LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

LABORATORIUM : BIOKIMIA
PRAKTIKUM : BIOKIMIA
JUDUL PERCOBAAN : PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM
SAMPEL

Oleh :

Nama : FATHIN SALSABILA ALFARISI NIM : 18030194004 Kls : PKA18

Program / Jurusan : S1 Pendidikan Kimia / Kimia

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
A. Judul Percobaan
 Penentuan Jenis Asam Amino dalam Sampel
B. Hari / Tanggal Percobaan
 Rabu, 15 September 2021
C. Selesai Percobaan
 Rabu, 15 September 2021
D. Tujuan Percobaan
 Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan
kromatografi lapis tipis
E. Dasar Teori
1. Asam Amino
Asam amino adalah senyawa organik yang memiliki gugus
fungsional karboksil (-COOH) dan amina (biasanya –NH2). Dalam
biokimia, seringkali pengertiannya dipersempit : keduanya terikat pada
atom karbon (C) yang sama dan disebut atom C alfa. Gugus karboksil
memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam
bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik, cenderung menjadi asam
pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam (Lehninger,
1982). Hal ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion.
Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling banyak dipelajari
karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme, yaitu
sebagai penyusun protein termasuk enzim, kerangka dasar sejumlah
senyawa penting dalam metabolisme dan pengikat ion logam penting
yang diperlukan dalam dalam reaksi enzimatik (kofaktor). Hal itu dapat
dibuktikan apabila protein dihidrolisis maka akan menghasilkan asam
amino. Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang
mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH),
atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residu) atau disebut juga
gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan
asam amino lainnya. struktur umum asam amino adalah sebagai berikut:
 Gambar 1 Struktur Umum Asam Amino
Dimana R adalah gugus fungsi yang menentukan jenis dari asam
amino. Semua asam amino yang ditemukan pada protein memiliki ciri
yang sama, yaitu adanya gugus karboksil dan amina yang diikat pada
atom karbon yang sama. Struktur asam amino secara umum adalah satu
atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus
karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari
residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan
satu asam amino dengan asam amino lainnya.
Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα ("C-alfa") sesuai dengan
penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan
langsung dengan gugus karboksil.Oleh karena gugus amina juga terikat
pada atom Cα ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino.
Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai
samping tersebut menjadi empat kelompok.Rantai samping dapat
membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika
polar, dan hidrofobik jika nonpolar. Jenis- jenis asam amino
diantaranya :
 Asam amino alifatik sederhana : Glisina (Gly, G); Valina (Val,
V); Isoleusina (Ile, I); Alanina (Ala, A); Leusina (Leu, L)
 Asam amino hidroksi-alifatik : Serina (Ser, S); Treonina (Thr,
T)
 Asam amino dikarboksilat (asam) : Asam aspartat (Asp, D);
Asam glutamat (Glu, E)
 Amida : Asparagina (Asn, N); Glutamina (Gln, Q)
 Asam amino basa : Lisina (Lys, K); Histidina (His, H); Arginina
(Arg, R)
 Asam amino dengan sulfur : Sisteina (Cys, C); Metionina (Met,
M)
  Prolin : Prolina (Pro, P)
 Asam amino aromatik : Fenilanilina (Phe, F); Triptofan (Trp,
W); Tirosina (Tyr, Y)
Fungsi asam amino antara lain penyusun protein, termasuk enzim,
kerangka dasar sejumlah senyawa penting dalam metabolism.
Alanin (Ala) atau asam 2-aminopropanoat merupakan salah satu
asam amino bukan esensial. Bentuk yang umum di alam adalah L-
alanin (S-alanin) meskipun terdapat pula bentuk D-alanin (R-alanin)
pada dinding sel bakteri dan sejumlah antibiotika. L-alanin merupakan
asam amino proteinogenik yang paling banyak dipakai dalam protein
setelah leusin.
Glisina atau asam aminoetanoat adalah asam amino alami paling
sederhana. Rumus kimianya C2H5NO2. Asam amino ini bagi manusia
bukan merupakan asam amino esensial karena tubuh manusia dapat
mencukupi kebutuhannya. Glisina merupakan asam amino yang mudah
menyesuaikan diri dengan berbagai situasi karena strukturnya
sederhana. Secara umum protein tidak banyak mengandung glisina.
Pengecualiannya ialah pada kolagen yang dua per tiga dari keseluruhan
asam aminonya adalah glisina.
Tirosina (dari bahasa Yunani tyros, berarti keju, karena ditemukan
pertama kali dari keju) merupakan satu dari 20 asam amino penyusun
