bios logika

more than "bios"

▼
Sabtu, 15 November 2014
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA : NURUL MAGFIRAH SUKRI

NIM : H41113328
KELOMPOK : I (SATU) C
HARI/TANGGAL : KAMIS/22 OKTOBER 2014
ASISTEN : AFMI PURWANTI

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

 Dewasa ini, ada empat perkembangan besar yaitu kromatografi pertukaran ion diakhir
tahun 1930-an, kromatografi partisi di tahun 1941, kromatografi gas di tahun 1952 dan
kromatografi filtrasi-gel di tahun 1959. Disamping berbagai kemajuan besar tersebut, yang
memberikan mekanisme tambahan terhadap adsorpsi untuk penyebaran zat terlarut antara
fasa-fasa diam dan bergerak, telah ada juga modifikasi dalam geometri sistem
kromatografi, seperti dalam kromatografi kertas dan lapis tipis.
Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga gugus yang reaktif
pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus rantai samping. Ketiga gugus
ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan melalui tes
ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi
kimianya, asam amino dapat pula diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa
metode, salah satunya adalah melalui kromatografi lapis tipis (KLT).
Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner adalah suatu lembaran
tipis silika gel. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fase
pelarut, dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan
pelarut tertentu. Perbandingan kecepatan pemindahan komponen dengan permukaan fasa mobile
merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu
melalui percobaan ini akan dilakukan pemisahan dan identifikasi asam amino dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis.
1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
1.1.1 1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara pemisahan dan identifikasi asam
amino dalam suatu sampel dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dilakukannya percobaan ini yaitu:
1. Menghitung nilai Rf dari asam amino Asparagin, Tirosin, dan sampel x.
2. Mengidentifikasi asam amino dari larutan sampel melalui metode kromatografi lapis tipis.

1.3 Prinsip Percobaan

Pemisahan asam amino secara kromatografi menggunakan lapis tipis atau plat kromatografi lapis
tipis yang fase gerakannya dengan menggunakan eluen yang terdiri atas campuran n-butanol,
asam asetat dan air. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan jarak noda yang dihasilkan
setelah penyemprotan dengan ninhidrin serta membandingkan nilai Rf dari asam amino.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50%
atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga
amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik
yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi,
dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen dalam
urutan yang khas (Lehninger, 1982).
Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang
memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat
dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai
ke-20 asam amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein yang
mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme yang berbeda
dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa protein
pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya (Lehninger, 1982).
Asam amino adalah sembarang senyawa organik yang memiliki gugus fungsional
karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali pengertiannya
dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut atom C
"alfa" atau α). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan
sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam
pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam
amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling
banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme, yaitu
sebagai penyusun protein (Poedijadi & Supryanti, 2009).
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan
enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan
untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan
pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).
Jika protein dimasak dengan asam atau basa kuat, asam amino unit pembangunnya
dibebaskan dari ikatan kovalen yang menghubungkan molekul-molekul ini menjadi rantai. Asam
amino bebas yang terbentuk merupakan molekul yang relatif kecil, dan struktur masing-masing
telah diketahui. Asam amino yang pertama kali ditemukan adalah aspargin, pada tahun 1806 dan
yang paling terakhir adalah treonin, yang belum teridentifikasi sampai tahun 1983 (Lehninger,
1982).
Semua asam amino mempunyai nama biasa atau umum, yang kadang-kadang diturunkan dari
sumber pertama nama molekul ini diisolasi. Semua asam amino yang ditemukan pada protein
mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan gugus amino diikiat pada atom karbon yang
sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada rantai sampingnya, atau gugus R, yang
bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan di dalam air (Lehninger, 1982).
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri,
mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh
pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi
kertas, krometografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).
Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan-perbedaan
tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan
dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase
stasioner) dan fase gerak (fase mobile). Fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui
fase diam, dan fse diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-
beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis
kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).
Menurut Akbar (2011), Macam-macam kromatografi :
1. Kromatografi Lapis Tipis yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau
alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya.
Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan
kromatografi.
2. Kromatografi Penukar Ion merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti
namanya, sistem ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat
penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah
jarangdan asam amino.
3. Kromatografi Penyaringan Gel merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari
modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat
menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul
berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan
dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan
polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas
ialah karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebig tinggi, dan
dapat dilaksanakan denga lebih cepat. Banyak pemisahan yang memakan waktu berjam-jam bila
dikerjakan dengan kromatografi kertas, tetapi dapat dilaksanakan hanya beberapa menit saja bila
dikerjakan dengan TLC (Adnan, 1997).
Kelebihan dari kromatografi lapis tipis yang lain ialah pemakaian pelarut dan cuplikan yang
jumlahnya sedikit, kemungkinan penotolan cuplikan berganda (saling membandingkan langsung
cuplikan praktis) dan tersedianya beberapa metode (Gritter, 1991).
Pemurnian FRY dan reaksinya, hasil ari FAOD diletakkan di RP-18 plat KLT yang terdiri dari
n-butanol, asam asetat dan air (4 : 1 : 5). Pemurnian FRY dideteksi oleh ninhidrin (noda ungu).
Dugaan bahwa FRY terdiri dari gula dan amina termasuk asam amino. Pada substrat FAOD, valin
menunjukkan karakter yang sama pada KLT. Ketika permunian dalam inkubator dengan FAOD,
noda ungu muncul (Akbar, 2011).
Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi partisi yaitu pemisahan
beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur.
Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam
amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan
kemudian ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan
proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino
yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih
jauh dari pada yang sukar larut. Setelah mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari
pelarut dan dibiarkan mengering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam
amino akan terpisah satu sama lainnya, dan dengan penyemprotan dengan pereaksi
ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang
membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatua asam
amino tertentu (b) dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari garis awal sampai
garis akhir (a) diberi lambang Rf (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Uji Ninhidrin terjadi apabila ninhidrin dipanaskan bersama asam amino maka akan terbentuk
kompleks berwarna. Asam amino dapat ditentukan secara kuntitatif dengan jalan menggunakan
intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi
ini dilepaskan CO2 dan NH4 sehingga asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan
mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan warna
kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainnya. Kompleks berwarna yang
terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan ammonia yang dilepaskan
pada oksidasi asam amino. Hasil uji positif pada uji ninhidrin diberikan pada asam amino yang
mengandung asam α-amino dan peptida yang memiliki gugus α-amino yang bebas (Akbar, 2011).

BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah Eluen (n-butanol : asam asetat : air = 2,5 :
0,6 : 2,6 v/v, larutan penyemprot ninhidrin 2%, aseton, dan larutan asam amino (asparagin,
tirosin, dan sampel x)

3.2 Alat
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah palat kromatografi lapis tipis (KLT), chamber,
botol semprot, pipa kapiler, pipet skala, oven, penggaris, pensil, dan pinset.

