sifat polar, sedangkan senyawa asam amino yang dianalisis
bersifat non polar.
Langkah pertama yang dilakukan adal persiapan sampel dan pelarut. Sampel dapat ditimbang
sejumlah tertentu dan dilarutkan dalam fase gerak menggunakan labu ukur. Sedangkan untuk
fase geraknya disaring terlebuh dahulu dengan penyaring nilon dengan ukuran porinya adalah
0,45 mikro meter. Tujuan penyaringan ini adalah agar senyawa lebih homogeny sehingga lebih
mudah dianalisis. Setelah itu disonikasi dengan sonikator untuk mengirimkan gelembung udara
yang ada didalam fase gerak. Setelah itu fase gerak sudah bisa dimasukkan kedalam reservoir
fase gerak yang ada didalam alat KCKT. Sampel yang akan dimasukkan juga harus disarng
terlebih dahulu untuk bisa siap diinjeksikan kedalam KCKT.
Seelum digunakan KCKT harus terebih dahulu dikondisikan terhadap ketentuan ketentuan
yang sudah disepakati sebelumnya. Diatur komposisi dari fase gerak pada bagian solvency
contrentation, lalu klik download dan klik ok untuk menyimpan hasil pengaturan. Komponen
lain yang harus diatur adalah detector ultraviolet, dinyalakn dengan cara klik bagian lamp dan
pilih 2. Diatur panjng gelombang pada 254 nm lalu diklik download. Ini dilakukan agar data
yang dihasilakn lebih akurat, sehingga KCKT harus dioptimalakn terlebih dahulu.
Langkah selanjutnya yang bisa dilakukan adalah Injeksi sampel , Untuk injeksi sampel,
diklik proseccing lalu dinamai terlebih dahulu sampelnya, dan dipilih method sesuai dengan
metode yang disetting sebelumnya. Diatur volume injeksinya yaitu 20 mikroliter. Lalu diklik
start untuk memulai injeksi sampel. Setelah muncul perintah untuk memasukkan sampel, maka
siapkan sampel dan diambil dnegan menggunakan speed injeksi. Lalu masukkan atau suntikkan
sampel pada bagian injector pada KCKT secara perlahan. Maka otomatis alat akan membaca
sampel yang sudah diinjeksikan. Lalu ditunggu sampai terbentuk data atau gambar puncak dari
sampel yang dianalisis.
Pada percobaan ini ada 3 jenis asam amino yang diuji. Perhitunga ini dilihat dari
kromatogram yang dihasilkan oleh kromatografi cair kinerja tinggi tersebut. Pada percobaan ini,
yang ditentukan adalah konsentrasi asam amino dan kadar asam amino yang terkandung dalam
sampel. Luas pucak sampel dilihat pada kromatogram, sedangkan luas puncak standard dapat
dilihat pada tabel data luas puncak asam amino. Asam amino jenis lysine memiliki konsentrasi
17,0945 µmol/ Asam amino dengan kadar 0,06247 %, asam amino jenis arginine memiliki
konsentrasi 34, 4613 µmol/ Asam amino dengan kadar 0,1501 %, sedangkan asam amino jenis
histidin memiliki konsentrasi 9,7681 µmol/ Asam amino dengan kadar 0,3789% dengan
perhitungan tertera pada data pngamatan.

7. Kesimpulan
Setelah melakukan percobaan pada praktikum ini dapat disimpulakn bahwa, kromatografi
cair kinerja tinggi dapat digunakan dalam analisis kualitatif maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif disini adalah penetapan kadar dan mengukur kemurnian suatu campuran. Pada
percobaan ini digunakan untuk mengukur kadar dan konsentasi dari 3 jenis asam amino yaitu
lysine, arginine, dan histidin. Asam amino jenis lysine memiliki konsentrasi 17,0945 µmol/
Asam amino dengan kadar 0,06247 %, asam amino jenis arginine memiliki konsentrasi 34, 4613
µmol/ Asam amino dengan kadar 0,1501 %, sedangkan asam amino jenis histidin memiliki
konsentrasi 9,7681 µmol/ Asam amino dengan kadar 0,3789%.
 8. Daftar Pustaka
Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, Hipokrates, Jakarta.

Lehninger, A.L., Dasar-Dasar Biokimia, Penerbit Erlangga, Jakarta

Poedjiadi A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, UI Press, Jakarta.

Poedjiadi, A. dan F. M. T. Supriyanti., 2009, Dasar-dasar Biokimia, Penerbit Universitas

Indonesia, Jakarta,

Hendayana, Sumar., 2006, KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi danElektroforensis

Modern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung.

Lestari, Wahyuni Sri, 2014, Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskirendalam Plasma darah

secara In Vitro Menggunakan KromatografiCair Kinerja Tinggi (KCKT). UIN Syarif

Hidayatullah: Jakarta

Rohman, Abdul., 2013, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka Pelajar : Jakarta