protein. Ia memiliki satu gugus fenol (fenil dengan satu tambahan
gugus hidroksil). Bentuk yang umum adalah L-tirosin (S-tirosin), yang
juga ditemukan dalam tiga isomer struktur: para, meta, dan orto.
Pembentukan tirosina menggunakan bahan baku fenilalanin oleh enzim
Phe-hidroksilase. Enzim ini hanya membuat para-tirosina. Dua isomer
yang lain terbentuk apabila terjadi “serangan” dari radikal bebas pada
kondisi oksidatif tinggi (keadaan stress).
2. Kromatografi
Definisi kromatografi secara lengkap dikemukakan oleh Keulmans
pada tahun 1959, yang menyatakan bahwa kromatografi adalah salah
satu metode analisis pemisahan secara fisika, dimana komponen yang
akan dipisahkan, didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan
fasa gerak.
Definisi kromatografi menurut IUPAC (International Union of Pure
and Applied Chemistry), kromatografi adalah metode yang digunakan
terutama untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana
komponen tersebut didistribusikan diantara dua fase yaitu fase diam
dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang
dilapiskan pada padatan atau gel.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran diantara dua
fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).
Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah
kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam
berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian
(partition chromatography).
Prinsip dasar kromatografi yaitu jumlah zat terlarut yang berbeda
saat kesetimbangan antara fase diam dan fase geraknya. Pemisahan
dengan metode kromatografi dapat terjadi apabila suatu molekul
maupun senyawa memiliki beberapa sifat yang berbeda, antara lain: a)
Mempunyai kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut. b)
Mempunyai sifat kelarutan maupun sifat untuk berikatan yang berbeda
satu sama lain dengan fase diamnya. c) Memiliki sifat mudah menguap
(volatil) pada temperatur yang berbeda.
Pemisahan secara kromatografi, menempatkan senyawa-senyawa
yang akan dipisahkan pada fasa geraknya yang kemudian mengalir
melalui suatu sistem stationer (fase diam), dimana selama proses
pengaliran tersebut akan terjadi interaksi antara komponen senyawa
dengan fase diamnya. Selama berinteraksi akan terjadi proses
pelarutan, adsorpsi maupun penguapan dari komponen senyawa yang
akan dipisahkan. Sifat-sifat dari komponen penyusun senyawa tersebut
akan menentukan apakah komponen-komponen tersebut mampu
bergerak atau tidak dalam fase diamnya. Bila semua komponen-
komponen yang ada tidak dapat bergerak dalam fase diam, maka proses
pemisahan tidak mungkin dapat berlangsung. Apabila dapat bergerak,
sejauh mana kecepatan bergerak di antara komponen-komponen
tersebut maupun perbedaan kecepatannya dengan kecepatan fasa gerak
yang dipakai pada sistem tersebut. Oleh karena itu pada metoda
kromatografi perlu dilakukan pemilihan fase gerak sedemikian rupa
sehingga semua komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang
berbeda-beda sehingga proses pemisahan dapat terjadi. Secara umum
dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah proses migrasi diferensial
dimana komponen-komponen sampel ditahan secara selektif oleh fase
diam.
Kromatografi Planar (Kromatografi lapis tipis), fase diamnya berupa
film tipis dengan partikel padat yang terikat bersama melalui kekuatan
mekanik pada senyawa pengikat seperti kalsium sulfat. Pada
kromatografi planar, komponen yang akan dipisahkan bergerak
bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak
berupa noda (spot) yang dapat dikenali. Posisi noda menunjukkan
identitas suatu komponen/senyawa, sedangkan besar atau intensitas
noda menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar ini
beberapa bercak komponen/senyawa dapat dipisahkan secara
bersamaan maupun dipisahkan dengan dua langkah, dimana langkah
yang kedua tegak lurus arahnya dengan langkah yang pertama. Cara ini
dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.
Pelarut akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa
senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah
larut dalam pelarut tertentu, misalnya pelarut organik, akan terbawa
naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai
bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian
dibiarkan kering dengan sendirinya diudara. Dengan proses ini, asam-
asam amino akan terpisah satu dengan yang lain, dan dengan
menyemprotkan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut
akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino
yang terpisah. Berikut adalah gambar ilustrasinya:

Gambar 2 Proses Elusi pada Kromatografi Kertas

Nilai Rf (Retordation Factor) berguna untuk identifikasi senyawa.
Nilai Rf untuk sampel dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa
standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh
senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut
dari titik asal. Untuk mencari nilai Rf dapat menggunakan rumus:
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎
𝑅𝑓 =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
Ilustrasi penentuan nilai Rf disajikan pada gambar dibawah ini:

Gambar 3 Penentuan Nilai Rf

Nilai Rf dari 20 jenis asam amino disajikan pada tabel dibawah ini:
Tabel 1 Nilai Rf dari Asam Amino

No. Asam Amino Nilai Rf

1. Alanin 0,38
2. Glisin 0,26
3. Tirosin 0,45
F. Alat dan Bahan
Alat :
1. Plat KLT 1 buah
2. Pipa kapiler 4 buah
3. Gelas kimia 1 buah
4. Gelas ukur 1 buah
5. Oven 1 buah
6. Klip dan benang wol 4,1 buah
7. Chamber 1 buah
8. Cawan petri 1 buah
9. Penggaris 1 buah
10. Pensil 1 buah
11. Pipet tetes 10 buah
12. Botol semprot 1 buah
Bahan :
1. Asam asetat glacial 6 ml
2. N-butanol 25 ml
3. Aquades 25 ml
4. Larutan asam amino standar secukupnya
5. Larutan sampel secukupnya
6. Ninhidrin secukupnya
G. Alur Percobaan
Pembuatan Larutan Pengelusi (fase gerak)

25 ml n-butanol

1. Ditambahkan 6 ml asam asetat glasial sambil

dikocok
2. Ditambahkan 25 ml aquades sambil dikocok
3. Ditempatkan dalam chamber
Larutan pengelusi

Reaksi :
CH3CH2CH2CH2CH2OH (l) + CH3COOH (l) CH3COOCH2CH2CH2CH3 (aq) + H2O (l)
n-butanol asam asetat butil asetat

Menentukan Komponen Asam Amino

Plat KLT 4x5 cm

1. Digambarkan batas atas 0,5 cm; batas bawah 1 cm;

batas samping kiri dan kanan masing-masing 0,5
cm.
2. Diberi titik sampel dengan jarak antar sampel A, B,
C, dan D 1 cm dengan menggunakan pensil
3. Dioven pada suhu 105-110oC selama 1 menit.
4. Ditetesi 4 macam larutan (A, B, C, dan D)
berdampingan dengan pipa kapiler.
5. Besar noda maksimal diameter 0,4 cm.
6. Digantung dalam chamber untuk dijenuhkan dengan
uap eluen samai eluen mencapai batas atas.