3.3 Prosedur Kerja

Larutan eulen disiapkan dengan cara mencampurkan n-butanol, asam asetat, air dengan
perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v yang kemudian dimasukkan ke dalam chamber. Chamber yang
telah diisi dengan larutan eulen kemudian ditutup rapat dengan plaster bening. Sementara chamber
dibiarkan sampai jenuh dengan eulen, kertas kromatografi disiapkan, digunting sesuai dengan
keperluan. Kertas kromatografi diberi garis dengan menggunakan pensil dengan jarak 1 cm dari
atas dan bawah garis, kemudian pada garis bagian bawah, dibuat titik sebanyak 4. Setelah itu,
kertas kromatografi dimasukkan ke dalam oven.
Kertas yang telah dipanaskan kemudian diberi totolan larutan asam amino (arginin, lisin,
histidin, dan sampel x). Pentotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler yang dicelupkan
ke dalam larutan asam amino kemudian ditandai pada bagian yang telah diberi titik, setelah itu
pipa kapiler tersebut dicuci dengan menggunakan larutan aseton untuk kemudian digunakan
kembali. Setelah semua titik telah di totol dengan asam amino, kertas kromatografi dimasukkan ke
dalam chamber yang sudah jenuh dengan eulen. Totolan contoh tidak boleh tercelup dalam eulen.
Elusi dihentikan setelah eulen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya dengan
menggunakan pensil. Kemudian plat dikeluarkan dan dikeringkan pada suhu kamar. Setelah itu,
dengan hati-hati kertas disemprot dengan larutan ninhidrin, kemudian kertas dikeringkan dengan
dimasukkan ke dalam oven. Setelah kering akan muncul noda dan pada noda yang timbul diberi
lingkaran pensil lalu diukur jaraknya dengan menggunakan penggaris.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Tabel 1. Data Hasil Pengamatan Jarak Eluen dan Jarak Noda
Noda
Jarak eluen
Jarak noda (cm)
Rf (cm)
Tirosin
5
2,8
0,56
Asparagin
5
1,25
0,25
Sampel x
5
2,6
0,52

4.2 Reaksi
Tirosin + Ninhidrin

4.3 Pembahasan
Percobaan ini dilakukan untuk mengidentifikasi larutan asam amino (Asparagin, Tirosin, dan
sampel x) menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan proses elusi dan menghitung nilai
Rf yang diperoleh dari perbandingan jarak noda dan eluen.
Pembuatan larutan eluen dilakukan dengan cara pencampuran antara larutan n-butanol, asam
asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Pemilihan ketiga pelarut ini didasarkan
pada perbedaan kepolaran dari ketiga pelarut tersebut, dengan urutan kepolaran air > n-butanol >
asam asetat. Hal ini dilakukan agar pada saat pengidentifikasian asam aminonya, akan terlihat
lebih jelas perbedaan dari noda yang ditimbulkan. Setiap asam amino memiliki koefisien partisi
tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang amemiliki afinitas terhadap fasa gerak
(pelarut) yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang
afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan
demikian asam amino dapat dipisahkan akibat perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa
diamnya. Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan kimia asam amino. Sifat fisik
ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam dari kertas kromatografi dan sifat kimianya
berdasarkan pada warna yang timbul ketika disemprot dengan larutan ninhidrin.
Pemotongan kertas KLT yang disesuaikan dengan ukuran chamber yang digunakan. Sebelum
dilakukan penotolan larutan asam amino, plat KLT terlebih dahulu diaktifasi melalui pemanasan.
Tujuan pengaktifan ini yaitu menghilangkan uap air pada plat KLT, sehingga dalam proses elusi
nantinya plat KLT dapat menyerap eluen dengan baik. Setelah dilakukan aktifasi plat KLT,
selanjutnya larutan asam amino ditotolkan pada plat KLT di bagian base line tepi bawah
menggunakan pipa kapiler. Setiap penotolan asam amino dilakukan tegak lurus dengan bidang
tempat menotol, serta hanya dilakukan satu kali. Tujuannya adalah untuk menghindari terjadinya
komet (noda berekor) pada plat.
Sebelum plat KLT dimasukkan ke dalam chamber, chamber terlebih dahulu dijenuhkan
dengan eluen dengan cara menutup rapat chamber yang berisi eluen dengan menggunakan isolasi.
Tujuan penjenuhan ini adalah agar proses elusi dapat berjalan dengan cepat serta untuk mencegah
penguapan eluen. Setelah eluen dijenuhkan dan plat KLT telah ditotolkan larutan asam amino dan
sampel, plat KLT dimasukkan dalam chamber dan dilakukan proses elusi sampai bayang-bayang
eluen mencapai end line (batas akhir elusi). Setelah plat KLT diangkat dari eluen, kemudian
dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin, yang bertujuan untuk memberikan warna
pada noda asam amino dan ninhidrin berfungsi sebagai pereaksi spesifik terhadap asam amino
dengan membentuk warna ungu (lembayung) bagi asam amino glisin dan larutan sampel. Untuk
memperjelas noda asam amino, plat KLT dimasukkan dalam inkubator. Proses elusi dibiarkan
beberapa saat agar eluen mencapai jarak tertentu yang telah diberi tanda dan setelah sampai pada
garis tanda, plat KLT dikeringkan dengan inkubator agar pelarut menguap sempurna sehingga
noda yang terbentuk tidak melebar. Selanjutnya dilakukan pengukuran jarak eluen dan jarak noda
dari tempat penotolan.
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Rf = jarak noda dari tempat penotolan
jarak yang ditempuh pelarut
Berdasarkan hasil perhitungan nilai Rf, maka diperoleh nilai Rf yang bervariasi antara satu
asam amino dengan asam amino yang lainnya. Nilai Rf Asparagin 0,25 cm, tirosin 0,56 cm, dan
nilai sampel x adalah 0,52.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Nilai Rf untuk asam amino Asparagin 0,25 cm, tirosin 0,56 cm, dan nilai sampel x adalah 0,52.
2. Larutan sampel diidentifkasi berdasarkan nilai Rf, dimana nilai Rf sampel berdasarkan
percobaan sama dengan nilai Rf asam amino glisin berdasarkan teori sehingga sampel
mengandung asam amino Asparagin.

5.2 Saran
5.2.1 Saran untuk Laboratorium
Alat yang digunakan pada percobaan ini terutama pipet tetes diperbanyak, agar praktikum
berjalan dengan lancar.
5.2.2 Saran untuk Percobaan
Bahan yang digunakan tidak hanya asam amino glisin dan tirosin. Sebaiknya menggunakan asam
amino yang lain agar lebih banyak yang dapat dibandingkan dan diketahui nilai Rf berdasarkan
praktikum.
5.2.3 Saran untuk Asisten
Cara penjelasan prosedur serta pengarahan dalam langkah-langkah pengerjaaan sudah baik dan
mudah dimengerti.
DAFTAR PUSTAKA

Adnan, M., 1997, Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan, Andi, Yogyakarta.