Plat KLT yang telah dialiri eluen

7. Dikeluarkan
8. Dioven pada suhu 105-110oC selama 5 menit
9. Disemprot dengan inhidrin
10. Dioven kembali pada suhu 100-105oC selama 3
menit
11. Ditandai dengan pensil

Plat KLT dengan noda asam amino

12. Dicatat warnanya

13. Dihitung harga Rf pada tiap noda
14. Ditetapkan komponen asam amino dalam larutan
15. Dibandingkan harga Rf nya dengan Rf asam amino
standar
Komponen asam amino
Reaksi :
O
COOH
OH

+ H2N C H

OH R

O
O

N + RCHO + CO2 + 3H2O

O
H. Hasil Pengamatan
Hasil Pengamatan
No Prosedur Percobaan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
Pembuatan Larutan Pengemulsi  n-butanol : n-butanol +  n-butanol = semi polar Terdapat reaksi
larutan tidak asam asetat  asam asetat glasial = non esterifikasi dengan
25 ml n-butanol
berwarna glasial + polar produk dari reaksi
1. Ditambahkan 6 ml asam  asam asetat aquades =  aquades = polar tersebut adalah butil
asetat glasial sambil
dikocok glasial : larutan tidak  tingkat kepolaran : aquades asetat.
2. Ditambahkan 25 ml larutan tidak berwarna > n-butanol >asam asetat
aquades sambil dikocok
berwarna glasial
3. Ditempatkan dalam
chamber  aquades :  eluen = semipolar
Larutan pengelusi larutan tidak CH3CH2CH2CH2OH (l) +

berwarna CH3COOH (l)

CH3COOCH2CH2CH2CH3 (aq)

+ H2O (l)
 Hasil Pengamatan
No Prosedur Percobaan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
 larutan A  ditetesi
Plat KLT 4x5 cm
(alanin) : larutan A, B,
1. Digambarkan batas atas 0,5
cm; batas bawah 1 cm; batas larutan tidak C, D : noda
samping kiri dan kanan berwarna belum
masing-masing 0,5 cm.
 larutan B terlihat
2. Diberi titik sampel dengan
jarak antar sampel A, B, C, (glisin) :  digantung
dan D 1 cm dengan larutan tidak dalam
menggunakan pensil
3. Dioven pada suhu 105-110oC berwarna chamber :
selama 1 menit.  larutan C eluen naik ke
4. Ditetesi 4 macam larutan (A,
(tirosis) : batas atas
B, C, dan D) berdampingan
dengan pipa kapiler. larutan tidak 
5. Besar noda maksimal berwarna
diameter 0,4 cm.
6. Digantung dalam chamber  larutan D
untuk dijenuhkan dengan uap (sampel) :
eluen samai eluen mencapai
larutan tidak
batas atas.
berwarna
Plat KLT yang telah dialiri eluen
 Hasil Pengamatan
No Prosedur Percobaan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
 larutan  dioven : plat Berdasarkan teori (Harst, 2004) Sampel merupakan
Plat KLT yang telah dialiri eluen
ninhidrin: KLT kering Rf alanin = 0,38 asam amino glisin,
1. Dikeluarkan
2. Dioven pada suhu 105-110oC larutan tidak  disemprot Rf glisin = 0, 26 karena berdasarkan
selama 5 menit berwarna dengan Rf tirosin = 0,45 perhitungan Rf, Rf
3. Disemprot dengan inhidrin
ninhidrin di Reaksi ninhidrin dengan alanin sampel adalah 0,26 cm
4. Dioven kembali pada suhu
100-105oC selama 3 menit oven : sebagai berikut : yang artinya dekat
5. Ditandai dengan pensil muncul noda O
dengan nilai Rf yang
OH
Plat KLT dengan noda asam berwarna. dimiliki oleh asam
C (aq) +
amino
 noda A : OH amino glisin
1. Dicatat warnanya berdasarkan teori. Dan
merah O
2. Dihitung harga Rf pada tiap
H
noda  noda B : +
H3N C C O- (aq) nilai Rf larutan B sama
3. Ditetapkan komponen asam CH3 O dengan nilai Rf larutan
kuning
amino dalam larutan O O
 noda C : sampel D. Sehingga
4. Dibandingkan harga Rf nya
N
dengan Rf asam amino merah dapat disimpulkan
(aq) +
standar O O
bahwa sampel adalah
keunguan CH3-CHO(aq)+ CO2(g) + 3H2O(aq)+H+(aq)
Komponen asam amino asam amino glisin.
 Hasil Pengamatan
No Prosedur Percobaan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
 noda D : Reaksi ninhidrin dengan glisin
kuning sebagai berikut :
Rf = jarak yang O

ditempuh OH

sampel/jarak C (aq) +
OH
yang ditempuh
eluen O
H2
 Rf alanin (A) = H2 N C COOH (aq)