Akbar, Y., 2011, Pemisahan dan Identifikasi Asam Amino (online), (http://
akbarbanjar.wordpress.com/2011/03/17/laporan-biokimia/), diakses pada tanggal 25 Oktober 2014
pukul 01.38 WITA.

Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, Hipokrates, Jakarta.

Gritter, A., 1991, Biokimia 1, PT. Gramedia, Jakarta.

Lehninger, A.L., Dasar-Dasar Biokimia, Penerbit Erlangga, Jakarta

Poedjiadi A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, UI Press, Jakarta.

Poedjiadi, A. dan F. M. T. Supriyanti., 2009, Dasar-dasar Biokimia, Penerbit Universitas

Indonesia, Jakarta,

BAGAN KERJA

1.1 Pembuatan Eluen

n-butanol, asam asetat, dan air
2,5 : 0,6 : 2,6 mL

- Disiapkan dan dikeringkan chamber.

- Dimasukkan ke dalam gelas ukur menggunakan pipet tetes.
- Dimasukkan ke dalam chamber.
- Chamber ditutup dan didiamkan hingga chamber jenuh terhadap eluen.

Hasil
1.2 Penotolan Sampel

- Plat KLT dikeringkan sebelum digunakan.

- Plat KLT dibuat dengan ukuran yang telah ditentukan dan 1 cm dari tepi atas dan tepi
bawah.
- Ditotolkan pada plat dengan menggunakan pipa kapiler.
- Dikeringkan pada suhu kamar.
Hasil

1.3 Proses Elusi

- Dimasukkan ke dalam chamber untuk dilakukan proses elusi.

- Dihentikan proses elusi setelah eluen telah mencapai tanda batas yang ditentukan.
- Dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan dalam suhu kamar.
- Disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %.
- Dikeringkan di dalam incubator.
- Noda yang terbentuk pada plat KLT diberi garis lingkaran dengan menggunakan pensil.
- Diukur jarak eluen dan jarak totolan ke noda.
- Dihitung nilai Rf.

Hasil
LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 08 April 2014

ASISTEN PRAKTIKAN

AFMI PURWANTI NURUL MAGFIRAH SUKRI

Nurul Magfirah di 05.50

Berbagi

Tidak ada komentar:

Posting Komentar
‹
›
Beranda
Lihat versi web
Mengenai Saya
Foto saya
Nurul Magfirah

Lihat profil lengkapku

Diberdayakan oleh Blogger.

Laporan Cara-Cara Pemisahan

SENIN, 11 JANUARI 2016
PEMISAHAN ASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

PEMISAHAN ASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

( Laporan Praktikum Cara-Cara Pemisahan)

Oleh

Siti Nur Halimah

1217011054

Description: unial.jpg

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
2015

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi saat ini diikuti juga oleh perkembangan
penelitian-penelitian berbagai bidang. Pada penelitian-penelitian, mulai berkembang cara
pemisahan komponen dari suatu senyawa. Salah satu cara pemisahan yaitu dengan teknik
kromatografi, suatu teknik pemisahan yang pada umumnya telah dilakukan dan telah mengalami
perkembangan yang luar biasa. Karena kemampuan dan akurasinya tinggi, menyebabkan teknik
ini termasuk teknik yang paling banyak dipakai.
Pada praktikum ini akan dilakukan pemisahan asam amino sederhana dengan menggunakan teknik
Kromatografi Lapis Tipis ( KLT). Sampel asam amino yang digunakan yaitu suatu campuran asam
amino, larutan standar albumin, kasein dan alanin. Derajat dimana molekul dibawa sejauh mana di
fasa gerak disebut Rf ( Retention Factor). Setiap senyawa memiliki nilai Rf yang berbeda-beda.
Dengan KLT, asam amino dapat dipisahkan serta diidentifikasikan menurut nilai Rf nya sehingga
kita dapat mengetahui dengan jelas pemisahan dan identifikasi asam amino dengan metode ini.

1.2. Tujuan Percobaan

Mahasiswa mampu memahami memisahkan asam amino sederhana dengan kromatografi kertas
atau kromatografi lapis tipis.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Kromatografi adalah proses pemisahan yang digunakan untuk memisahkan campuran molekuler
berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen dan distribusi molekul-molekul dalam dua
fasa diam (adsorben) dan fasa bergerak (eluen). Dengan perkataan lain prinsip dasar dalam analisa
kromatografi adalah berdasarkan pada prinsip distribusi fasa yakni suatu perpindahan komponen-
komponen zat yang dianalisa dari suatu fasa yang bergerak (eluen) menuju ke fasa lain yang diam
(adsorben) yang dilaluinya. Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan
dalam membawa komponen-komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan
membawa komponen-komponen senyawa yang akan dipisahkan. Sedangkan adsorben adalah fasa
diam yang menyerap zat yang dianalisa, contohnya kertas, kanji, selulosa, silika gel, dll. (anonim,
2011).
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan, yang pertama kali dipakai untuk memisahkan zat-zat
warna tanaman. Hal ini tersimpul dari istilah yang dipakai- kroma adalah zar warna. Pemisahan
dengan teknik ini dijalankan dengan

mengadakan manipulasi atas dasar perbedaan sifat-sifat fisik dari zat-zat yang menyusun suatu
campuran. Sifat-sifat fisik tersebut khususnya ialah (Adnan, 1997).
Adanya tendensi molekul dari suatu zat untuk larut dalam suatu cairan. Adanya tendensi molekul
dari suatu zat untuk dapat teradsorbsi pada butir-butir zat padat yang halus dengan permukaan
yang luas. Adanya tendensi molekul dari suatu zat untuk masuk ke fase uap atau menguap.
Macam-macam kromatografi, ( Anonim, 2011) :
1. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium
yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi
lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
2. Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya,
system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion
sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam
amino.
3. Kromatografi Penyaringan Gel
Kromatografi penyaringan gel merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari
modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat
menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul
berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan
dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan
polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
4. Elektroforesis
Elektroforesis merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran
fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda.
Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.
5. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah
lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan.
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang
saling tidak bercampur. Jadi partisi sutu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa
mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran
pelarut.
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri,
mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh
pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi
kertas, lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Nilai Rf untuk setiap
warna dihitung dengan rumus sebagai berikut (Rifqi, 2009) :
Rf= (jarak yang ditempuh oleh komponen)/ (jarak yang ditempuh oleh pelarut)
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas ialah
karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebig tinggi, dan
dapat dilaksanakan denga lebih cepat. Banyak pemisahan yang memakan waktu berjam-jam bila
dikerjakan dengan kromatografi kertas, tetapi dapat dilaksanakan hanya beberapa menit saja bila
dikerjakan dengan TLC (Adnan, 1997). Kelebihan dari kromatografi lapis tipis yang lain ialah
pemakaian pelarut dan cuplikan yang jumlahnya sedikit, kemungkinan penotolan cuplikan
berganda (saling membandingkan langsung cuplikan praktis) dan tersedianya beberapa metode
(Gritter, 1991).
Pemurnian FRY dan reaksinya, hasil ari FAOD diletakkan di RP-18 plat KLT yang terdiri dari n-
butanol, asam asetat dan air (4 : 1 : 5). Pemurnian FRY dideteksi oleh ninhidrin (noda ungu).
Dugaan bahwa FRY terdiri dari gula dan amina termasuk asam amino. Pada substrat FAOD, valin
menunjukkan karakter yang sama pada KLT. Ketika permunian dalam inkubator dengan FAOD,
noda ungu muncul (Anonim, 2010).
Asam amino ialah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat
sebagai komponen protein mempunyai gugus –NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus –
COOH (Poedjiadi, 1994).
Asam amino merupakan senyawa amfoter, yakni memiliki gugus asam dan juga gugus basa.
Karena itu, asam amino dapat membawa muatan listrik total yang bergantung pada sifat
larutannya. Muatan yang dibawa suuatu molekul mempengaruhi interaksinya dengan molekul lain.
Sifat ini dimanfaatkan untuk isolasi dan pemurnian asam amino maupun protein (Ngili, 2009).

III. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1. Alat dan Bahan

Adapun alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah bejana pengembang, sprayer, dan
kertas kromatografi/ kromatografi plat ( TCL). Dan bahan-bahan yang digunakan adalah butil
alkohol, asam asetat, akuades, propil alkohol, asam klorida, etanol, dan larutan ninhidrin.

3.2. Diagram Alir

-
Kertas kromatografi ( 15 x 5 cm)

Dilarutkan dalam HCl alcohol

- Ditandai dengan pensil 2B 2 cm pada bagian bawah plat

- Dielusi dengan eluen sampai pelarut sampai tanda atas TLC ( 10 menit)
- Dihentikan lalu dikeringkan

Kertas kromatografi kering / TLC

- Disemprot dengan larutan ninhidrin

- Dipanaskan dalam oven 30oC selama 3 menit hingga terlihat warnanya
-
Hasil

Dihitung Rf masing-masing standar dan sampel uji

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Percobaan

Dari percobaan yang telah dilakukan didapatkan hasil sebagai berikut:

NO.
Bahan
Perlakuan
Hasil
1
Campuran asam amino
Dilarutkan dalam HCl alkohol
Larutan bening
2
Kertas kromatografi 15 x5 cm
Disiapkan, ditandai dengan pensil 2 B. Asam amino ditotolkan pada plat dan dielusi kemudian
dihentikan lalu dikeringkan

3
Kertas kromatografi kering
Disemprot dengan larutan ninhidrin, dipanaskan dalam oven hingga terlihat warnanya
Tidak terlihat warna

4
Kertas kromatografi (Jarak standar 11 cm)
Dihitung Rf masing-masing standar dan sampel uji
Alanin = 3,4 cm
Albumin = 3,4 cm
Kasein = 3,4 cm
Campuran = 3,2cm

4.2 Pembahasan

Pada percobaan ini dilakukan pemisahan asam amino dengan menggunakan teknik kromatografi
dengan cara pertama yaitu menyiapkan alat dan bahan. Kemudian disiapkan plat kromatografi 15
x 5 cm, jarak bawah plat 2 cm. Setelah itu, masing-masing sampel ditotolkan ke plat dengan pipa
kapiler.
 15 cm

2 cm

5 cm

Keterangan:
Totolan nomor 1: campuran
Totolan nomor 2: standar albumin
Totolan nomor 3: kasein
Totolan nomor 4: alanin

Setelah sampel ditotolkan pada plat, kemudian dimasukkan ke dalam bejana pengembang sampai
eluen keatas. Bejana pengembang digunakan untuk wadah agar fase gerak bergerak melalui fase
diam. Fase diam merupakan padatan bisa berupa kertas maupun lapis tipis. Fase gerak merupakan
pelarut organic dapat berupa larutan garam yang sangat encer. Pelarut pengembang yang
digunakan adalah butil alkohol: asam asetat: akuades ( 80:20:20), propil alkohol: akuades ( 7:3),
asam klorida 0,1 M : etanol 98 % ( 1:1). Setelah pelarut sampai tanda batas atas kertas
kromatografi kira-kira 10 menit, lalu keringkan. Setelah itu plat disemprot dengan larutan
ninhidrin dan dikeringkan dalam oven. setelah itu akan timbul warna. Pada percobaan ini, tidak
terlihat warna pada plat kemungkinan dikarenakan waktu perendaman plat dalam eluen yang
kurang dan penyemprotan larutan penanda ( ninhidrin) yang kurang rata.
Jika warna terlihat, dapat dihitung nilai Rf nya dengan rumus:
Rf= (jarak yang ditempuh oleh komponen)/ (jarak yang ditempuh oleh pelarut)
Macam-macam kromatografi :
1. Kromatografi Lapis Tipis
Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan
lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada
umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
2. Kromatografi Penukar Ion
Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini khusus
digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang
Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam amino.
3. Kromatografi Penyaringan Gel
Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul
polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk
susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya.
Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan.
Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna
untuk pemisahan polimer. Kromatografi penyaringan gel merupakan kromatografi yang diberi
medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju
ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya
muatan.

4. Kromatografi Kertas
Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang
diserap dari lembab udara oleh kertas

5. Elektroforesis
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang
saling tidak bercampur. Jadi partisi sutu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa
mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran
pelarut.

Asam amino ialah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat
sebagai komponen protein mempunyai gugus –NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus –
COOH. Asam amino merupakan senyawa amfoter, yakni memiliki gugus asam dan juga gugus
basa. Karena itu, asam amino dapat membawa muatan listrik total yang bergantung pada sifat
larutannya. Muatan yang dibawa suuatu molekul mempengaruhi interaksinya dengan molekul lain.
Sifat ini dimanfaatkan untuk isolasi dan pemurnian asam amino maupun protein.

Asam amino dibagi menjadi 3 jenis, yaitu:

1. Asam amino esensial yaitu asam amino yang tidak dibuat oleh tubuh sehingga
kebutuhannya dipasok dari makanan. terdapat 9 jenis asam amino esensial yaitu: histidin,
isoleusin, leusin, lisin, methionin, phenilalanin, treonin, triptophan, and valin.
2. Asam amino non esensial yaitu asam amino yang diproduksi tubuh dan mencukupi
kebutuhan walaupun tidak diperoleh dari makanan. jenis asam amino non esensial adalah alanin,
asparagin, asam aspartat, and asam glutamate
3. Asam amino kondisional adalah asama amino yang biasanya tidak esensial kecuali saat
sakit dan stress. Jenis asam amino ini adalah: arginin, sistein, glutamin, tyrosine, glisin, ornithin,
prolin, and serin.