1 cm/3,5 cm =
O O
0,29 cm
 Rf glisin (B) = N

(aq) +
0,9 cm/3,5 cm O O

= 0,26 cm HCHO + CO2 + 3H2O

 Rf tirosin (C) reaksi ninhidrin dengan tirosin

= 1,7 cm/3,5 sebagai berikut :
cm = 0,48 cm
 Hasil Pengamatan
No Prosedur Percobaan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
 Rf sampel D = O

0,9 cm/3,5 cm OH

C (aq) +
= 0,26 cm
OH

+ H
H3N C C O- (aq)

H2C

OH

O O

O O (aq) +

HO CH2CHO (aq)+ CO2(g) + 3H2O(aq) + H+ (aq)

I. Analisis dan Pembahasan
Telah dilakukan praktikum dengan judul ”Penentuan Jenis Asam Amino
dalam Sampel” yang bertujuan untuk menentukan asam amino yang terdapat
dalam sampel menggunakan kromatografi lapis tipis. Kromatografi merupakan
cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen dalam campuran diantara dua fase, yaitu fase gerak dan
fase diam. Prinsip kerja dalam menggunakan kromatografi ini adalah
memisahkan campuran berdasarkan tingkat kepolarannya. Ada dua tahap
dalam melakukan praktikum ini yaitu pertama pembuatan larutan pengemulsi
(fasa gerak) dan kedua yaitu menentukan komponen asam amino.
Pembuatan larutan pengemulsi ini bertujuan untuk membuat pengemulsi
atau eluen yang nantinya berfungsi sebagai fasa gerak. Pemilihan eluen sangat
penting karena jika eluen yang digunakan memiliki konsentrasi yang tidak
sesuai dengan sampel yang akan dipisahkan, maka kromatografi dapat tidak
berjalan. Jika eluen terlalu polar akan menyebabkan seluruh noda yang
ditotolkan pada kertas naik sampai batas atas tanpa mengalami pemisahan, jika
eluen kurang polar maka noda yang ditotolkan tidak akan bergerak sama sekali.
Eluen ini dibuat dengan mencampurkan larutan yang memiliki tingkat
kepolarannya berbeda. Dalam praktikum ini menggunakan 25 ml larutan n-
butanol yang tidak berwarna dengan tingkat kepolarannya yaitu semipolar, 6
ml larutan asam asetat glasial tidak berwarna dengan tingkat kepolarannya
yaitu nonpolar, dan 25 ml aquades larutan tidak berwarna dengan tingkat
kepolarannya yaitu polar. Ketiga larutan ini dicampurkan hingga homogen
menjadi larutan tidak berwarna. Perbedaan kepolaran ini menjadi dasar dalam
pemisahan asam amino. Karena setiap asam amino memiliki kemampuan larut
pada pelarut dengan kepolarannya yang berbeda-beda. Penambahan larutan
asam asetat glasial ini bertujuan untuk mendistribusikan kedua pelarut air dan
n-butanol yang tidak saling bercampur ini bisa bercampur dalam volume
tertentu. Asam asetat glasial ini 99% asam asetat 1% nya air. Kemudian larutan
eluen dikocok dan dimasukkan ke dalam chamber. Lalu didiamkan selama 30
menit. Didiamkan 30 menit ini bertujuan untuk menjenuhkan larutan eluen
sehingga kromatografi dapat berjalan dengan baik. Penjenuhan ini ditandai
dengan bau menyengat dan menguap. Reaksi dalam pembuatan larutan
pengemulsi merupakan reaksi esterifikasi dengan hasil berupa butil asetat.
Reaksinya sebagai berikut:
CH3CH2CH2CH2CH2OH (l) +CH3COOH (l) CH3COOCH2CH2CH2CH3 (aq) + H2O (l)
n-butanol asam asetat butil asetat