V. KESIMPULAN

Dari percobaan yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:
1. Kegagalan dalam percobaan dikarenakan waktu perendaman plat dalam eluen yang kurang
dan penyemprotan larutan penanda ( ninhidrin) yang kurang rata.
2. Perhitungan Rf tidak dapat dilakukan dikarenakan tidak terlihat noda pada plat.
3. Perhitungan Rf dilakukan dengan cara membagi jarak komponen dengan jarak yang
ditempuh fase gerak sampai batas atas plat.
4. Sampel yang ditotolkan terdiri dari campuran asam amino, larutan standar albumin, kasein
dan alanin.
5. Digunakan larutan penanda ninhidrin dikarenakan adanya gugus amina pada asam amino
yang akan bereaksi dengan pereaksi ninhidrin sehingga menghasilkan warna.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2010, Kromatografi, Kolom dan Lapis Tipis (online),

(http://asyharstf08.wordpress.com/2011/03/07/kromatografi-kolom-dan- lapis-tipis/, 21 April 2015
pukul 06.00 WIB).
Anonim, 2011. Kromatografi (online).
(http://kimiamagic.blogspot.com/2011/03/kromatografi.html. 21 April pukul 06.00 WIB).
Adnan M, 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan. Andi. Yogyakarta.
Gritter, A. 1991. Biokimia 1. Gramedia. Jakarta.
Ngili, Y. 2009. Biokimia Struktur Dan Fungsi Biomolekul. Graha Ilmu. Yogyakarta.
Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta.

Siti Nur Halimah di 23.41

Berbagi

Tidak ada komentar:

Posting Komentar
›
Beranda
Lihat versi web
MENGENAI SAYA
Foto saya
Siti Nur Halimah

Lihat profil lengkapku

Diberdayakan oleh Blogger.

Pelatihan Dasar Organisasi

▼
Jumat, 04 Maret 2016
LAPORAN PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA : JUMATANG
NIM : H41114002
KELOMPOK : II (DUA)
HARI/TANGGAL : KAMIS/30 OKTOBER 2015
ASISTEN : ERYANTI B. BARRUNG

LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2015

BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar belakang

Protein sel dan yang terdapat di dalam makanan akan dicernakan menjadi asam-asam amino yang
menyusunnya oleh protease yang khas. Untuk mencegah pemecahan protein yang tidak terkendali,
berbagai protease yang terdapat dalam saluran pencernaan disekresikan sebagai zimogen dan
diaktifkan di tempat yang tepat. Protease sel tersimpan di dalam lisosom. Bila amino yang
dihasilkan tidak diperlukan untuk sintesis protein, maka nitrogen tadi disingkirkan, sedangkan
rangka karbon yang tinggal dioksidasi atau diubah menjadi glukosa ataupun zat-zat keton
(Schumm, 1992).
Analisis asam amino ini sangat diperlukan, analisis cairan biologi dan hidrolisat protein.
Cara analisis asam amino yang masih lazim digunakan sampai saat ini adalah kromatografi
dengan berbagai macam teknik seperti kromatograti kertas, lapisan tipis, dan kolom. Akan
tetapi pada kromatografi kolom biasa (open column), diperlukan waktu yang lama untuk
memisahkan asam amino secara sempurna. Karena itu perlu ada metode analisis yang dapat
memisahkan asam amino tersebut secara sempurna dalam waktu singkat dengan hasil yang
tepat dan teliti (Rediatning dan Kartini, 1987).
Hal inilah yang menjadi latar belakang dilakukannya percobaan ini agar kami bisa mengetahui dan
memahami cara pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu sampel melalui metode
kromatografi lapis tipis.

I.2 Maksud dan Tujuan percobaan

I.2.1 Maksud percobaan
Mengetahui dan memahami cara pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu sampel
melalui metode kromatografi lapis tipis.
I.2.2 Tujuan percoobaan
Tujuan dari percobaan ini yaitu:
1. Menghitung nilai Rf dari asam amino dan larutan sampel.
2. Menentukan jenis asam amino yang terkandung dalam suatu asam sampel.
I.3 Prinsip Percobaan
Identifiksasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan menggunakan metode
kromatografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari campuran n-butanol, asam asetat, dan air.
Sedangkan fase diamnya terdiri dari plat kromatografi.
I.4 Manfaat percobaan
Manfaat dari percobaan ini adalah kita dapat mengetahui dan memahami mengenai
pemisahan asam amino yang baik dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Analisis asam amino dengan kromatogram cair yang menggunakan resin penukar kation
sebagai fase diam, pertama kali dikembangkan oleh Williem Stein dkk., (8) pada tahun 1951,
yang kemudian dikembangkan bersama Sparknran (8) menjadi sistem yang otomatis pada
tahun I958. Akan tetapi metode ini masih sangat rumit, biayanya mahal, dan peralatannya
kurang dapat disesuaikan dengan keadaan. Akhir-akhir ini kromatografi cair dengan kinerja
tinggi (fligf PerJormance Liquid Chromatography) banyak digunakan untuk analisis asam
amino. Metode ini ditunjang oleh peralatan yang baik dan modern, menggunakan kolom
yang sangat efisien dan di bawah tekanan yang besar, sehingga analisis asam amino dapat
dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti
(Rediatning dan Kartini, 1987).
Proses pencernaan protein yang pertama berlangsung dalam lambung. Disini pepsin mencernakan
protein dengan memutuskan ikatan peptida yang ada di sisi NH2 bebas dari asam-asam amino
aromatik (fenilalanin, tirosin, triptofan), hidrofobik (leusin, isoleusin, metionin) atau dikarbosilat
(glutamat dan aspartat). pH optimum pepsin ialah 2, sehingga aktifitasnya yang tertinggi ialah di
dalam lambung (Schumm, 1992).
Beberapa studi baru-baru ini menyatakan bahwa mengonsumsi asam amino esensial
sebanyak 3-6 gram sebelum dan atau setelah latihan dapat merangsang pembentukan protein
8 Mengkonsumsi asam amino esensial bersamaan dengan karbohidrat segera setelah latihan
ketahanan dapat meningkatkan adaptasi terhadap latihan pada pria non-atlet 9. Secara teoritis,
hal ini dijelaskan sebagai efek asam amino esensial yang dapat meningkatkan pembentukan
protein dan adaptasi terhadap latihan. Karena asam amino esensial juga mengandung BCAA
(branched chain amino acid) maka efek biologis yang disebabkan oleh asam amino esensial
terkait dengan fungsi BCAA 10 International Society of Sports Nutrition. Menyebutkan
bahwa BCAA merupakan kelompok asam amino yang dapat merangsang pembentukan protein,
membantu pembentukan glikogen kembali, mencegah kelelahan, dan menjaga fungsi
metabolisme aerobik. Sehingga pemberian asam amino esensial bersama dengan karbohidrat
dapat dikatakan aman dan efektif (Sudargo dkk., 2012).
Pemisahan dan elusi asam amino didasarkan pada perbedaan pI (pH isoelektrik) asam
amino tenebut dan pengaturan pH fase geraknya. Pada pH yang rendah (= 3,0) asam amino
berada dalam bentuk terprotonasi, sehingga dapat terikat dengan resin penukar kation (R-
SO3) menggantikan kedudukan Na+. Bila pH dinaikkan secara gradien (berangsur-angsur
dengan tetap), maka setelah pI di lewati, gugus NH3+ dari asam amino tersebut akan
berubah menjadi gugus NH2 yang menyebabkan terlepasnya asam amino dari resin
dan terelusi. Makin kecil pI, asam amino makin cepat terelusi. Asam amino yang
mempunyai pI yang sama akan terpisah berdasarkan perbedaan ukuran molekul,
karena selain mempunyai sifat menukarkan ion, resin yang digunakan juga mempunyai
sifat molecular sieve (Rediatning dan Kartini, 1987).
Menyediakan banyak pasokan asam amino penting untuk otot dalam waktu 1-3 jam sebelum atau
setelah latihan dapat membantu untuk lebih otot sintesis protein. Gibala 33 menunjukkan bahwa
konsumsi minuman yang mengandung sekitar 0,1 gram asam amino esensial per kilogram berat
badan (7 gram untuk atlet 70 kilogram) selama beberapa pertama jam pemulihan dari
perlawanan berat latihan kehendak menghasilkan transien, peningkatan positif bersih dalam otot
keseimbangan protein. Gibala juga mencatat bahwa tidak pasti jika menelan asam amino, baik
sendiri atau dikombinasikan dengan karbohidrat, segera sebelum latihan atau selama pemulihan
lebih meningkatkan laju otot penumpukan protein selama pemulihan (Williams, 2005).
Identifikasi asam amino sangat penting untuk struktur protein dan juga untuk penentuan kehadiran
asam amino dalam berbagai produk alami. Ada beberapa metode untuk penentuan asam amino
dalam biologi dan sampel farmasi. Kromatografi lapis tipis (TLC) menemukan tempatnya ketika
peralatan relatif mahal yang dibutuhkan oleh metode lain tidak tersedia. Lapisan tipis
kromatografi adalah alat penting untuk identifikasi asam amino oleh berbagai reagen semprot.
Reagen dalam penggunaan umum, ninhidrin adalah yang paling populer karena yang sangat
sensitivitas tinggi. Asam hanya prolin dan hidroksiprolin menghasilkan kuning warna (Sinhababu,
2013).
Pepsin disekresikan sebagai zimogen yang bernama pepsinogen. Pengaktifannya menjadi pepsin
dilakukan oleh asam lambung dan secara otokatalitis juga oleh pepsin yang sduah terbentuk. Pada
proses pengaktifan dilakukan ini, dilepaskan 42 asam amino dari ujung NH2 (Schumm, 1992).

BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan percobaan

Bahan yang digunakan adalah eluen (n-butanol; asam asetat; air 2,5:0,6: 2,6 v/v, larutan ninhidrin
2%, larutan alanin, larutan asparagin, larutan lisin, asam aseton, akuades, tissue roll, plat
kromatografi dan selotip.
3. 2 Alat percobaan
Alat yang digunakan adalah chamber, mistar, pensil, pipa kapiler 0,5 mL, inkubator, botol
semprot, gelas ukur.

3. 3 Prosedur Percobaan
3.3.1 Proses Pembuatan Eluen
Larutan pertama yaitu eluen dibuat dengan menggunakan larutan n- butanol, dan asam asetat, air
dengan perbandingan 2,5:0,6: 2,6 v/v. Kemudian larutan eluen dimasukkan ke dalam chamber dan
ditutup rapat dengan selotip. Sehingga chamber jenuh dengan larutan eluen, kurang lebih selama
beberapa menit.

3. 3. 2 Penotolan
Plat KLT pertama-tama dibuat base line sebagai batas elusi. Kemudian disimpan di inkubator
selama 15 menit untuk mengaktifkan plat KLT. Lalu dibuat titik-titik (totolan) pada base line yaitu
asparagin, tirosin, dan sampel dengan menggunakan pipa kapiler yang sebelumnya telah di cuci
dengan aseton kemudian dikeringkan dan dimasukkan ke dalam chamber dengan hati-hati agar
base line tidak tercelup ke dalam eluen.
3. 3. 3 Elusi

Proses elusi ini ditunggu sampai eluen naik ke top line. Elusi dihentikan jika eluen menempuh
jarak yang telah ditentukan sebelumnya, absorben dari chamber dan dikeringkan. Selanjutnya
kromatogram disemprot dengan larutan ninhidrin, kemudian dikeringkan dalam suhu kurang lebih
60 0C selama setengah jam. Setelah kering diberi tanda pada noda yang timbul pada kromatogram
dengan pensil. Ditentukan nilai Rf dan masing-masing noda pada kromatogram.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

Percobaan yang dilakukan untuk menghitung nilai Rf dari larutan asam amino dan
mengidentifikasi asam amino dari larutan sampel melalui metode kromatografi lapis tipis.
Identifikasi yang dilakukan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis dengan cara memberi
tiga totolan laruran asam amino pada kertas kromatografi yang dimasukkan ke dalam chamber
yang jenuh dengan eluen. Eluen dibuat dengan campuran n-butanol: asam asetat:air = 2,5:2,26
v/v. Digunakan larutan eluen untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat
digunakan dua fase pelarut yaitu n-butanol, asam asetat asetat air, dimana setiap jenis asam amino
mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu.
Setelah eluen menempuh jarak telah ditentukan sebelumnya, kertas kromatografi dikeluarkan lalu
dikeringkan dalam suhu kamar. Selanjutnya disemprotkan dengan ninhidrin dan kemudian di
masukkan kedalam oven. Penyemprotan dilakukan karena ninhidrin yang dipanaskan bersama
asam amino akan terbentuk kompleks berwarna. Hasil penyemprotan dengan ninhidrin akan
menyebabkan timbulnya warna/noda pada kertas kromatografi.

Gambar: Plat kromatografi

Berdasarkan hasil percobaan tidak diperoleh jarak pada pelarut (eluen) , begitupun dengan jarak
yang ditempuh masing-masing sampel larutan asam amino yaitu, jarak yang ditempuh oleh
larutan asparagin tidak terdefinisi. Hal ini dapat terjadi karena adanya kesalahan dan kurangnya
tingkat ketelitian dari praktikum dalam penambahan larutan ninhidrin. Begitupun pada larutan
alanin dan larutan lisin.
Adapun kesalahan yang mungkin terjadi yaitu pada eluen yang ditempeli dengan label dan
kemudian dibuka kembali maka akan menyebabkan eluen tersebut terkelupas. Selain itu penotolan
pada plat dengan menggunakan pipa kapiler tersebut banyak terdapat aseton sehingga pada saat
penotolan bukan larutan asam amino yang tertotol pada eluen tetapi aseton.
Berdasarkan uraian diatas maka dapat disimpulkan bahwa dengan teknik kromatografi
lapis tipis dipengaruhi oleh kualitas kertas yang digunakan. Tetapi jika dibandingkan dengan
metode lain seperti teknik elektroforesi kemungkinan hasil yang akan didapatkan akan lebih baik
namun, dengan teknik kromatografi lapis tipis masih sedikit lebih unggul dibandingkan dengan
teknik lainnya karena masih dapat dilihat fase gerak dan fase diamnya dalam pemisahan dan
identifikasi asam amino.

BAB V
PENUTUP

5. 1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari percobaan ini adalah:
1. Nilai Rf untuk larutan asparagin, lisin dan alanin tidak nampak.
2. Tidak adanya noda pada kromatografi lapis kertas menyebabkan asam amino tidak dapat
ditentukan.

5. 2 Saran
5. 2 .1 Saran untuk Laboratorium
Untuk laboratorium sebaiknya bahan-bahan yang dibutuhkan dalam praktikum di perbanyak
sehingga kami dapat melakukan praktikum dengan baik.
5. 2. 2 Saran untuk Praktikum
Saran untuk praktikum adalah agar praktikum kedepannya bisa memberikan bahan dan alat yang
lebih memadai agar praktikan dapat menggunakan dengan baik

5. 2. 3 Saran untuk Asisten

Penjelasan kepada praktikan sudah baik, serta komunikasi dengan praktikan cukup baik.
DAFTAR PUSTAKA

Rediatning Wayan S., dan Kartini, Nanny H., 1987, Analisis Asam Amino dengan Kromatografi
Cairan Kinerja Tinggi Secara Derivatisasi Prakolom dan \Pascakolom, Jurnal Proceedings ITB,
IPB Press, Bogor, 20(1/2): 42-46.

Schumm, D., E., 1992, Intisari Biokimia, Binarupa Aksara, Jakarta.

Sinhababu, A., 2013, Modified Ninhydrin reagent for the detection of amino acids on TLC plates,
Journal of Applied and Natural Science, 5(1): 1.

Sudargo, T., Afidah, R., Freitag, H., Amali, R., R., Triatanti, R., K., 2012, Pengaruh Suplementasi
Karbohidrat, Lemak dan Protein Terhadp Kadar Glukosa Darah dan Asam Laktat Pada Atlet
Pencak Silat, Jurnal Jurusan Kesehatan Masyarakat, Fakultas Kesehatan Masyarakat, 35(1): 11-12.

Williams, M., 2005, Dietary Supplements And Sports Performance: Amino Acids, Journal of the
International Society of Sports Nutrition, 2(2): 63-67.
LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 20 November 2015

Praktikan Asisten

JUMATANG ERYANTI B. BARRUNG

H41114002 H31111270

Lampiran 1
Bagan kerja

Plat KLT

- Di gunting sesuai ukuran chamber dan diberi tanda.

- Dikeringkan dalam ikkubator untuk mengaktifkan lapisan tipis.
- Ditotolkan larutan asam amino (alanin, glisin, L-asparagin, sampel x).
- Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen (N-butanol: asam asetat : aquades = 2,5 ml :
0,6 ml : 2,6 ml) yang jenuh.
- Dielusi ssampai tanda batas yang telah ditentukan.
- Dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan.
- Disemprotkan dengan larutan ninhidrin 2 %.
-
Noda

Dikeringkan dalam inkubator selama beberapa menit.

- Ditandai dengan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil.

- Diukur jarak noda dari tempat penotolan.
- Dihitung nilai Rf-nya.
Hasil

Jumatang 30 di 19.46
Berbagi

Tidak ada komentar:

Posting Komentar
›
Beranda
Lihat versi web
Diberdayakan oleh Blogger.
About Me

Foto saya
Jumatang 30

Lihat profil lengkapku

Astrid Safira Idham

telusuri
SEP
27
LAPORAN BIOKIMIA PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA : ASTRID SAFIRA IDHAM

NIM : H41113341
HARI/TANGGAL : KAMIS / 30 OKTOBER 2014
KELOMPOK : IV (EMPAT) C
ASISTEN : AFMI PURWANTI

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Asam amino merupakan monomer yang menyusun polimer-polimer pada protein. Seperti yang
telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga gugus yang reaktif pada asam amino
yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus rantai samping. Ketiga gugus ini dapat
diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan
sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino
dapat pula diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah melalui
kromatografi lapis tipis (KLT).
Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang
terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa stasioner atau yang lazim disebut sebagai
fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang
sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua
pelarut seimbang. Pada kromatografi lapis tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner adalah
suatu lembaran tipis silika gel.
Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fase pelarut, dimana
setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu.
Perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan permukaan fasa mobile merupakan dasar
untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu melalui percobaan
ini akan dilakukan pengidentifikasian asam amino dengan menggunakan metode kromatografi
lapis tipis.

1.2 Maksud dan Tujuan

1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara pemisahan dan identifikasi asam amino
dalam suatu sampel dengan menggunakan metode kromatografi.
1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya percobaan ini yaitu :
1. Menentukan nilai Rf dari asam amino (arginin, glisin, histidin) dan sampel.
2. Mengidentifikasi asam amino dari larutan sampel melalui metode kromatografi lapis tipis.