Menentukan komponen asam amino yang bertujuan untuk mengidentifikasi

asam amino yang terdapat dalam sampel. Untuk mengidentifikasi sampel
tersebut digunakan larutan standar yang mengandung asam amino yaitu larutan
alanin tidak berwarna, larutan glisin tidak berwarna, dan larutan tirosin tidak
berwarna. Langkah pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan plat KLT
yang berukuran 4 x 5 cm yang berfungsi sebagai fase diam. Plat KLT ini berupa
plat dengan padatan putih yang terbuat dari silika gel dan aluminium.
Kemudian digambarkan batas atas 0,5 cm; batas bawah 1 cm; batas samping
kiri dan kanan 0,5 cm. Selanjutnya diberi titik sampel atau tanda totolan untuk
empat macam larutan dengan jarak antar sampel A, B, C, dan D sebesar 1 cm
menggunakan pensil. Pemberian tanda batas pada plat KLT menggunakan
pensil ini bertujuan agar ketika eluen melewati plat garis yang dibuat, tidak
tertarik oleh eluen. Berbeda dengan bolpoin yang berbahan dasar tinta, dapat
tertarik oleh eluen. Larutan sampel A yaitu larutan standar alanin yang tidak
berwarna. larutan sampel B yaitu larutan standar glisin tidak berwarna. Larutan
sampel C yaitu larutan standar tirosin tidak berwarna. dan larutan D merupakan
larutan sampel yang ingin diidentifikasi asam amino yang terkandung
didalamnya. Setelah selesai pemberian tanda, plat KLT dioven selama  1
menit pada suhu 105-110oC. Tujuan pengovenan ini untuk menghilangkan
molekul air dan juga membuka pori-pori KLT. Kemudian ditetesi 4 macam
larutan berdampingan dengan pipa kapiler. Penggunakan pipa kapiler ini
bertujuan untuk menghasilkan diameter totol kecil. Lalu dikeringkan dengan
cara diangin-anginkan supaya kering sebelum tetesan berikutnya diletakkan di
atasnya dengan besar noda maksimal berdiameter 0,4 cm. Pentotolan berulang
ini bertujuan supaya noda totolannya tampak lebih jelas. Selanjutnya digantung
dalam chamber yang telah jenuh dengan uap eluen dan ditutup dengan kaca
kembali dan tunggu sampai eluen bergerak mencapai batas atas. Saat larutan
bergerak ke atas, asam-asam amino dalam eluen akan mengakibatkan
kecepatan pergerakan asam-asam amino ini berbeda pada plat KLT.
Selanjutnya Plat KLT yang telah dialiri eluen tersebut dikeluarkan kemudian
dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105-110oC selama 5 menit. Pengovenan
ini bertujuan untuk menghilangkan eluen yang ada di dalam plat KLT. Setelah
dikeringkan kemudian di semprot menggunakan larutan ninhidrin sehingga
muncul noda berwarna. Penyemprotan ini bertujuan untuk mengetahui
distribusi asam amino karena asam amino tidak berwarna akan berubah
menjadi berwarna ketika disemprotkan dengan ninhidrin. Reaksi yang terjadi
antara ninhidrin dengan alanin sebagai berikut:
O

OH
+ H
C (aq) + H3N C C O- (aq)

OH
CH3 O

O O

N CH3-CHO(aq)+ CO2(g) + 3H2O(aq)+H+(aq)

O O (aq) +

Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dengan glisin sebagai berikut:

O

OH
H2
C (aq) + H2N C COOH
(aq)
OH

O O

N HCHO + CO2 + 3H2O

O O (aq) +

Reaksi yang terjadi antara ninhidrin dengan tirosin sebagai berikut:

 O

O
OH
+ H
C (aq) + H3N C C O- (aq)

OH
H2C

OH
O O

N HO CH2CHO (aq)+ CO2(g) + 3H2O(aq) + H+ (aq)

O O (aq) +

Lalu selanjutnya plat KLT di oven kembali untuk ketiga kalinya dengan
suhu 100-105oC selama 3 menit. Tujuan pengovenan ini untuk mempercepat
reaksi antara ninhidrin sebagai oksidator sehingga asam amino teroksidasi pada
kondisi panas sehingga memunculkan noda berwarna di plat KLT. Pada noda
A berwarna merah, noda B berwarna kuning, noda C berwarna merah
keunguan, dan noda D berwarna kuning. Noda-noda yang timbul ini kemudian
ditandai dengan pensil pada plat KLT. Kemudian dihitung harga Rf (Retensi
Faktor) di tiap-tiap titik menggunakan rumus sebagai berikut.
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑐𝑚)
𝑅𝑓 =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑒𝑙𝑢𝑒𝑛 (𝑐𝑚)
Prinsip dasar pemisahan dengan kromatografi lapis tipis adalah perbedaan
pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen
(berupa molekul) yang berada pada larutan. Saat larutan bergerak ke atas pada
kertas kromatografi secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam
amino antara fase gerak dan fase diam yang teradsorbsi pada aluminium
berlangsung berulang-ulang. Saat larutan bergerak ke atas, asam amino akan
terbawa oleh pergerakan eluen. Perbedaan kelarutan asam-asam amino dalam
eluen akan mengakibatkan kecepatan pergerakan asam-asam amino yang
berbeda pada kertas kromatografi tersebut. Asam amino yang lebih larut dalam
eluen akan bergerak lebih cepat karena hanya tertahan kecil dalam fasa
diamnya. Sedangkan asam amino yang lebih susah larut dalam eluen akan lebih
lama tertahan pada fase diamnya, sehingga laju geraknya lebih lambat. Dengan
adanya perbedaan pergerakan ini, asam amino-asam amino dapat dipisahkan.
 Diketahui jarak yang ditempuh oleh eluen adalah sebesar 3,5 cm. Maka
didapatkan jarak noda pada setiap titik yaitu 1 cm; 0.9 cm; 1.7 cm; dan 0.9 cm.
Setelah dihitung di dapatkan hasil harga Rf ditiap titik berturut-turut untuk
alanin, glisin, tirosin, dan sampel adalah 0.29 cm; 0.26 cm; 0.48 cm; 0.26 cm.
Sehingga dapat disimpulkan dari noda warna yang muncul dan harga Rf yang
ditemukan bahwasannya larutan sampel merupakan larutan yang mengandung
jenis asam amino glisin di dalamnya.
J. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa larutan
sampel merupakan asam amino glisin ditandai dengan noda warna yang sama
yaitu kuning dan harga Rf yang sama pula yaitu 0,26 cm.
K. Daftar Pustaka
Fatchiyah. (2011). Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta:
Erlangga.
Gandjar, I. G., & Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka Belajar.
Girindra, A. (1990). Biokimia I. Jakarta: PT. Gramedia.
Lehninger, Albert L. 1993. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Terjemahan.
Jakarta: Erlangga
Page, D. S. (1997). Prinsip-prinsip Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Poedjiadi, A. (1994). Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia
Press.
Soebagio. (2003). Kimia Analitik II Common Textbook. Jakarta: UI Press.
Tim Biokimia. 2019. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Universitas
Negeri Surabaya-FMIPA-Jurusan Kimia
L. Jawaban Pertanyaan
1. Apakah keuntungan dan kerugian dalam metode pemisahan dengan
kromatografi kertas?
Jawaban :
Keuntungan :
 a) Pada kromatografi kertas peralatan yang dipakai tidak perlu
alat-alat yang teliti. Hasil-hasil yang baik dapat diperoleh
dengan peralatan dan materi-materi yang sangat sederhana.
b) Senyawa-senyawa yang terpisahkan dapat dideeksi pada kertas
dan dapat segera diidentifikasikan.
c) Harganya lebih murah jika dibandingkan dengan KLT.
d) Kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih
besar daripada untuk analisis, keuntungannya yaitu beban
langan bilangan Rf menjadi besar sehingga pengukuran Rf
merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan
senyawa baru.
Kerugian :
a) Tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada komponen-
komponen sampel, hanya terbatas pada analisis kualitatif saja.
b) Waktunya lebih lama dari pada adsorben lain tapi lebih singkat
dari pada KLT.
c) Tidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan
terdekomposisi.
2. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif?
Jawaban :
Metode kromatografi kertas dapat digunakan baik untuk melakukan
analisis yang bersifat kualitatif maupun kuantitatif. Analisis kualitatif
dilakukan dengan mengidentifikasi komponen asam amino dari sampel
terhadap suatu larutan asam amino yang telah diketahui sebelumnya
berdasarkan nilai Rf, pada percobaan ini ditandai dengan adanya warna
ungu serta dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu dibandingkan
dengan harga Rf standarnya. Sedangkan analisis kuantitatif dilakukan
berdasarkan Rf dari zat sampel dengan harga Rf zat standar. Agar
analisis kuantitatif dapat berhasil baik perlu diperhatikan hal-hal
berikut :
 a) Kondisi percobaan harus sama, karena harga Rf tergantung pada
kondisi tersebut.
b) Adanya noda pada kromatografi belum berarti adanya zat
tunggal dalam sampel.
c) Harus dicoba dengan berbagai pelarut.
3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
Jawaban :
1) Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka
perubahan – perubahan yang sangat kecil dalam komposisi
pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
2) Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga
kecepatan aliran.
3) Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi
homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan
penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika
bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama
seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka
koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan
dan komposisi mempengaruhi harga Rf.
4) Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari
perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam
kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga
mempengaruhi kesetimbangan partisi.
5) Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi
diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan
bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik
dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf
mereka.
6) Kualitas adsorben
7) Ketebalan lapisan, semakin tebal lapisan Rf nya semakin kecil
8) Kejenuhan ruang kromatografi.
M. Lampiran Foto
No Gambar Keterangan