1.3 Prinsip percobaan

Pemisahan asam amino secara kromatografi menggunakan KLT atau plat kromatografi lapis tipis
yang fase gerakannya dengan menggunakan eluen yang terdiri atas campuran n-butanol, asam
asetat dan air. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan jarak noda yang dihasilkan setelah
penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Setelah itu membandingkan nilai Rf dari asam amino.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Asam amino yang merupakan monomer (satuan pembentuk) protein amino adalah suatu senyawa
yang mempunyai dua gugus fungsi yaitu gugus amino dan gugus karboksil. Pada asam amino,
gugus amino terikat pada atom karbon yang berdekatan dengan gugus karboksil (C-α) atau dapat
dikatakan juga bahwa gugus amina dan gugus karboksil dalam asam amino terikat pada atom
karbon yang sama (Tim Dosen Kimia, 2013).
Asam amino yang diperoleh dari larutan hidrolisis protein adalah asam amino α. Artinya, gugus
amino berada pada atom karbon α, yaitu disebelah gugus karboksil. Kecuali glisin, dengan R = H,
asam amino α memiliki pusat stereogenik pada karbon α. Dengan demikian, semua asam amino α
kecuali glisin bersifat aktif optis (Lehninger, 1982).
Asam amino tidak hanya berperan sebagai bahan bangunan protein, tetapi juga merupakan sumber
daya kimia bagi banyak senyawa yang membutuhkan nitrogen. Misalnya glisin diperlukan untuk
biosintyesis gugus heme dari hemoglobin. Triptofan merupakan pelopor bagi suatu kelompok
senyawa penting dalam biokimia system syaraf. Terosin merupakan materi pemula bagi biosintesis
dari pigmen kulit melanin (Tim Dosen Kimia, 2013).
Beberapa asam amino tidak dapat disintesis dalam tubuh manusia oleh karenanya asam-asam
amino tertentu harus diperoleh secara langsung dari makanan atau minuman yang dikenal sebagai
asam amino esensial. Tergolong sebagai asam amino esensial adalah : Arginin, Lisin, Triptofan,
Histidin, Metionin, Valin, Isolensin, Lensin, Finilalanin, Treonin, Argini dan Fenilalanin
Sangat dibutuhkan oleh bayi yang dalam pertumbuhan (Tim Dosen Kimia, 2013).
Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti
pada eter, aseton dan kloroform. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas
beberapa atom karbon umumya kurang larut dalam air tetapi larut dalampelarut organik
(Poedjiadi, 1994).
Analisis asam amino dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode, salah satu
diantaranya kromatografi lapis tipis. Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh
kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fase
stationer, dimana suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama
dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut didalam kedua pelarut
seimbang (Soedjiadi, 1988).
Asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil lebih baik digambarkan sebagai
struktur ion dipolar. Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan gugus
karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai ion karboksilat. Struktur dipolar ini konsisten
dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh yang agak tinggi (bahkan
yang paling sederhana, glisina, meleleh pada suhu 233 °C) dan kelarutannya dalam pelarut
organik relatif rendah). Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan
mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima
proton dari asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino
dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil (Hart, 2003).
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim
maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk
menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan
pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).
Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul atau mikromolekul
seperti lipid, polisakarida dan mungkin fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain
nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein
yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama, ialah pertama;
protein sederhana, yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino, dan
kedua protein terkonjugasi, yaitu protein yang dalam hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam
amino, tetapi menghasilkan juga komponen organik ataupun komponen anorganik yang disebut
“gugus prosthetic” (Poedjiadi, 1994).
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim
maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk
menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan
pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah
satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi
itu adalah : Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair
(KGC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Meronda, 2009).

BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan eluen (larutan n-butanol,
larutan asam asetat dan air = 25 : 6 : 26 v/v ), larutan ninhidrin 2 % dan larutan asam amino
(asparagin, tirosin, dan sampel).

3.2 Alat Percobaan

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah plat KLT (Kromatografi lapis tipis),
chamber, inkubator, botol semprot, pipa kapiler (0,5 µL) microsyringe dan gelas ukur.

3.3 Prosedur Percobaan

Eluen dibuat dengan cara dicampurkan n-butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 25 : 6
: 26 v/v. Kemudian larutan eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup rapat dengan selotip
hingga chamber jenuh dengan larutan eluen, kurang lebih selama beberapa menit. Kemudian
sebuah plat KLT dibuat garis dengan pensil sejauh 1 cm pada bagian bawah plat dan 1 cm dari
tepi atas plat. Selanjutnya, plat KLT dimasukkan ke dalam inkubator selama beberapa menit.
Setelah itu, plat KLT ditotolkan larutan asam amino (asparagin, tirosin, dan larutan sampel)
dengan menggunakan pipa kapiler dengan jarak yang sama. Lalu, plat KLT dimasukkan ke dalam
chamber yang sudah jenuh dengan larutan eluen, tetapi totolan larutan asam amino tidak boleh
tercelup ke dalam larutan eluen. Elusi dihentikan setelah eluen menempuh jarak yang telah
ditentukan sebelumnya yaitu garis ditandai dengan pensil. Plat KLT dikeluarkan dari chamber lalu
dikeringkan dalam inkubator. Dengan hati-hati, kertas disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %
kemudian dikeringkan di dalam inkubator kurang lebih pada suhu 60 oC selama beberapa menit.
Noda yang timbul diberi lingkaran dengan pensil. Diukur jarak dari tempat totolan sampai ke noda
yang terpisah. Dihitung Rf dari setiap noda.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.I Hasil
Tabel 1. Data Hasil Pengamatan
Noda
Jarak eluen
Jarak noda (cm)
Rf (cm)
Asparagin
-
-
-
Tirosin
6
3,7
0,616
Sampel
6
3,8
0,633

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan asam amino yang melibatkan pemisahan terhadap
campuran berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya.
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Rf = jarak noda dari tempat penotolan
jarak yang ditempuh pelarut

Pada percobaan pemisahan dan identifikasi asam amino ini dilakukan dengan menggunakan
metode kromatografi lapis tipis (KLT) dan dilakukan perhitungan nilai dengan menggunakan
rumus Rf di atas. Beberapa asam amino yang digunakan adalah alanin, glisin, asam aspartat dan
asam amino sampel X.
Langkah pertama yang dilakukan adalah dengan memotong plat KLT sesuai keperluan, lalu
mengaktifkannya dengan cara dimasukkan ke dalam oven pada suhu ± 60 oC selama ± 15 menit.
Setelah itu memberi tanda pada plat KLT menggunakan pensil sebagai batas 0,5 cm antara larutan
yang satu dengan yang lainnya dan beri garis 1 cm pada bagian atas plat dan 1 cm pada bagian
bawah plat. Penggunaan pensil disini adalah agar tidak terjadi perembesan tinta pada plat KLT.
Langkah selanjutnya menotoli plat dengan asparagin, tirosin, dan larutan sampel. Setelah itu, plat
KLT yang telah ditotoli beberapa larutan tadi dimasukan ke dalam chamber yang berisi larutan
eluen (campuran air, asam asetat, dan n-butanol). Campuran ini berfungsi agar setiap asam amino
dengan gugus yang berbeda dapat diidentifikasi. Adapun dipilih campuran dari bahan tersebut
karena memiliki perbedaan kepolaran dengan urutan kepolaran yaitu air > n-butanol > asam
asetat. Pada percobaan ini proses elusi berjalan lambat, proses elusi berakhir (eluen sampai pada
base line) kurang lebih 20 menit. Setelah absorben diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan
pada suhu kamar dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.
Berdasarkan hasil pengamatan setelah plat disemprot dengan ninhidrin 2% diperoleh hasil yaitu
pada noda tirosin, jarak eluennya 6 cm, jarak nodanya 3,7 cm sehingga diperoleh Rf = 0616. Pada
noda tirosin, jarak eluennya 6 cm, jarak nodanya 3,8 cm sehingga diperoleh Rf = 0,633.
Sedangkan pada sampel asparagine tidak muncul noda, hal ini mungkin diakibatkan kesalahan
atau kurangnya ketelitian praktikan dalam melakukan prosedur kerja. Dari percobaan ini dapat
diketahui bahwa larutan sampel memiliki Rf yang hampir sama dengan tirosin, dapat diambil
hipotesa bahwa larutan sampel adalah tirosin atau senyawa asam amino yang mempunyai gugus
fungsi yang mirip dengan tirosin.

Diposting 27th September 2015 oleh Astrid Safira Idham

0 Tambahkan komentar

Memuat