Persiapan
1
KLT

KLT di
2
oven

KLT setelah
3
di oven

Larutan
asam amino
alanin,
4
glisin,
tirosin, dan
sampel.
No Gambar Keterangan

KLT di
totol larutan
5 A atau
larutan
alanin

KLT di
6 totol larutan
glisin

KLT di
7 totol larutan
sampel

Kertas KLT
dimasukkan
ke dalam
8
Chamber
yang berisi
eluen.
No Gambar Keterangan

Kertas KLT
dikeluarkan
9
dari
chamber

Kertas KLT
dimasukkan
kembali ke
10
dalam oven
selama 5
menit.

Kertas KLT
dikeluarkan
11 dari oven
yang kedua
kalinya.

Kertas KLT
disemprot
12 dengan
larutan
ninhidrin
 No Gambar Keterangan

Hasil Plat
KLT
13 dengan
noda asam
amino

N. Lampiran Perhitungan
Perhitungan Asam Amino
Jarak (cm) dari garis awal ke pusat zona
𝑅𝑓=
jarak (cm)dari garis awal kegaris depan pelarut

1𝑐𝑚
Rf Alanin (A)= 3,5𝑐𝑚 = 0,29

0.9𝑐𝑚
Rf Glisin (B)= 3,5𝑐𝑚 = 0,26

1,7𝑐𝑚
Rf Tirosin (C)= 3,5𝑐𝑚 = 0,48

0,9𝑐𝑚
Rf sampel D= 3,5𝑐𝑚 = 0,26

O. Lampiran Tulis Tangan

Type your text